戎卓娜 趙傳科 孟 麟 王 冰 鐘堂武 王立新 壽成超 （北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院暨北京市腫瘤防治研究所，生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究室，惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制及轉(zhuǎn)化研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100142）

CLDNs（claudins）蛋白家族在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中由27 個(gè)成員組成，這些成員均為四次跨膜蛋白，具有兩個(gè)胞外區(qū)，其N 端和C端均位于細(xì)胞內(nèi)，分子量為20~34 kD［1］。CLDNs蛋白是維持上皮細(xì)胞緊密連接的重要成分，相同或不同家族成員間的相互作用可賦予細(xì)胞不同功能，在多種生理和病理狀態(tài)中發(fā)揮重要作用［2］。

CLDN18 基因位于染色體3q22.3，具有兩種不同的剪切形式，分別編碼CLDN18.1 和CLDN18.2蛋白［3］。CLDN18.1 和CLDN18.2 的表達(dá)譜存在顯著差異，CLDN18.1 可廣泛表達(dá)于肺泡上皮組織，而CLDN18.2 除在分化良好的胃黏膜上皮有一過性表達(dá)外，其主要表達(dá)于多種腫瘤組織，如胃癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌等，在胃腸腺癌中其表達(dá)可達(dá)80%，在胰腺癌中表達(dá)可達(dá)60%。因此，CLDN18.2成為近年來腫瘤治療的重要研究靶點(diǎn)，多個(gè)CLDN18.2抗體藥物已進(jìn)入臨床試驗(yàn)［4-5］。

CLDN18 蛋白的N 端和C 端均位于胞內(nèi)，經(jīng)4 次跨膜后形成兩個(gè)胞外區(qū)。第一胞外區(qū)約由50 個(gè)氨基酸組成，人CLDN18.1 和CLDN18.2 之間僅有8 個(gè)氨基酸的差異；第二胞外區(qū)約由22 個(gè)氨基酸組成，CLDN18.1和CLDN18.2間完全同源。因此，針對(duì)第一胞外區(qū)是獲得CLDN18.2特異抗體的關(guān)鍵。由于第一胞外區(qū)在CLDN18.1 和CLDN18.2 間高度同源，同時(shí)在人鼠間完全同源［6］，這對(duì)常規(guī)采用蛋白或多肽經(jīng)小鼠免疫后，通過細(xì)胞融合獲得CLDN18.2特異性單克隆抗體的策略構(gòu)成巨大的挑戰(zhàn)和障礙。本文在構(gòu)建CLDN18.2 真核表達(dá)質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，嘗試采用in vivo-jet PEI-Gal 轉(zhuǎn)染試劑通過小鼠尾靜脈注射進(jìn)行質(zhì)粒DNA 免疫，發(fā)現(xiàn)在經(jīng)2 次免疫后，小鼠體內(nèi)即可檢測(cè)到高滴度抗體，隨后課題組經(jīng)細(xì)胞融合和篩選，獲得了多株CLDN18.2高特異性、高親和力的抗體，為后續(xù)的CLDN18.2 抗體藥物研發(fā)奠定了重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 pcDNA3.1（+）-CLDN18.2 質(zhì)粒由上海生工生物技術(shù)有限公司全基因合成；293T、293TCLDN18.1 和293T-CLDN18.2 細(xì)胞均購(gòu)自康源博創(chuàng)生物技術(shù)有限公司，細(xì)胞培養(yǎng)條件為DMEM+10%FBS，37 ℃5%CO2；小鼠SP2/0 骨髓瘤細(xì)胞系由我室保存，培養(yǎng)條件為1640+15%FBS；6~8周齡雌性BALB/c 小鼠購(gòu)自北京華阜康生物技術(shù)有限公司；in vivo-jetPEI-Gal（Cat#.202-10G）購(gòu)自Polyplus；CLDN18抗體（Cat#.700178）購(gòu)自Thermo 公司；次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸苷（hypoxathine，aminopterin，thymidine，HAT）購(gòu)自Sigma公司；FITC-羊抗小鼠購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；EndoFree Plasmid Maxi Kit購(gòu)自Qiagen公司。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒的提取及鑒定 37 ℃過夜培養(yǎng)pc-DNA3.1（+）-CLDN18.2質(zhì)粒菌液200 ml。離心收取菌液后，采用EndoFree Plasmid Maxi Kit 提取質(zhì)粒DNA。經(jīng)HindⅢ和NotⅠ雙酶切后，采用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。載體大小5.4 kb，目的片段約800 bp。

1.2.2 小鼠DNA 免疫 選取6~8周齡雌性BALB/c小鼠進(jìn)行免疫。將40 μg pcDNA3.1（+）-CLDN18.2質(zhì)粒與6.4μlin vivo-jetPEI-Gal按說明書混勻，靜置15 min 后，尾靜脈注射至小鼠體內(nèi)。21 d 后使用相同方案再次免疫小鼠。第2次免疫7 d后取尾血，分別采用293T、293T-CLDN18.1、293T-CLDN18.2 細(xì)胞進(jìn)行ELISA 檢測(cè)尾血效價(jià)。于融合前3 d 選擇抗體滴度最高的1只小鼠加強(qiáng)免疫后進(jìn)行細(xì)胞融合。

1.2.3 細(xì)胞融合與篩選 取免疫后小鼠脾臟，采用傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)與骨髓瘤SP2/0 細(xì)胞融合，以HAT 選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)。在融合后第8 天左右，吸取克隆孔培養(yǎng)上清同時(shí)采用293T、293T-CLDN18.1及293T-CLDN18.2 三種細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞ELISA檢測(cè)，篩選只與293T-CLDN18.2 細(xì)胞反應(yīng)、與293T及293T-CLDN18.1 均不反應(yīng)的克隆孔，通過有限稀釋法進(jìn)行亞克隆及篩選，直至獲得能穩(wěn)定分泌抗CLDN18.2的雜交瘤單克隆細(xì)胞株。

1.2.4 單克隆抗體的制備與純化 BALB/c 小鼠腹腔注射0.5 ml 弗氏不完全佐劑，次日腹腔注射雜交瘤細(xì)胞（2×106個(gè)/只）。待約7 d 后小鼠腹部顯著膨隆時(shí)收取腹水，2 000 r/min 離心20 min，取上清。經(jīng)平衡緩沖液等體積稀釋后，0.45 μm 濾器過濾。將過濾后的腹水以1 ml/min 流速通過Purify 蛋白純化儀，平衡緩沖液洗去雜蛋白，洗脫液（100 mmol/L 甘氨酸-鹽酸，pH=2.8）洗脫抗體，收取OD280>0.5的抗體洗脫液，經(jīng)PBS 4 ℃透析后進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定。

1.2.5 細(xì)胞ELISA 293T、293T-CLDN18.1和293TCLDN18.2 細(xì)胞以2×104個(gè)/孔鋪96 孔板，18 h 后直接加入0.25%的戊二醛，100 μl/孔，室溫固定細(xì)胞20 min，PBST 清洗5 遍；然后采用5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h，PBST 清洗5 遍；將稀釋的小鼠血清或單抗以100 μl/孔加入各孔，室溫反應(yīng)2 h，PBST 清洗5 遍；加入HRP 標(biāo)記的羊抗小鼠二抗，100 μl/孔，室溫反應(yīng)1 h，PBST 清洗5 遍；加入底物顯色液OPD（100 μl/孔），室溫避光顯色15 min；加入12.5%H2SO4終止（50 μl/孔）。酶標(biāo)儀檢測(cè)OD490讀數(shù)。采用Graphpad prism 軟件，以抗體濃度為橫坐標(biāo)，OD490讀數(shù)為縱坐標(biāo)做散點(diǎn)圖并模擬結(jié)合曲線，計(jì)算EC50值作為抗體的親和力。

1.2.6 免疫沉淀 采用RIPA 裂解液裂解細(xì)胞收取蛋白。各取1 μg CLDN18.2 單抗與20 μl Protein G瓊脂糖凝膠珠加入1 ml PBST中，同時(shí)以1μg小鼠IgG 作為陰性對(duì)照，室溫?fù)u床孵育1 h，PBST 洗珠3 次，然后分別加入100 μl 細(xì)胞裂解液和900 μl PBST 4 ℃搖床過夜。次日PBST洗珠3次，加入與柱等體積的2×SDS裂解液，煮沸7 min，常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜后，采用商業(yè)化CLDN18 抗體進(jìn)行Western blot檢測(cè)。

1.2.7 流式細(xì)胞檢測(cè) 常規(guī)消化細(xì)胞并以預(yù)冷的PBS 清洗2 遍后，PBS 重懸至2×106個(gè)/ml，取100 μl細(xì)胞液，用2 μg/ml 的CLDN18.2 單抗室溫染色45 min，PBS清洗3遍，采用Alexa Fluor 488標(biāo)記的羊抗小鼠二抗室溫染色30 min，PBS 清洗3 遍，300 μl PBS重懸細(xì)胞上機(jī)檢測(cè)（BD FACS Aria）。

1.2.8 免疫熒光實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞爬片以100μg/ml的多聚賴氨酸37 ℃包被2 h，采用高壓ddH2O 清洗3 遍，晾干備用。293T-CLDN18.2、293T-CLDN18.1 和293T 細(xì)胞消化重懸，以相同細(xì)胞數(shù)鋪在放置了經(jīng)上述預(yù)處理的載玻片的24孔板中。細(xì)胞貼壁24 h后，采用預(yù)冷的PBS 清洗2 遍，以2 μg/ml 的CLDN18.2單抗和Hochest 33258（1∶100）37 ℃染色45 min，PBS清洗3遍，以Alexa Fluor 488標(biāo)記的羊抗小鼠二抗室溫染色30 min，PBS清洗3遍，90%甘油封片后，采用Leica SP2共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定 pcDNA3.1（+）-CLDN18.2構(gòu)建質(zhì)粒圖譜見圖1A。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)，次日稀釋至200 ml LB 培養(yǎng)基中擴(kuò)增培養(yǎng)過夜。離心收取細(xì)菌沉淀，使用EndoFree Plasmid Maxi Kit 進(jìn)行大提；提取的質(zhì)粒經(jīng)電泳鑒定，其純度在98%以上，且主要為超螺旋結(jié)構(gòu)，適用于后續(xù)試驗(yàn)（圖1B）。使用HindⅢ和NotⅠ對(duì)大提質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，其釋放的目的片段約800 bp，符合預(yù)期（圖1C）。質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果表明序列正確（圖略）。

圖1 pcDNA3.1（+）-CLDN18.2質(zhì)粒圖譜及酶切鑒定Fig.1 Identification and construction of pcDNA3.1（+）-CLDN18.2

2.2 小鼠抗血清效價(jià)檢測(cè) 用上述質(zhì)粒進(jìn)行第2次免疫后第7 天取小鼠尾血進(jìn)行梯度稀釋，然后采用293T-CLDN18.2、293T-CLDN18.1 和293T 細(xì)胞鋪96 孔板進(jìn)行效價(jià)檢測(cè)。結(jié)果可見，受測(cè)小鼠的抗血清與293T-CLDN18.2 細(xì)胞有較強(qiáng)反應(yīng)，而與293TCLDN18.1 和293T 細(xì)胞的反應(yīng)較弱（圖2A），即使在1∶2 000 稀釋時(shí)，其OD490讀數(shù)仍>0.5，與293TCLDN18.1 和293T 細(xì)胞相比差異明顯（圖2B）。以上結(jié)果表明，質(zhì)粒DNA 免疫可有效誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗人CLDN18.2的特異性抗體。

圖2 質(zhì)粒免疫小鼠血清效價(jià)檢測(cè)Fig.2 Quantitation of serum antibody titers after immuni?zation in mice

2.3 細(xì)胞融合篩選與抗體的制備純化 對(duì)上述pcDNA3.1-CLDN18.2質(zhì)粒免疫小鼠進(jìn)行常規(guī)融合、293T-CLDN18.2、293T-CLDN18.1 及293T 細(xì)胞差異篩選及多輪亞克隆，最終獲得15 株抗人CLDN18.2的雜交瘤細(xì)胞株，并通過小鼠腹水制備和抗體純化獲得不同量的純化抗體?？贵w經(jīng)電泳鑒定未見明顯雜帶（圖3），純度良好符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

圖3 CLDN18.2單克隆抗體的純化Fig.3 Purification of CLDN18.2 monoclonal antibodies

2.4 細(xì)胞ELISA 檢測(cè)CLDN18.2 單克隆抗體特異性 293T、293T-CLDN18.1 和293T-CLDN18.2 細(xì)胞分別鋪96 孔板，用上述純化的CLDN18.2 抗體通過ELISA（2μg/ml）進(jìn)行特異性檢測(cè)，結(jié)果如圖4 所示，制備獲得的15 株小鼠雜交瘤單克隆抗體，除4G3、5H8 和6D4 與293T-CLDN18.1 有較弱交叉反應(yīng)外，其余均表現(xiàn)出CLDN18.2高特異性反應(yīng)。

圖4 細(xì)胞ELISA檢測(cè)CLDN18.2單克隆抗體的特異性Fig.4 Detection of monoclonal antibodies reacted with CLDN18.2 protein by cell ELISA

2.5 細(xì)胞ELISA 檢測(cè)CLDN18.2 單克隆抗體親和力 293T-CLDN18.2 細(xì)胞鋪96 孔板，單克隆抗體以100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 1和0.000 01 nmol/L濃度進(jìn)行細(xì)胞ELISA，檢測(cè)抗體親和力。結(jié)果顯示15 株抗體與293T-CLDN18.2 細(xì)胞結(jié)合均呈濃度依賴性，并呈現(xiàn)出較高的結(jié)合活性（圖5）。表1是15株抗體的親和力EC50值，除4G3和5H7兩株單克隆抗體的EC50 為納摩爾級(jí)，其他單克隆株的EC50 均為亞納摩爾級(jí)。該結(jié)果表明本次制備的CLDN18.2小鼠單克隆抗體親和力較高。

表1 CLDN18.2單克隆抗體的親和力Tab.1 Affinity of CLDN18.2 monoclonal antibodies

圖5 細(xì)胞ELISA檢測(cè)CLDN18.2單克隆抗體的親和力Fig.5 Affinity of monoclonal antibodies reacted with CLDN18.2 protein by cell ELISA

2.6 CLDN18.2 單克隆抗體在Western blot 和免疫沉淀中的應(yīng)用檢測(cè) 為了解本次制備抗體是否可用于CLDN18.2 的Western blot 和免疫沉淀的檢測(cè)，分別用293T-CLDN18.1 和293T-CLDN18.2 細(xì)胞總蛋白進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜后，用上述15株抗人CLDN18.2單克隆抗體作為一抗進(jìn)行Western blot 檢測(cè)，但15株抗體均未檢出特異性條帶，本次制備的15株抗體均不適于Western blot的應(yīng)用（數(shù)據(jù)未展示）。

為進(jìn)一步鑒定抗體的應(yīng)用，使用制備的CLDN18.2 小鼠單抗和上述細(xì)胞的裂解蛋白進(jìn)行免疫沉淀，采用商品化CLDN18 通抗進(jìn)行Western blot檢測(cè)。結(jié)果如圖6所示，除單抗6D4與CLDN18.1有較弱的交叉反應(yīng)外，其余單克隆抗體均與CLDN18.2 呈特異性反應(yīng)，單抗5H1-2、5H7、7A10、8C12和9A1在免疫沉淀中表現(xiàn)出更強(qiáng)的結(jié)合活性。

圖6 CLDN18.2單克隆抗體免疫沉淀應(yīng)用Fig.6 Immunoprecipitation application of CLDN18.2 monoclonal antibodies

2.7 CLDN18.2單克隆抗體在流式細(xì)胞術(shù)中的應(yīng)用檢測(cè) 收集293T、293T-CLDN18.1和293T-CLDN18.2細(xì)胞，預(yù)冷PBS 洗2 遍，進(jìn)行流式染色，檢測(cè)結(jié)果見圖7。除單抗4G3、5H7和6D4 對(duì)293T-CLDN18.1細(xì)胞有一定陽性染色外（分別為9.3%、24.3% 和7.6%），其他抗體均對(duì)293T-CLDN18.2 細(xì)胞呈特異性染色，染色陽性率均大于80.0%。其中，5C9 的陽性染色率高達(dá)96.2%。以上結(jié)果表明，獲得的15 株CLDN18.2 單抗均可用于流式細(xì)胞染色的檢測(cè)，且該結(jié)果與細(xì)胞ELISA結(jié)果基本一致。

圖7 CLDN18.2單克隆抗體在流式細(xì)胞術(shù)中的應(yīng)用Fig.7 Flow cytometry application of CLDN18.2 monoclo?nal antibodies

2.8 CLDN18.2 單克隆抗體在細(xì)胞免疫熒光中的應(yīng)用檢測(cè) 根據(jù)ELISA 和流式染色結(jié)果，選擇1D5、5C9、5H1、5H7、8C12 和15G11 6 株特異性強(qiáng)的單克隆抗體進(jìn)行免疫熒光應(yīng)用的檢測(cè)。結(jié)果如圖8 所示，6 株單克隆抗體與293T 和293T-CLDN18.1 細(xì)胞均不反應(yīng)，與293T-CLDN18.2 特異性結(jié)合且蛋白清晰膜定位，說明上述6 株抗體均可用于CLDN18.2的特異性免疫熒光檢測(cè)。

圖8 CLDN18.2單克隆抗體的免疫熒光應(yīng)用Fig.8 Immunofluorescence application of CLDN18.2 monoclonal antibodies

3 討論

盡管近年來單克隆抗體制備技術(shù)獲得了較快發(fā)展，兔單克隆抗體的制備、噬菌體抗體庫(kù)篩選等也已成為獲得單克隆抗體的重要途徑，但傳統(tǒng)的小鼠雜交瘤抗體制備技術(shù)因其技術(shù)成熟、操作相對(duì)簡(jiǎn)單及條件要求較低等優(yōu)勢(shì)，依然是目前獲得單克隆抗體的常用方法［7-8］。特別是隨著基因工程技術(shù)的快速發(fā)展，鼠源抗體的人源化改造技術(shù)也已經(jīng)非常成熟，研究者通過小鼠免疫獲得高特異性、高親和力的抗體，在此基礎(chǔ)上對(duì)其進(jìn)行人源化改造，亦已成為抗體藥物研發(fā)的常用策略。

欲獲得特異性高、親和力強(qiáng)的單克隆抗體，首先需對(duì)小鼠進(jìn)行抗原免疫。蛋白、多肽及細(xì)胞是常用的抗原形式，鑒于免疫用蛋白多為原核表達(dá)產(chǎn)物，缺少表達(dá)后的蛋白修飾及必要的空間構(gòu)象；化學(xué)合成的多肽雖然成本低廉，但因其只是蛋白質(zhì)的一級(jí)肽鏈結(jié)構(gòu)，用原核表達(dá)蛋白或人工合成多肽進(jìn)行免疫獲得的單克隆抗體雖然可與抗原結(jié)合，但有時(shí)難以同具有生物學(xué)活性的天然蛋白結(jié)合［6］。由于CLDN 家族蛋白間的同源性較高，特別是人CLDN18.1和CLDN18.2的兩個(gè)胞外區(qū)，組成第二胞外區(qū)的約22個(gè)氨基酸是完全相同的，組成第一胞外區(qū)的50 個(gè)左右氨基酸也僅有8 個(gè)氨基酸的差異。為獲得針對(duì)CLDN18.2 的特異抗體，研究者多采用第一胞外區(qū)差異多肽進(jìn)行免疫。通過該方法獲得的抗體雖然可同多肽反應(yīng)，但多難以同CLDN18.2蛋白結(jié)合。用穩(wěn)定表達(dá)CLDN18.2 的細(xì)胞進(jìn)行免疫，然后分別用表達(dá)CLDN18.1 和CLDN18.2 的細(xì)胞進(jìn)行差異篩選，雖然也是可以考慮的技術(shù)路線，但因細(xì)胞含有的抗原極為復(fù)雜，又因CLDN18.1 和CLDN18.2間高度同源，要獲得CLDN18.2特異性單克隆抗體，除篩選工作量大外，還存在較高的不確定性［9-10］。

DNA 免疫多用于基因治療或作為疫苗進(jìn)行疾病預(yù)防，給藥途徑多為輔以佐劑予以肌肉注射，或采用金包顆粒通過基因槍給藥［11-13］。近年來DNA免疫也開始用于抗體制備，給藥途徑多為肌肉注射或者靜脈注射［14］。DNA 免疫多采用重組表達(dá)質(zhì)粒作為免疫原，具有抗原便于制備獲得、免疫周期短、通過宿主細(xì)胞表達(dá)的抗原具有蛋白的天然結(jié)構(gòu)，易于誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)蛋白構(gòu)象性表位的單克隆抗體等優(yōu)勢(shì)。在本研究中，采用jetPEI-Gal 作為免疫用佐劑。jetPEI 是目前常用的動(dòng)物體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑，本研究所用jetPEI-Gal 是連接了半乳糖的聚乙烯亞胺衍生物，能與DNA 形成陽離子復(fù)合物。該復(fù)合物可通過與肝細(xì)胞表面的去唾液酸糖蛋白受體特異性識(shí)別而被其大量攝取和表達(dá)。本研究雖然沒有檢測(cè)免疫小鼠體內(nèi)的抗原表達(dá)水平，但質(zhì)粒免疫2 次后獲得的高滴度抗體效價(jià)也可間接反映出用于免疫的DNA在小鼠體內(nèi)得到了有效表達(dá)。

除DNA 需有效表達(dá)外，其表達(dá)蛋白的免疫源性與能否有效激活宿主機(jī)體的免疫反應(yīng)也密切相關(guān)。人鼠間CLDN18.2 第一胞外區(qū)的約50 個(gè)氨基酸完全相同，理論上對(duì)小鼠不具有免疫原性，但由于成熟的正常小鼠不表達(dá)或低表達(dá)CLDN18.2，在質(zhì)粒DNA 進(jìn)入機(jī)體并獲得大量表達(dá)后，小鼠有可能將其視為異源蛋白而產(chǎn)生強(qiáng)烈的體液免疫反應(yīng)。本研究成功獲得了15 株CLDN18.2 特異性的高親和力抗體，表明小鼠對(duì)DNA 免疫后的蛋白表達(dá)產(chǎn)生了良好的免疫反應(yīng)。

本研究獲得的15 株單克隆抗體在細(xì)胞ELISA、免疫沉淀、流式檢測(cè)和免疫熒光實(shí)驗(yàn)中均能特異性識(shí)別CLDN18.2，說明它們的結(jié)合部位均位于CLDN18.2的第一胞外區(qū)，故不與CLDN18.1形成交叉反應(yīng)。在與CLDN18.2 第一胞外區(qū)的結(jié)合反應(yīng)中，15 株單克隆抗體在與抗原的非變性實(shí)驗(yàn)中，如細(xì)胞ELISA、免疫沉淀、流式檢測(cè)和免疫熒光實(shí)驗(yàn)均可特異識(shí)別CLDN18.2，但均不能用于變性抗原的Western blot 檢測(cè)，表明它們識(shí)別的是CLDN18.2 第一胞外區(qū)的空間構(gòu)象，而非肽鏈一級(jí)結(jié)構(gòu)。在CLDN18.2 第一胞外區(qū)的50 余個(gè)氨基酸中含有4 個(gè)半胱氨酸（分別位于第4、25、30 和31 位），它們可以通過二硫鍵形成復(fù)雜的空間構(gòu)象。與CLDN18.1存在差異的8 個(gè)氨基酸中（分別位于第2、10、15、18、20、29、38 和42 位），第15 位差異氨基酸在CLDN18.2 為丙氨酸，而在CLDN18.1 中為半胱氨酸，其連同第一胞外區(qū)的其他4 個(gè)半胱氨酸可能形成更為復(fù)雜的空間構(gòu)象，造成CLDN18.2 與CLDN18.1 第一胞外區(qū)的較大構(gòu)象差異。本研究獲得的15株抗體均與非變性蛋白反應(yīng)，與變性蛋白不反應(yīng)，說明它們識(shí)別的抗原表位是由CLDN18.2 胞外區(qū)肽鏈折疊后形成的某一特定空間構(gòu)象。但要明確它們是否為識(shí)別同一構(gòu)象或不同構(gòu)象、是由多少位氨基酸組成的空間構(gòu)象等問題，還需通過抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抑制實(shí)驗(yàn)、第一胞外區(qū)氨基酸單點(diǎn)及多點(diǎn)突變等進(jìn)行進(jìn)一步確定。

本研究通過DNA 免疫成功獲得了15 株CLDN18.2 的特異性單克隆抗體。在后續(xù)研究中，課題組將評(píng)估所獲抗體對(duì)CLDN18.2高表達(dá)腫瘤的治療作用，并進(jìn)一步探索其發(fā)揮作用的分子機(jī)制。