夏啟玉，賀萍萍，張麗麗，張雨良，肖蘇生，趙 輝,3*

高粱高效啟動子的克隆及活性鑒定

夏啟玉1,2，賀萍萍1,2，張麗麗1,2，張雨良1,2，肖蘇生1,2，趙 輝1,2,3*

1. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院三亞研究院，海南三亞 572024；2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶作物生物學(xué)與遺傳資源利用重點實驗室/海南省南繁生物安全與分子育種重點實驗室，海南海口 571101；3. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院海南熱帶農(nóng)業(yè)資源研究院，海南?？?571101

在轉(zhuǎn)基因植物的研究中，啟動子是影響轉(zhuǎn)基因表達效率的重要因素之一。植物泛素（ubiquitin）基因啟動子以啟動效率高、甲基化程度相對較低、遺傳性狀穩(wěn)定等特點成為單子葉植物中應(yīng)用較為廣泛的啟動子。其中，玉米的是最常使用的啟動子之一。本研究旨在克隆高粱高效啟動子，為高粱及其他單子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化研究提供新的組成型啟動子選擇。本研究從NCBI數(shù)據(jù)庫中查找到多個基因，下載其起始密碼子上游3000 bp的序列。根據(jù)啟動子的特點，選擇含有5′ UTR內(nèi)含子且大小合適的序列，并通過在線啟動子預(yù)測網(wǎng)站進行啟動子分析，最后選擇2個基因（LOC8076096、LOC8063786）進行啟動子克隆，將其啟動子序列分別命名為和。將這2個啟動子片段PCR擴增后，連入含有GUS報告基因的植物表達載體Ubi-GUS，得到重組表達載體U1-GUS和U5-GUS。重組載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻和狗尾草，PCR篩選陽性轉(zhuǎn)化苗，對陽性轉(zhuǎn)化苗進行GUS染色分析，鑒定和的啟動子活性。GUS染色觀察發(fā)現(xiàn)，所有以和為啟動子的水稻和狗尾草陽性轉(zhuǎn)化苗的根、莖和葉均呈現(xiàn)較深的藍色，比以玉米為啟動子的陽性轉(zhuǎn)化苗的藍色略深，且以為啟動子的陽性轉(zhuǎn)化苗比以為啟動子的藍色更深，而非轉(zhuǎn)基因的水稻和狗尾草小苗則完全染不上藍色。因此，啟動子和在水稻和狗尾草中均具有組成型強啟動子的活性，可作為新的組成型啟動子應(yīng)用于高粱、水稻、狗尾草及其他單子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化研究。

高粱；泛素基因；啟動子；克?。换钚澡b定

高粱[(L.) Moench]是中國主要雜糧作物之一，是糧食、飼料和釀酒業(yè)原料的重要來源?，F(xiàn)代基因工程技術(shù)的發(fā)展，為高粱新品種的獲得提供了一種快速有效的途徑。與水稻、玉米、大豆等其他作物相比，高粱的遺傳轉(zhuǎn)化研究發(fā)展比較緩慢。高粱是禾本科中最難進行組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化的物種之一，其遺傳轉(zhuǎn)化效率受基因型的影響較大，成功獲得的轉(zhuǎn)基因高粱品種不多，且轉(zhuǎn)化率仍較低[1-3]。

在轉(zhuǎn)基因植物的研究中，啟動子是影響轉(zhuǎn)基因表達效率的重要因素之一，因此選擇高效率的啟動子是高效率表達外源基因的關(guān)鍵。啟動子是一段位于結(jié)構(gòu)基因5端上游區(qū)的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之與模板DNA準確地相結(jié)合并具有轉(zhuǎn)錄起始的特異性，控制基因表達（轉(zhuǎn)錄）的起始時間和表達程度，是基因表達調(diào)控的重要元件。根據(jù)啟動子的轉(zhuǎn)錄模式可將其分為3類：組成型啟動子、誘導(dǎo)型啟動子和組織特異型啟動子。組成型啟動子的調(diào)控不受外界條件的影響，不同組織器官和發(fā)育階段的基因表達沒有明顯差異，所啟動基因的表達具有持續(xù)性，不表現(xiàn)時空特異性。目前廣泛應(yīng)用的植物組成型啟動子有來自花椰菜花葉病毒的35S啟動子、泛素（ubiquitin）基因啟動子、肌動蛋白（actin）基因啟動子等。35S啟動子常應(yīng)用于雙子葉植物中，啟動子和啟動子常應(yīng)用于單子葉植物中。目前，在單子葉植物中應(yīng)用較廣的啟動子為玉米啟動子和水稻啟動子。大部分基因的起始轉(zhuǎn)錄區(qū)上游都有一段5′ UTR內(nèi)含子，研究表明啟動子在植物中的高效表達與其5′ UTR的內(nèi)含子調(diào)控有一定關(guān)系。啟動子以啟動效率高、甲基化程度相對較低、遺傳性狀穩(wěn)定等特點成為目前研究較多的啟動子之一[4]。

為獲得來源于高粱的高效啟動子，本研究從NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索高粱的基因，選擇2個高粱基因進行啟動子克隆，構(gòu)建了這2個啟動子分別表達GUS報告基因的重組表達載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化單子葉植物中的C3模式植物水稻和C4模式植物狗尾草，對獲得的陽性轉(zhuǎn)化苗進行GUS染色分析，鑒定它們的啟動子活性，為高粱及其他單子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化研究提供新的組成型啟動子選擇。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 以高粱‘Hiro-1’品種為實驗材料，種植后取葉片提取基因組DNA?！瓾iro-1’品種的種子由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)才宏偉教授饋贈。水稻轉(zhuǎn)化品種為‘日本晴’，由本實驗室保存；狗尾草轉(zhuǎn)化品種為‘ME34’，由美國Donald Danforth Plant Science Center的Brutnell實驗室提供，本實驗室繁殖后保存。

1.1.2 質(zhì)粒及菌株 Ubi-GUS質(zhì)粒由美國Donald Danforth Plant Science Center的Brutnell實驗室提供；大腸桿菌DH5α感受態(tài)和農(nóng)桿菌AGL1感受態(tài)分別購自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司和上海唯地生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 試劑 植物基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒和通用型DNA回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；PrimeSTAR Max DNA聚合酶購自寶生物工程（大連）有限公司；限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；酶MIX購自北京康為世紀生物科技有限公司；MS購自Duchefa Biochemie公司；Gelzan植物凝膠購自Caisson Labs公司；潮霉素購自Gold Biotechnology公司；X-Gluc購自Sigma-Aldrich公司；蛋白胨和酵母粉購自O(shè)XOID公司；瓊脂糖購自Biowest Agarose公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 啟動子克隆 從NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索高粱基因，共找到17個高粱基因，單體數(shù)量介于1～6個之間，其中含6個單體的有3個，含5個單體的有2個，選擇了與玉米啟動子啟動的基因同源性較高的基因進行下一步分析。找出其起始密碼子ATG上游的3000 bp以內(nèi)的核苷酸序列，利用在線預(yù)測軟件Softberry中的TSSP對其進行啟動子預(yù)測分析，根據(jù)啟動子預(yù)測結(jié)果及與玉米啟動子結(jié)構(gòu)比對分析，選擇2個與玉米啟動子結(jié)構(gòu)相似且預(yù)測含有啟動子元件的基因LOC8076096和LOC8063786進行啟動子克隆，并將其啟動子序列分別命名為和。在和基因起始密碼子上游3000 bp內(nèi)設(shè)計克隆引物，使啟動子核苷酸序列長度略大于2000 bp。上游引物的5端加上限制性內(nèi)切酶Ⅰ的識別序列和保護堿基，下游引物的5加限制性內(nèi)切酶I的識別序列和保護堿基，引物序列見表1。使用植物基因組DNA提取試劑盒提取高粱Hiro-1葉片的基因組DNA，以其為模板，利用高保真PrimeSTAR酶進行PCR擴增。PCR體系為：無菌水9.5 μL，引物（10 μmol/L）各1 μL，Primestar Mix 12.5 μL，DNA模板1 μL。啟動子的PCR擴增程序為：95℃預(yù)變性5 min；98℃變性10 s，56℃退火15 s，72℃延伸15 s，進行40個循環(huán)；最后72℃延伸7 min。啟動子的PCR擴增程序為：95℃預(yù)變性5 min；98℃變性10 s，52℃退火15 s，72℃延伸15 s，進行38個循環(huán)；最后72℃延伸7 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳分離，純化回收后，送測序公司進行全序列測序。引物合成及測序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

表1 啟動子U1和U5的引物序列

注：下劃線的序列為限制性內(nèi)切酶識別序列。

Note: The underlined sequence is the restriction endonuclease recognition sequence.

1.2.2 植物重組表達載體的構(gòu)建 選擇植物表達載體Ubi-GUS為骨架載體進行載體改造，該載體的β-葡萄糖苷酸酶（GUS）報告基因的啟動子為玉米啟動子，選擇Ⅰ和Ⅰ2個酶切位點，雙酶切將該載體GUS基因上游的玉米啟動子切除，分別連入啟動子和，構(gòu)建由和啟動GUS基因的植物重組表達載體U1-GUS和U5-GUS（圖1），可通過報告基因GUS的表達鑒定目的啟動子的活性。具體構(gòu)建過程為：回收和的PCR產(chǎn)物，用Ⅰ和Ⅰ雙酶切，回收酶切產(chǎn)物；載體Ubi-GUS用相同的酶進行雙酶切，膠回收載體大片段。將2個回收片段用T4 DNA連接酶16℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，于37℃在含卡那霉素的LB平板中培養(yǎng)過夜。次日挑取單克隆于37℃振蕩培養(yǎng)過夜，采用和啟動子的引物進行菌液PCR檢測，篩選陽性克隆。菌液PCR反應(yīng)體系為：無菌水9.5 μL，引物（10 μmol/L）各1 μL，Mix 12.5 μL，菌液模板1 μL。的PCR擴增程序為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，進行35個循環(huán)；72℃延伸7 min。的PCR擴增程序為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，進行35個循環(huán)；72℃延伸7 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳分離檢測。根據(jù)菌液PCR檢測的結(jié)果，分別選擇陽性克隆送測序公司進行序列測定，保存測序正確的陽性克隆，提取質(zhì)粒。將重組表達載體用液氮凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌AGL1，獲得的菌株用甘油保存于?80℃?zhèn)溆谩?/p>

圖1 重組表達載體的構(gòu)建

1.2.3 重組表達載體轉(zhuǎn)化水稻和狗尾草 以水稻品種‘日本晴’和狗尾草品種‘ME34’的成熟種子為外植體，誘導(dǎo)胚性愈傷。將分別攜帶重組載體U1-GUS和U5-GUS的AGL1菌株各自侵染水稻和狗尾草的胚性愈傷，以攜帶對照載體Ubi-GUS的AGL1菌株為對照（CK），共培養(yǎng)5～7 d，潮霉素篩選獲得抗性愈傷，抗性愈傷分化成苗，生根后移栽至育苗盆中，水稻轉(zhuǎn)化苗在溫室培養(yǎng)，狗尾草轉(zhuǎn)化苗在植物人工氣候箱培養(yǎng)。水稻的遺傳轉(zhuǎn)化參照TOKI等[5]的方法進行，狗尾草的遺傳轉(zhuǎn)化參照趙輝等[6]的方法進行。

1.2.4 陽性轉(zhuǎn)化苗的PCR篩選 待轉(zhuǎn)化苗存活后，采集轉(zhuǎn)化苗的葉片，提取基因組DNA，首先進行潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（）基因和基因的PCR檢測。水稻以‘日本晴’基因組DNA為陰性對照（CK?），狗尾草以‘ME34’基因組DNA為陰性對照（CK?，以U1-GUS和U5-GUS質(zhì)粒為陽性對照（CK+），以無菌水為空白對照（CK）?；虻臋z測引物來自農(nóng)業(yè)部1782號公告-2-2012（轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測標記基因和定性PCR方法），基因的檢測引物來自農(nóng)業(yè)部2122號公告-3-2014（轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測報告基因定性PCR方法）。引物序列見表2。PCR檢測反應(yīng)體系為：無菌水9.5 μL，引物（10 μmoL/L）各1 μL，Mix 12.5 μL，DNA模板1 μL。PCR擴增程序為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，進行35個循環(huán)；最后72℃延伸7 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。另外，以上述DNA為模板，用啟動子和的引物進行PCR檢測轉(zhuǎn)化苗中的啟動子和。PCR反應(yīng)體系為：無菌水9.5 μL，引物（10 μmoL/L）各1 μL，Primestar Mix 12.5 μL，DNA模板1 μL。的PCR擴增程序為：95℃預(yù)變性5 min；98℃變性10 s，56℃退火15 s，72℃延伸15 s，進行40個循環(huán)；最后72℃延伸7 min。的PCR擴增程序為：95℃預(yù)變性5 min；98℃變性10 S，52℃退火15 s，72℃延伸15 s，進行38個循環(huán)；最后72℃延伸7 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。根據(jù)基因、基因和啟動子和的PCR檢測結(jié)果篩選出水稻和狗尾草的陽性轉(zhuǎn)化苗。

表2 HPT和GUS的檢測引物

1.2.5 U1-GUS和U5-GUS轉(zhuǎn)化苗的GUS活性分析 按常規(guī)方法配制GUS染色液的基液和母液，臨用前按比例混合。取水稻和狗尾草的陽性轉(zhuǎn)化苗用水洗凈泥土后，裝入50 mL離心管中，加入GUS染色液，37℃暗室下染色24 h。染色完成后，倒掉GUS染色液，先用75%乙醇脫色3～5次，再用95%乙醇脫色1～2次，觀察陽性轉(zhuǎn)化苗的染色情況。以非轉(zhuǎn)基因‘日本晴’和‘ME34’小苗為陰性對照，以轉(zhuǎn)入Ubi-GUS的‘日本晴’和‘ME34’小苗為陽性對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 啟動子克隆

啟動子和的PCR擴增均得到大小約為2300 bp的條帶（圖2），將PCR產(chǎn)物送測序公司測序，測序結(jié)果表明，啟動子的實際大小為2361 bp，啟動子的實際大小為2307 bp，均與預(yù)期的大小有差別。啟動子和的核苷酸序列見圖3。

M: DL2000 DNA marker.

2.2 植物重組表達載體的構(gòu)建

和的PCR產(chǎn)物經(jīng)雙酶切回收，與Ubi-GUS的雙酶切回收產(chǎn)物分別進行連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后，從轉(zhuǎn)化板上挑選單克隆，以和啟動子的引物進行菌液PCR（水為空白對照，CK），結(jié)果表明，U1-GUS挑選的8個克隆和U5-GUS的7個克隆均能擴增出大于2000 bp的條帶（圖4），證明目的啟動子和片段均已成功連入Ubi-GUS載體中。各挑選3個陽性克隆送測序公司進行全序列測定，測序結(jié)果與PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果進行比對分析，挑選出測序序列與PCR產(chǎn)物測序序列完全一致的陽性克隆。分別將攜帶重組表達載體U1-GUS和U5-GUS的陽性克隆命名為U1-GUS/DH5α和U5-GUS/DH5α。提取U1-GUS和U5-GUS質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌AGL1，獲得的農(nóng)桿菌菌株命名為U1-GUS/AGL1和U5-GUS/AGL1。

2.3 水稻和狗尾草轉(zhuǎn)化苗的獲得及PCR鑒定

為了驗證啟動子和啟動基因表達的能力，將攜帶重組載體U1-GUS和U5-GUS的AGL1以及攜帶對照載體Ubi-GUS的AGL1分別轉(zhuǎn)化水稻和狗尾草，篩選和分化獲得轉(zhuǎn)化苗。將U1-GUS/ AGL1、U5-GUS/AGL1和對照菌株Ubi-GUS/ AGL1（陽性對照，CK+）轉(zhuǎn)化‘日本晴’（NIP）獲得的轉(zhuǎn)化苗命名為NIP-U1、NIP-U5和NIP- Ubi；將U1-GUS/AGL1、U5-GUS/AGL1和對照菌株Ubi-GUS/AGL1（陽性對照，CK+）轉(zhuǎn)化狗尾草‘ME34’獲得的轉(zhuǎn)化苗命名為ME34-U1、ME34-U5和ME34-Ubi。

圖3 啟動子U1（A）和U5（B）的核苷酸序列

A: U1-GUS; B: U5-GUS; M: DL2000 DNA marker.

NIP-U1和NIP-U5各挑選5棵轉(zhuǎn)化苗，ME34-U1和ME34-U5各挑選8棵轉(zhuǎn)化苗，利用、和（）引物的PCR來篩選陽性轉(zhuǎn)化苗，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示NIP-U1、NIP-U5、ME34-U1和ME34-U5轉(zhuǎn)化苗均能擴增出和基因，NIP-U1和ME34-U1轉(zhuǎn)化苗均能擴增出啟動子，NIP-U5和ME34-U5轉(zhuǎn)化苗均能擴增出啟動子，而非轉(zhuǎn)基因?qū)φ眨幮詫φ?，CK?）和水對照（空白對照，CK）則不能擴增出這些基因和啟動子片段（圖5和圖6），說明挑選的這些轉(zhuǎn)化苗均為陽性轉(zhuǎn)基因苗，均已成功地導(dǎo)入了目的載體。

M: DL2000 DNA marker.

M: DL2000 DNA marker.

2.4 U1和U5的啟動子活性鑒定

將陽性轉(zhuǎn)化苗進行GUS染色觀察分析，結(jié)果表明，所有的NIP-U1、NIP-U5、ME34-U1和ME34-U5的陽性轉(zhuǎn)化苗的根、莖和葉均呈現(xiàn)較深的藍色，比陽性對照NIP-Ubi和ME34-Ubi轉(zhuǎn)化苗的藍色略深，且NIP-U5和ME34-U5的陽性轉(zhuǎn)化苗的藍色較NIP-U1和ME34-U1更深，而陰性對照非轉(zhuǎn)基因‘日本晴’小苗和‘ME34’小苗則完全染不上藍色（圖7）。表明啟動子和在水稻和狗尾草中均能組成型啟動GUS基因的表達，且具有強的啟動子活性，因此啟動子和可作為新的組成型啟動子應(yīng)用于高粱、水稻、狗尾草及其他單子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化研究。

3 討論

植物啟動子是目前單子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化中應(yīng)用最為廣泛的啟動子之一，其中應(yīng)用較多的是玉米啟動子和水稻啟動子。1992年，CHRISTENSEN等[7]從玉米中分離到2個泛素基因（和），這2個基因都在5′非翻譯區(qū)包含1個內(nèi)含子，并分別構(gòu)建了以玉米的5′側(cè)翼區(qū)及5′內(nèi)含子作為啟動子和以35S作為啟動子表達氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT）基因的重組載體pUBI-CAT和p35S-CAT。玉米原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化實驗表明，pUBI-CAT比p35S-CAT表達的CAT活性高出10倍以上。此后，研究人員在小麥[8]、水稻[9-11]和花生[12]等植物中證實了玉米的強啟動子活性。2000年，WANG等[13]分離了2個水稻泛素基因和，構(gòu)建了其5′上游區(qū)和GUS編碼區(qū)的表達框，通過基因槍法導(dǎo)入水稻懸浮細胞中，GUS活性測定結(jié)果表明，和啟動子比35S啟動子表達的GUS活性高10～15倍，比玉米啟動子表達的GUS活性也高2～3倍。隨后，的強啟動子活性在甘蔗中也得到了驗證。LIU等[14]將啟動子與GUS報告基因連接，通過基因槍法獲得了穩(wěn)定的甘蔗轉(zhuǎn)化植株，以為啟動子比以為啟動子的轉(zhuǎn)基因植株中的GUS表達水平提高了1.6倍，而以35S為啟動子的轉(zhuǎn)基因植株中則未檢測到GUS的表達。除玉米和水稻的啟動子以外，還有多種植物如大豆[15]、煙草[16]、馬鈴薯[17]、向日葵[18]、番茄[19]、柳枝稷[20]的啟動子已被成功克隆并應(yīng)用。

圖7 NIP-U1、NIP-U5、ME34-U1和ME34-U5轉(zhuǎn)化苗的GUS染色

在植物的轉(zhuǎn)基因技術(shù)中，除了目的外源基因，通常還需要篩選標記等其他外源基因，而每個基因一般需要獨立的啟動子，因此需要使用多個啟動子，但是重復(fù)使用同一啟動子驅(qū)動多個基因表達可能導(dǎo)致基于同源性的基因沉默。此外，使用植物自身的或者接近物種的啟動子可能會有更高地啟動外源基因表達的效率。因此，有必要克隆更多的能在植物中高效啟動基因轉(zhuǎn)錄的啟動子，為轉(zhuǎn)基因植物的生物技術(shù)育種的發(fā)展提供更多的啟動子選擇。

本研究中轉(zhuǎn)化苗的GUS染色結(jié)果表明，以和為啟動子的陽性轉(zhuǎn)化苗的根、莖和葉都能染上深藍色，比以玉米為啟動子的陽性轉(zhuǎn)化苗的藍色略深，且以為啟動子比以為啟動子的陽性轉(zhuǎn)化苗的藍色更深，這說明高粱的不同啟動子的活性有差異，比的啟動子活性強。一般來說，生物的親緣關(guān)系越近，其啟動子通用的可能性越大[21]。高粱、水稻和狗尾草同屬禾本科植物，其中高粱和狗尾草還同屬黍亞科，親緣關(guān)系較近，啟動子的活性可能也相似。已有研究表明，黍亞科的玉米啟動子在水稻[9-11]、高粱[22-23]和狗尾草[24]等禾本科科植物中均具有強的啟動子活性。因此，本研究中在水稻和狗尾草中具有強啟動活性的和啟動子，在高粱中很可能也具有強的啟動活性。

本研究雖然已經(jīng)驗證了和啟動子的活性，但下一步還需要將和啟動子的核苷酸序列進行分段截短實驗，找出它們各自的核心啟動子序列，進一步鑒定它們的啟動子活性。本研究克隆的啟動子和可以為高粱及其他單子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化提供新的組成型啟動子選擇。

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Cloning and Activity Identification of High EfficiencyPromoters from Sorghum

XIA Qiyu1,2, HE Pingping1,2, ZHANG Lili1,2, ZHANG Yuliang1,2, XIAO Susheng1,2, ZHAO Hui1,2,3*

1. Sanya Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Sanya, Hainan 572024, China; 2. Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops, Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Hainan Key Laboratory for Biosafety Monitoring and Molecular Breeding in Off-Season Reproduction Regions, Haikou, Hainan 571101, China; 3. Hainan Institute for Tropical Agricultural Resources, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou, Hainan 571101, China

In the research of transgenic plants, promoter is one of the important factors affecting the efficiency of transgenic expression. Plant ubiquitin gene promoters have been widely used in monocotyledons because of its high starting efficiency, relatively low methylation degree and stable genetic traits. Among them, thepromoter of maize is one of the most commonly usedpromoters. The purpose of this study is to obtain high-efficiency ubiquitin promoters of sorghum and provide a new constitutive promoter selection for the genetic transformation of sorghum and other monocotyledonous plants. In this study, multiple polyubiquitin genes were found from NCBI database, and the sequence of 3000 bp upstream of its starting codon was downloaded. According to the characteristics ofpromoter, the sequence with 5′ UTR intron and appropriate size was selected, and the promoter was analyzed through the online promoter prediction website. Finally, two genes LOC8076096 and LOC8063786 were selected for promoter cloning, and their promoter sequences were namedandrespectively. After PCR amplification, the two promoter fragments were connected to the plant expression vector Ubi-GUS containing Gus reporter gene to obtain recombinant expression vectors U1-GUS and U5-GUS. The recombinant vector was transformed into rice and green bristlegrass by themediated method. The positive transformed seedlings were screened by PCR. GUS staining analysis was carried out on the positive transformed seedlings to identify the promoter activities ofand. GUS staining showed that the roots, stems and leaves of all positive transformed seedlings of rice and green bristlegrass withandas promoters showed darker blue, which was slightly darker than that of positive transformed seedlings with maizeas promoter, and the blue of positive transformed seedlings withas promoter was deeper than that ofas promoter, while non-transgenic rice and green bristlegrass seedlings could not be stained with blue at all. Therefore, the promotersandhave the activity of constitutive strong promoters in rice and green bristlegrass, and can be used as new constitutive promoters to study the genetic transformation of sorghum, rice, green bristlegrass and other monocotyledonous plants.

sorghum;gene; promoter; clone; activity identification

Q781

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.12.006

2022-04-23；

2022-05-18

海南省院士創(chuàng)新平臺科研項目資金（No. YSPTZX202102）；海南省朱健康院士工作站資金資助；海南省自然科學(xué)基金青年基金項目（No. 322QN388）。

夏啟玉（1983—），女，碩士，助理研究員，研究方向：轉(zhuǎn)基因生物安全與南繁育種。*通信作者（Corresponding author）：趙 輝（ZHAO Hui），E-mail：zhaohui@itbb.org.cn。