官 鑫，涂 敏，蔡海濱，王云月，胡彥師，曾 霞

巴西橡膠樹基因克隆與表達分析

官 鑫1,2，涂 敏2*，蔡海濱1,2，王云月1*，胡彥師2，曾 霞2

1. 云南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，云南昆明 650201；2. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院橡膠研究所，海南?？?571101

（resistance to powdery mildew locus 8）是對植物多種病害，尤其白粉病具有抗性的廣譜抗病基因位點，通過對橡膠樹基因進行克隆及表達分析，為橡膠樹抗白粉病機制解析和分子育種等方面打下基礎。以橡膠樹‘熱研73397’為材料，采用RT-PCR克隆基因編碼區(qū)（CDS）序列；對其進行生物信息學分析，并利用qRT-PCR方法，測定7種激素和白粉菌侵染不同時間、不同病害等級處理后基因表達量。該基因cDNA全長570 bp，編碼189個氨基酸，該蛋白的分子量為21.73 kDa，等電點為9.23，脂肪系數(shù)為86.30，總平均親水性指數(shù)為–0.404，為親水性蛋白，共有8個磷酸化位點，無跨膜域和信號肽，定位于細胞核，具有RPW8的保守結(jié)構(gòu)域，α-螺旋和無規(guī)則卷曲是HbRPW8蛋白二級結(jié)構(gòu)的主要元件，分別占氨基酸序列的70.90%和22.22%。親緣關(guān)系顯示，基因與木薯基因相似性最高。過氧化氫（H2O2）、水楊酸（SA）、乙烯利（ETH）、赤霉素（GA）和脫落酸（ABA）能迅速誘導轉(zhuǎn)錄本的表達，并在處理后0.5 h達到最高水平，分別約為對照的14倍、6倍、75倍、2.5倍和4倍；茉莉酸甲酯（MeJA）處理后6 h達到最高水平，是對照的10倍左右；生長素處理后轉(zhuǎn)錄本顯著下調(diào)；隨著白粉菌侵染時間和病害等級的增加，的表達量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。研究結(jié)果初步表明，可能參與橡膠樹的抗病反應機制，為橡膠樹抗病育種的研究提供參考。

巴西橡膠樹；基因；qRT-PCR；生物信息學；

橡膠樹（）是天然橡膠最重要的來源。由專性寄生病原菌（先前鑒定為橡膠粉孢）引起的橡膠樹白粉病是迄今為止我國橡膠樹最重要的葉部病害，發(fā)病嚴重時可導致橡膠膠乳產(chǎn)量損失多達45%[1-3]。（resistance to powdery mildew locus 8）是對植物多種病害，尤其白粉病具有抗性的廣譜抗病基因位點[4-6]。因此，深入研究橡膠樹基因的白粉病菌脅迫響應機制對橡膠樹抗白粉病品種改良具有重要意義。

是在2001年用圖位克隆法從高抗白粉病的擬南芥Ms-0生態(tài)型中克隆的一個廣譜抗性基因，這一基因位點包含2個緊密連鎖的基因：和[7-8]，它們在氨基酸序列上具有65%的相似性，均在N端含1個跨膜結(jié)構(gòu)域TMD與1～2個卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域（coiled-coil，CC），不含典型R基因所具有的NB-LRR或者eLRR結(jié)構(gòu)[9-11]。盡管的結(jié)構(gòu)獨特，卻仍然用與NB-LRR抗性蛋白相同的水楊酸信號傳導途徑產(chǎn)生廣譜抗病性[12]。具有組成性表達特征，定位于葉綠體周圍，能增強PTI信號，介導H2O2和PCD的產(chǎn)生，從而產(chǎn)生多病害抗性[13]。與乙烯信號調(diào)控模塊在維持擬南芥生長和抗病之間的平衡發(fā)揮著重要的作用[14]。的表達受白粉菌侵染誘導，其蛋白特異錨定于吸器外質(zhì)膜（extra-haustorial membrane, EHM）上，運輸?shù)紼HM的過程依賴于細胞骨架和自身2個富含精氨酸和賴氨酸的保守元件（R/K-R/K-x-R/K）[15]。所介導的抗性反應包括水楊酸的積累、H2O2的積累、基因的升高、胼胝質(zhì)的沉積和HR反應[16-18]。目前，已在擬南芥[7]、蘋果[19]、葡萄[20]、甘藍型油菜[5]、木薯[21]、杏[22]、草莓[23]等植物中發(fā)現(xiàn)抗白粉病RPW8家族基因，均含有RPW8特征結(jié)構(gòu)域且基因具有較高的組織表達特征。同時，基因也在不同植物中拓展了抗白粉病功能的研究，如將十字花科擬南芥中基因轉(zhuǎn)入茄科的煙草中，可提高轉(zhuǎn)基因植株抗白粉性[4]；甘藍型油菜中同源基因轉(zhuǎn)入擬南芥中，有部分基因具有抗白粉菌的功能[24]；轉(zhuǎn)基因葡萄對白粉菌抗性也強于野生型[25]。

隨著研究的不斷深入，植物基因的功能及抗病機理被逐漸認識，但該基因在橡膠樹中的研究卻未見報道，相關(guān)基因的克隆、表達分析、功能驗證等均需進行研究。本研究以橡膠樹全基因組數(shù)據(jù)為基礎，克隆橡膠樹無性系‘熱研73397’中的基因，分析其核酸序列的特征、蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、蛋白保守結(jié)構(gòu)域、系統(tǒng)進化關(guān)系等信息，并對其響應橡膠樹白粉菌侵染及各類激素誘導的表達模式進行研究，有利于更加深入了解RPW8基因家族功能，同時也為橡膠樹抗白粉病基因挖掘和抗白粉病育種提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料為巴西橡膠樹無性系‘熱研73397’芽接苗，種植于海南儋州的國家橡膠樹種質(zhì)資源圃內(nèi)，待葉片物候期進入古銅期時處理使用。

試劑：感受態(tài)細胞（DH5α）、測序載體（pMD19-T載體）、2×PCR MasterMix、T4連接酶、DL2000 marker均購自寶生物工程（大連）有限公司；Omega植物DNA提取試劑盒、Omega植物RNA提取試劑盒、Omega切膠回收試劑盒、實時熒光定量試劑盒ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix和反轉(zhuǎn)錄試劑盒TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

儀器設備：賽默飛梯度PCR儀MiniAmp Plus Thermal Cycler、超微量核酸蛋白分析儀Thermo Fisher Nano Drop 2000、Biometra電泳儀、ChemiDoc MP凝膠成像、TGreen切膠儀、熒光定量PCR儀CFX96TM Real-Time System。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄 將采集的橡膠樹葉片用液氮充分研磨，取100 mg植物材料于無RNA酶的1.5 mL離心管中，參照RNA提取試劑盒的說明書提取總RNA，RNA的濃度與純度通過Nano Drop 2000檢測，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA。

1.2.2基因克隆 根據(jù)GenBank上公布的擬南芥（AF273059）基因序列，在橡膠樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫（hevea.catas.cn）中進行blastx搜索同源基因片段（scaffold0100_324660），通過分析得到橡膠樹基因的cDNA序列及其起始密碼子上游2000 bp的啟動子序列。采用Primer Premier 5.0軟件設計基因特異引物 （表1），以‘熱研73397’的cDNA為模板，利用PCR擴增的全長序列，對PCR產(chǎn)物進行切膠回收，連接pMD-19T載體后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，在含氨芐抗性培養(yǎng)基上培養(yǎng)，檢測后挑取陽性克隆送往鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司測序。

表1 本研究引物序列

1.2.3 HbRPW8生物信息學分析及進化分析 利用Signal P-5.0 Server（http://www.cbs.dtu. dk/ services/Signal P/）在線軟件分析信號肽，TMH MM Server v.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM/）在線軟件預測跨膜結(jié)構(gòu)，Plantm PLoc（http://www.csbio.sjtu. edu.cn/bioinf/ plant/）在線軟件預測亞細胞定位，PSIPRED V4.0（https:// github.com/psipred/psipred）在線軟件預測二級結(jié)構(gòu)，SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy. org/）在線軟件預測三級結(jié)構(gòu)，Conserved Domains（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrp-sb.cgi）在線軟件分析保守結(jié)構(gòu)域，Prot Param（https://web.expasy.org/protparam/）在線軟件工具對其理化性質(zhì)進行生物信息學預測分析，NetPhos-3.1（https://services.healthtech.dtu.dk/serv ice.php?NetPhos-3.1）在線軟件預測磷酸化位點。利用Plant CARE軟件對其啟動子順式作用元件進行預測。使用DNAMAN9軟件進行多序列對比同源相似性。使用MEGAX軟件采用鄰接法（neighbor-joining）進行系統(tǒng)發(fā)育分析（bootstrap值設為1000）。

1.2.4 不同處理下表達分析 參照WANG[26]的方法，使用過氧化氫（H2O2）、水楊酸（SA）、茉莉酸甲酯（MeJA）、生長素（IAA）、乙烯利（ETH）、赤霉素（GA）、脫落酸（ABA）等7種激素和白粉病菌處理橡膠樹古銅期葉片，激素處理后分別采集0、0.5、2、6、12、24 h的葉片，白粉病菌處理后分別采集0、3、6、12、24、48、72 h的葉片；用白粉菌侵染橡膠樹古銅期葉片，10 d后挑選0～5級感病葉片。根據(jù)編碼蛋白序列設計熒光定量引物（表1），選用橡膠樹基因為內(nèi)參，采用SYBR Green法進行qRT-PCR檢測，反應體系和程序參考覃碧等[27]的方法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

相對表達量結(jié)果采用2–ΔΔCT法計算，采用IBM SPSS Statistics軟件進行單因素ANOVA檢驗分析差異顯著性，采用OriginPro 2021軟件進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 HbRPW8基因的克隆分析

PCR克隆得到全長序列為716 bp（圖1），其中基因ORF全長570 bp，編碼189個氨基酸 （圖2），Genebank ID為ON012520，其中含量最豐富的氨基酸為賴氨酸（Lys），占12.7%，其推導的氨基酸分子量是21.73 kDa，等電點為9.23，分子式C966H1577N261O279S13。正負電荷殘基數(shù)分別為32和26，脂肪系數(shù)是86.30，不穩(wěn)定系數(shù)為47.95，總平均親水性–0.404，為親水性蛋白。

M: DL2000 DNA marker.

圖2 HbRPW8基因CDS區(qū)核苷酸序列及其推導氨基酸序列

2.2 橡膠樹HbRPW8蛋白的生物信息學分析

2.2.1 信號肽、亞細胞定位、跨膜區(qū)及磷酸化位點預測 將獲得的cDNA序列翻譯成氨基酸序列后，利用生信軟件預測HbRPW8蛋白存在信號肽的概率為0.0159，故推測HbRPW8是非分泌蛋白（圖3A），HbRPW8蛋白定位于細胞核且無跨膜結(jié)構(gòu)域（圖3B），為非膜蛋白。HbRPW8肽鏈中可能發(fā)生磷酸化且分值在0.5以上的氨基酸位點有8個，其中蘇氨酸磷酸化位點和絲氨酸磷酸化位點各4個，無酪氨酸磷酸化位點（圖3C）。

2.2.2 HbRPW8蛋白保守結(jié)構(gòu)域及二、三級結(jié)構(gòu)預測 生信分析表明HbRPW8在8～128 aa之間存在1個RPW8保守結(jié)構(gòu)域（圖4A）。在HbRPW8蛋白的二級結(jié)構(gòu)中，α-螺旋占70.90%，β-折疊占0.53%，無規(guī)卷曲占22.22%；α-螺旋和無規(guī)卷曲是HbRPW8蛋白二級結(jié)構(gòu)的主要元件（圖4B）。其三級結(jié)構(gòu)與二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果相符合（圖4C）。

2.3 HbRPW8基因編碼蛋白質(zhì)同源序列比對分析及系統(tǒng)進化分析

HbRPW8氨基酸序列與橡膠樹LOC110655851（, XP_021668 009.1），木薯LOC110628052（, XP_021630188.1），蓖麻RPW8（, XP_015576721.1），擬南芥RPW8.1（, AAK09266.1），擬南芥RPW8.2（, AAK09267.1）進行序列比對，總相似度達到53.4%（圖5）。并根據(jù)分析的結(jié)果標注RPW8保守結(jié)構(gòu)域。

圖3 HbRPW8蛋白質(zhì)的信號肽（A）、跨膜結(jié)構(gòu)域（B）和磷酸化位點（C）預測

為闡釋橡膠樹RPW8的進化關(guān)系及分類地位，從NCBI下載甘藍型油菜、擬南芥、蓖麻、木薯、梨、毛白楊、番茄、馬鈴薯、黃瓜、煙草、葡萄、梅、草莓和桃共14個物種的RPW8蛋白序列及與巴西橡膠樹相似度為100%的蛋白序列，通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹可知，橡膠樹HbRPW8與已公布的巴西橡膠樹參考序列的蛋白序列（XP_021668009.1）聚在一起，表明其正是橡膠樹基因，其與大戟科植物木薯RPW8的親緣關(guān)系最近，與薔薇科植物桃（, XP_020423742.1）和草莓（subsp.，XP_011464442.1）RPW8的親緣關(guān)系最遠（圖6）。

A：HbRPW8蛋白的保守結(jié)構(gòu)域；B：HbRPW8蛋白的二級結(jié)構(gòu)預測；C：HbRPW8蛋白的三級結(jié)構(gòu)預測。

氨基酸序列一致性為100%用黑色標記，一致性≥75%用粉色標記，一致性>50%用藍色標記。

2.4 HbRPW8啟動子順式作用元件分析

橡膠樹啟動子序列順式作用元件預測分析顯示（表2），啟動子序列除了包含RNA聚合酶Ⅱ起始轉(zhuǎn)錄所必需的CAAT-box和TATA-box元件，還含有2個光響應元件（G-Box和GT1-motif）、4個植物激素響應相關(guān)元件（脫落酸響應元件ABRE、水楊酸響應元件TCA-element、赤霉素響應元件TATC-box和生長素響應元件TGA-element）、防御與應激元件（TC-rich repeats）及厭氧誘導調(diào)控元件（ARE）。分析結(jié)果表明基因的表達可能受光照和植物激素等條件的調(diào)控。

2.5 HbRPW8基因表達分析

由于基因啟動子含有SA、ABA、GA等響應元件，因此，利用外源激素SA、ABA、GA、MeJA、ETH、IAA、H2O2和白粉菌對橡膠樹芽接苗進行處理，分析基因?qū)Σ煌に睾蜕锩{迫處理的響應情況。結(jié)果如圖7A～圖7G所示，轉(zhuǎn)錄物能迅速被外源H2O2、SA和ETH誘導，并在處理后0.5 h達到最高水平，其相對表達量分別約為0 h對照的14倍、6倍和75倍，隨著處理時間的延長該基因相對表達量有所降低，但仍顯著高于對照。有趣的是，外源GA和ABA處理也迅速誘導了的表達，并在處理后0.5 h達到最高水平，但從2～24 h呈下降趨勢。然而外源MeJA處理0.5 h和2 h該基因無顯著表達，至6 h達到最高水平，是對照的10倍左右，隨著處理時間的延長該基因相對表達量有所降低，但仍顯著高于對照。相比之下，IAA處理后轉(zhuǎn)錄本顯著下調(diào)。在24 h檢測到最低表達水平，與對照相比降低了74%。說明H2O2、SA、ETH、GA和ABA均能迅速誘導的表達。

圖6 不同植物RPW8氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹

表2 橡膠樹HbRPW8基因啟動子順式作用元件分析

白粉菌侵染葉片后（圖7H），以該基因在0 h的表達量為1，隨著侵染時間的延長，3 h表達量達到最高點3.20，6 h稍微下降至1.23，12 h時上升至2.38，隨后逐漸下降，24 h降為1.02，與最初0 h表達量基本相同，48 h和72 h顯著下降，分別為0.31和0.23。分析白粉菌侵染后不同病害級數(shù)的葉片基因的相對表達量（圖7I），結(jié)果顯示基因在不同病級中均有表達。以該基因在0級的表達量為1，1級時相對表達量上升為9.28，2級緩慢下降為6.79，3級時達到最高，為9.89，4級顯著下降為3.08，5級為0.22，說明白粉病菌侵染能夠誘導基因的表達。

不同小寫字母表示處理間差異顯著（P<0.05）

3 討論

廣譜抗病基因是植物抗病育種的寶貴資源，最初是在擬南芥中克隆得到，能對多種植物病害表現(xiàn)較高的抗性，尤其在白粉病抗性調(diào)控中起重要作用[13, 28]。本研究從橡膠樹中克隆到1個基因，其具有典型的保守RPW8結(jié)構(gòu)域，與木薯的遺傳距離較近。橡膠樹基因預測主要定位于細胞核中，這與的研究結(jié)果有一定相似性，定位于細胞核可以對白粉菌產(chǎn)生抗性，而定位于細胞質(zhì)中的可以誘導細胞死亡卻沒有抗性[29]，表明可能對橡膠白粉病產(chǎn)生抗性。

水楊酸、茉莉酸和乙烯是植物抗病信號轉(zhuǎn)導途徑中重要的信號分子，且與其他植物激素信號存在交互作用[30-31]。本研究發(fā)現(xiàn)，基因啟動子序列中含有水楊酸等激素信號分子相關(guān)的多種順式作用元件，推測該基因參與激素信號分子調(diào)控，從而影響橡膠樹抗白粉病。通過qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，基因被白粉病菌強烈誘導表達，且隨著時間的推移和病害等級的增加，其表達水平先上升后下降，與前人研究結(jié)果一致，即在病原體入侵前以低水平表達，但在感染的早期階段被迅速誘導[32-33]。此外，在H2O2、SA、ETH、GA、ABA處理早期上調(diào)顯著，在MeJA處理后期上調(diào)顯著，且被白粉病菌侵染早期強烈誘導表達，推測該基因可能通過多種激素信號協(xié)同調(diào)控下游相關(guān)基因的表達來參與橡膠樹對白粉病菌的抗性反應。目前已有許多研究證明，RPW8基因家族成員參與植物生物及非生物脅迫響應，如LAI等[34]克隆獲得葡萄基因啟動子，發(fā)現(xiàn)其受生物（疫霉菌）和非生物（高溫、低溫、SA）脅迫的響應；ZOU等[35]研究表明FaNBS-RPW8融合蛋白在草莓感病品種中接種炭疽病菌后的不同階段均被顯著誘導。此外，在含有RPW8特征結(jié)構(gòu)域的其他NBS-LRR類基因中也能響應多種脅迫，如鄭永杰等[36]研究表明受樟樹白粉病菌誘導表達，推測其可能參與了響應白粉病菌脅迫反應過程；王雪[37]研究發(fā)現(xiàn)，和基因在黃瓜響應白粉病菌侵染中起作用，且可能與ABA、MeJA、SA、ETH、GA、活性氧等信號通路有關(guān)。WANG等[38]研究發(fā)現(xiàn)在白粉病菌侵染的西葫蘆抗病品種中高表達，而在易感品種中不表達。在擬南芥中，RPW8蛋白主要通過SA通路和EDS1通路來調(diào)控擬南芥的抗白粉病反應[39]。研究還發(fā)現(xiàn)[40]和14-3-3λ（GF14lambda）[41]能正調(diào)控RPW8的抗性，肌醇磷酸神經(jīng)酰胺合酶[42]、光敏色素相關(guān)蛋白磷酸酶2C型（）[43]及[44]是RPW8介導抗病性和細胞死亡的負調(diào)節(jié)因子。

綜上所述，基因在植物響應各種脅迫中發(fā)揮重要作用，基因是否與擬南芥基因一樣依靠SA通路起抗白粉病作用還未可知。在下一步研究中，可通過構(gòu)建基因的過表達轉(zhuǎn)基因植株或基因敲除突變體，進一步研究和驗證基因在橡膠樹抗白粉病過程中的功能。

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Cloning and Expression Analysis ofGene from

GUAN Xin1,2, TU Min2*, CAI Haibin1,2, WANG Yunyue1*, HU Yanshi2, ZENG Xia2

1. Plant Protection College, Yunnan Agricultural University, Kunming, Yunnan 650201, China; 2. Rubber Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou, Hainan 571101, China

(resistance to powdery mildew locus 8) is a broad-spectrum resistance gene locus to many plant diseases, especially powdery mildew. In this study, the cloning and expression analysis ofgene inwere carried out to lay the foundation for the analysis of powdery mildew resistance mechanism and molecular breeding.gene coding region (CDS) was cloned from rubber tree ‘Reyan 73397’ by RT-PCR. Bioinformatics analysis was carried out, and qRT-PCR method was used to determine the expression ofgene after seven hormones and powdery mildew infection at different times and disease grades. The full-length cDNA ofwas 570 bp, encoding 189 amino acids. The molecular weight of HbRPW8 was 21.73 kDa, the isoelectric point was 9.23, the fat coefficient was 86.30, and the total average hydrophilicity index was -0.404, which was a hydrophilic protein with eight phosphorylation sites. The protein was located in the nucleus without transmembrane domain and signal peptide, and had a conserved domain of RPW8. The main components of the secondary structure of HbRPW8 protein were α-helix and random coil, accounting for 70.90% and 22.22% of the amino acid sequence, respectively. Phylogenetic relationships analysis showed thatgene had the highest similarity with cassavagene. Hydrogen peroxide, salicylic acid, ethephon, gibberellin and abscisic acid could rapidly induce the expression oftranscript, and reached the highest level at 0.5 h after treatment, which was about 14, 6, 75, 2.5 and 4 folds of the control, respectively; methyl jasmonate treatment reached the highest level at 6 hafter treatment, about 10 times that of the control;transcript was significantly down-regulated after auxin treatment; with the increase of infection time and disease grade of powdery mildew, the expression level ofincreased first and then decreased. The results of this study preliminarily showed thatmay be involved in the resistance response mechanism of rubber tree, providing a reference for the study of rubber tree resistance breeding.

;gene; qRT-PCR; bioinformatics;

S794.1

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.12.001

2022-03-11；

2022-04-14

國家重點研發(fā)計劃項目（No. 2019YFD10005002-0303）；農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)墾局物種資源保護項目（No. 18200036）。

官 鑫（1997—），女，碩士研究生，研究方向：橡膠樹抗病基因發(fā)掘。*通信作者（Corresponding author）：涂 敏（TU Min），E-mail：tm_tumin@163.com；王云月（WANG Yunyue），E-mail：yunyuewang@hotmail.com。