扶 猛 嚴 湘 夏 歡 李 霜 李經倫 （西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院神經內科，瀘州 646000）

一氧化碳（CO）是碳化合物不完全燃燒（氧化）的產物，長時間暴露于CO 中會導致持久性神經系統(tǒng)后遺癥和延遲性神經系統(tǒng)后遺癥，且致死率高。急性CO 中毒后，13%~50%的患者會經歷2~60 d 的假愈期，再逐漸發(fā)展為以智力受損、行為障礙等為主要表現的腦功能障礙性疾病，被命名為急性一氧化碳中毒遲發(fā)性腦?。╠elayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning，DEACMP），其發(fā)病機制尚在進一步研究中［1］。細胞焦亡是一種由cas‐pase-1介導的新型細胞死亡形式，在微生物、應激和損傷信號的刺激作用下，炎癥小體識別上述刺激信號后導致caspase-1 直接激活，誘導促炎細胞因子的分泌和細胞焦亡的發(fā)生［2］。研究證明，caspase-1與腦出血、缺血再灌注損傷、敗血癥腦病等許多中樞神經系統(tǒng)疾病的發(fā)生緊密相關［3-5］。但細胞焦亡與DEACMP 是否有關未見報道。因此本研究擬通過分次腹腔注射CO 氣體法建立大鼠遲發(fā)性腦病模型，通過分析大鼠染毒前后行為學改變及檢測焦亡相關因子NLRP3、caspase-1、GSDMD 蛋白及炎癥因子IL-1β、IL-18等動態(tài)變化探討細胞焦亡與DEACMP的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 120 只雄性SD 大鼠（250~300 g），動物許可證：SCXK（川）2020-030，由成都達碩實驗動物有限公司提供。純度為99.9%的CO 氣體由西南化工研究所提供；Morris 水迷宮跟蹤分析系統(tǒng)由西南醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院提供；caspase-1 特異性抑制劑Ac-YVAD-cmk（貨號：GC42721-1）購自廣州吉英生物科技有限公司；顯微鏡購自OLYMPUS；兔源caspase-1 抗體（貨號：DF6148）購自Affinity；蘇木素染液（貨號：AS1055A）購自ASPEN；伊紅染液（貨號：AS1094）購自ASPEN；抗NLRP3 抗體（貨號：ab263899）、抗GSDMD 抗體（貨號：ab219800）購自Abcam；抗cleaved-caspase-1 抗體（貨號：AF4005）購自affbiotech；DAB顯色試劑盒（貨號：ZLI-9033）購自北京中杉金橋生物技術有限公司；大鼠IL-18 ELISA試劑盒（貨號：ELK2270）、大鼠IL-1β ELISA 試劑盒（貨號：ELK1272）購自ELK Biotechnology。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 120只雄性SD大鼠，經水迷宮實驗篩選無認知功能障礙，隨機分為：空氣組（K 組）、CO 中毒組（CO 組）、CO+caspase-1 特異性抑制劑Ac-YVAD-cmk組（cmk組），每組40只；各組再按照染毒時間順序均分為第1、3、7、14、21天5個亞組。

1.2.2 實驗建模 DEACMP 模型的建立采用分次腹腔注射CO 氣體法［6-7］。大鼠稱重后標記組別、序號，CO組及cmk組大鼠經腹腔注射CO氣體，首次劑量為100 ml/kg，造模后每隔4 h 追加1 次，追加量按50 ml/kg 計算，共追加3 次，死亡大鼠嚴格按照上述造模方式補齊。K 組大鼠按上述方法注射相同體積的空氣。cmk 組大鼠于制備DEACMP 模型0.5 h 前腹腔注射Ac-YVAD-cmk（1 mg/只），造模后隔天注射1 次，直至造模結束。染毒后16 h 內反復抽取中毒大鼠股動脈血，用血氣分析儀測量碳氧血紅蛋白（HbCO）濃度。

1.2.3 Morris 水迷宮實驗 大鼠飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學城北動物實驗中心，飼養(yǎng)溫度20~25 ℃，濕度適宜，光照良好，晝夜節(jié)律分明。實驗前對大鼠進行水迷宮測試訓練，連續(xù)5 d，每天訓練4 次，篩選出認知功能差的大鼠。染毒后各時間點，分別于4 個象限標記點將大鼠頭朝池壁放入，記錄大鼠在水迷宮之中找到平臺象限的時間，即逃避潛伏期，記錄4個象限逃避潛伏期的均值，重復4 次，取4 次測試的均值作為大鼠的最終逃避潛伏期時間。取走平臺，測試大鼠在120 s 內分別從4 個象限中放入池壁后穿越平臺所在象限的次數，即空間探索能力，以相同的實驗方法記錄大鼠的穿越平臺次數，取均值進行比較。

1.2.4 組織標本取材 各組大鼠在實驗完成后按時間點進行取材送檢，部分大鼠在有效麻醉后固定于操作臺，充分暴露胸腹部，先后以生理鹽水及4%多聚甲醛經左心室灌注固定，灌注成功的標志為大鼠四肢、舌頭、肝臟變白和身體僵硬，斷頭取大鼠海馬組織置于適量甲醛溶液中，4 ℃冰箱中保存，用于染色；另一部分大鼠直接斷頭處死，并于冰面上盡快分離得到新鮮海馬組織，用于Western blot 及ELISA檢測。

1.2.5 HE 染色觀察細胞形態(tài) 新鮮組織甲醛固定、修整，梯度乙醇脫水，組織浸蠟進行包埋并貼上標簽，待蠟凝固后再次進行修整并置于石蠟切片機上切片，乙醇脫蠟至水，蘇木素染液染細胞核約5 min，伊紅染液染細胞質約3 min，封片觀察海馬神經元細胞形態(tài)。

1.2.6 Western blot檢測NLRP3、cleaved-caspase-1、GSDMD 蛋白的表達 取已準備好的海馬組織，分離、剪碎，冰浴并徹底勻漿后提取腦組織總蛋白，相關蛋白濃度測定采用BCA 法。蛋白樣品經凝膠電泳，轉膜、封閉，加入一抗，4 ℃下孵育過夜，TBST 反復漂洗3次，加入二抗，室溫孵育。洗滌后進行化學發(fā)光檢測，目標帶的光密度值用AlphaEaseFC 軟件處理系統(tǒng)分析。

1.2.7 免疫組織化學染色檢測caspase-1 陽性細胞表達 已準備好的海馬標本經切片、脫蠟至水，抗原修復處理等，冷卻至室溫。PBS 洗滌，每次5 min；室溫下浸于3%H2O2溶液中；再洗滌。甩干，5%BSA 封閉；4 ℃下滴入一抗過夜；PBS 洗滌，滴入二抗，37 ℃下孵育；再次經PBS 洗滌，顯微鏡下觀察。沖洗、蘇木素復染、分化，再次沖洗后乙醇脫水干燥，光學顯微鏡下觀察，找到被染成黃褐色或棕黃色細胞即為陽性細胞。

1.2.8 ELISA 檢測IL-1β及IL-8蛋白水平 取大鼠海馬組織上清液，按照大鼠IL-1β、IL-18 ELISA 試劑盒說明書步驟測定IL-1β、IL-18 蛋白水平。酶標板孔中加入100μl 已稀釋的標準品和待測樣本，蓋上封板膜，輕輕混勻后37 ℃孵育1 h，甩干孔內液體，每孔加入300μl 洗液，洗滌3 次，拍干水分后每孔加入親和鏈霉素-HRP 50 μl，37 ℃孵育30 min，重復上述洗滌步驟3 次，每孔加入顯色劑A、B 各50 μl，37 ℃避光孵育30 min，迅速加入50 μl 終止液，酶標儀測定450 nm波長處各孔的OD 值，按標準品所得的標準曲線計算各樣本的IL-1β、IL-18濃度。

1.3 統(tǒng)計學處理 計量資料用±s表示，統(tǒng)計數據分析使用SPSS26.0 軟件。各組數據均經正態(tài)性和方差齊性檢驗，多組均數間數值比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 法，P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠中毒后行為變化及股動脈血HbCO 濃度測量 多數大鼠在腹腔注射CO 氣體后表現出焦躁不安、活動增加、胡亂沖撞，四肢皮膚及唇部呈現櫻桃紅色；少數大鼠出現動作減少、萎靡不振、眼神渙散、四肢無力。逐漸補打CO 氣體過程中發(fā)現大鼠死亡率升高，部分大鼠還出現肢體抽搐、昏迷、大小便失禁、角弓反張狀態(tài)等，死亡大鼠在相同環(huán)境下及時予以造模補充。16 h 內CO 組及cmk 組大鼠股動脈血HbCO濃度均>50%。

2.2 Morrris 水迷宮實驗 水迷宮實驗數據分析顯示，直至染毒第7天，各組大鼠逃避潛伏期及穿越平臺次數的差異均無統(tǒng)計學意義（均P>0.05，表1、表2）。但染毒14 d、21 d 后觀察大鼠，CO 組及cmk組逃避潛伏期較K組延長（表1），穿越平臺次數較K組少（表2），差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）。值得注意的是，染毒第14 天及第21 天，cmk 組大鼠逃避潛伏期短于CO 組，且穿越平臺次數多于CO 組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）。

表1 3組大鼠各時間點逃避潛伏期比較（±s，n=3）Tab.1 Comparison of escape latency at each time point between three groups of rats（±s，n=3）

Note：Compared with K group，1）P<0.05；compared with CO group，2）P<0.05；compared with 1 d，3 d，7 d in CO group，3）P<0.05.

21 d 12.52±0.48 26.03±0.731）3）21.52±1.001）2）241.79<0.01 Groups K CO cmk F P 1 d 12.54±0.43 12.48±00.39 12.52±0.49 0.02 0.983 3 d 12.57±0.40 13.20±0.59 13.06±0.0.32 1.61 0.28 7 d 12.70±0.31 13.49±0.90 13.34±0.98 0.84 0.48 14 d 12.51±0.49 25.93±0.531）3）21.16±0.571）2）492.85<0.01

表2 3組大鼠各時間點穿越平臺次數比較（±s，n=5）Tab.2 Comparison of number of platform crossing at each time point between three groups of rats（±s，n=5）

表2 3組大鼠各時間點穿越平臺次數比較（±s，n=5）Tab.2 Comparison of number of platform crossing at each time point between three groups of rats（±s，n=5）

Note：Compared with K group，1）P<0.05；compared with CO group，2）P<0.05；compared with 1 d，3 d，7 d in CO group，3）P<0.05.

21 d 9.87±0.10 4.59±0.211）3）7.24±0.221）2）1 029.82<0.01 Groups K CO cmk F P 1 d 10.00±0.12 9.99±0.09 9.96±0.07 0.28 0.76 3 d 9.99±0.87 9.89±0.91 9.89±0.09 2.15 0.16 7 d 9.88±0.09 9.78±0.08 9.82±0.10 1.50 0.26 14 d 9.93±0.07 4.86±0.171）3）7.34±0.251）2）1 029.94<0.01

2.3 HE 染色結果 K 組大鼠海馬CA1區(qū)神經元細胞形態(tài)完好，核膜完整、核仁清晰，細胞著色淺淡，如圖1A所示。CO組大鼠海馬CA1區(qū)神經細胞隨著中毒時間延長，細胞核變得固縮、深染，發(fā)生變性壞死細胞逐漸增多，如圖1B。cmk 組海馬CA1 區(qū)神經元細胞損傷較CO 組輕，細胞排列較CO 組整齊，細胞之間分界較清晰，如圖1C。

圖1 14 d時各組海馬CA1區(qū)HE染色（×400）Fig.1 HE staining of hippocampal CA1 region in each group on 14 d（×400）

2.4 Western blot 檢測NLRP3、cleaved-caspase-1、GSDMD 蛋白的表達變化 Western blot 結果顯示，K組大鼠中NLRP3、cleaved-caspase-1 及GSDMD 蛋白在各時間點表達差異無統(tǒng)計學意義（均P>0.05，圖2）。CO組及cmk組三種蛋白表達變化顯著，且具有相似表達趨勢，均在染毒后第1 天開始升高，第3 天達到第一次高峰，第7 天有下降，第14 天達到第二次高峰，第21 天表達下降；且染毒第14 天三種蛋白的表達較染毒第3天明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義（均P<0.05）；另外，第14天時CO組及cmk組三種蛋白的表達較K組顯著，且CO組三種蛋白的表達較cmk組顯著，差異有統(tǒng)計學意義（均P<0.05），見圖3。

圖2 海馬CA1區(qū)NLRP3、cleaved-caspase-1、GSDMD 蛋白免疫印跡結果Fig.2 Western blot results of NLRP3，cleaved-caspase-1，GSDMD protein in hippocampal CA1 region

圖3 NLRP3/GAPDH、cleaved-caspase-1/GAPDH和GSDMD/GAPDH的灰度比值Fig.3 Gradation ratio between NLRP3/GAPDH，cleavedcaspase-1/GAPDH，GSDMD/GAPDH

2.5 免疫組織化學染色檢測海馬CA1 區(qū)caspase-1表達水平 染毒后14 d 發(fā)現，CO 組及cmk 組cas‐pase-1 陽性細胞表達較K 組明顯增多（P<0.05），而cmk組陽性細胞表達較CO組減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖4、表3。

表3 3組大鼠各時間點caspase-1免疫組化表達數值比較（±s，n=3）Tab.3 Comparison of caspase-1 immunohistochemical expression values at each time point in three groups（±s，n=3）

表3 3組大鼠各時間點caspase-1免疫組化表達數值比較（±s，n=3）Tab.3 Comparison of caspase-1 immunohistochemical expression values at each time point in three groups（±s，n=3）

Note：Compared with K group，1）P<0.05；compared with CO group，2）P<0.05；compared with 3 d in CO group，3）P<0.05.

21 d 176.68±28.07 1 246.42±129.231）3）897.01±38.661）2）141.07<0.01 Groups K CO cmk F P 1 d 179.66±32.56 344.64±43.11 273.42±28.59 16.50<0.05 3 d 168.91±23.47 798.50±22.96 665.00±48.90 285.46<0.01 7 d 174.42±16.05 543.56±38.90 328.17±8.84 167.33<0.01 14 d 180.78±20.28 1 700.26±225.291）3）983.72±33.811）2）99.41<0.01

圖4 3 組大鼠各時間點海馬CA1 區(qū)caspase-1 陽性細胞表達Fig.4 Expression of caspase-1 positive cells in hippocam?pal CA1 region of rats in three groups at each time point

2.6 IL-1β 及IL-18 含量 CO 組及cmk 組IL-1β 及IL-18 的表達趨勢相似，均在第14 天時表達最為顯著，如圖5。

圖5 3組大鼠各時間點IL-1β和IL-18表達變化Fig.5 Expression changes of IL-1β and IL-18 at each time point in three groups

3 討論

COOKSON 等［8］首次提出細胞焦亡的概念，經典焦亡途徑依賴于caspase-1 介導。細胞焦亡相關因子在阿爾茨海默病、帕金森病、重度抑郁、多發(fā)性硬化等疾病的發(fā)病機制中已有一定的研究［9-12］。作為細胞焦亡的效應分子，通常情況下，pro-caspase-1 作為caspase-1 前體存在于細胞中；在各種損傷因素刺激下，pro-caspase-1 在被激活的NLRP3 炎癥小體作用下裂解成為caspase-1，活化的caspase-1 隨后將GSDMD蛋白裂解為GSDMD-N蛋白，并促進pro-IL-1β及pro-IL-18 成熟與釋放，這對機體自我保護作用具有重要意義［13］。被半胱天冬酶切割的底物決定了細胞的死亡性質，而caspase-1 介導的細胞焦亡需要對GSDMD 進行切割，GSDMD 被切割后形成有致焦亡成孔活性的GSDMD-N，GSDMD-N 的成孔機制涉及入膜的劇烈構象變化［14-15］。

人類認知障礙與中樞神經系統(tǒng)炎癥反應相關。研究證明，七氟醚引起的術后神經炎癥和認知功能障礙可通過ChⅣ干預NLRP3/caspase-1 途徑得到改善［16］。佘顏等［17］研究發(fā)現，相較于皮質區(qū)，細胞焦亡的激活在海馬區(qū)持續(xù)時間更長。因此本文重點從caspase-1 介導的經典焦亡途徑出發(fā)，分析CO 中毒后各個時間點細胞焦亡在海馬的表達情況。

本研究表明焦亡相關蛋白NLRP3、cleaved-cas‐pase-1 和GSDMD 的表達趨勢一致，在染毒第1 天開始增加，第3 天達到峰值，第7 天有所下降，染毒第14 天上升到另一峰值，第21 天時再次減少，與ZHANG 等［18］研究相似。發(fā)生這種趨勢可能的解釋是，CO 中毒后急性應激反應致NLRP3、caspase-1、GSDMD 等蛋白在第1~3 天時反應性升高并快速達到高峰，以啟動機體固有免疫反應達到保護機體的作用。但染毒后7 d 海馬神經細胞焦亡的持續(xù)、過度激活的發(fā)生，使得焦亡蛋白在染毒第14天又上升到另一峰值并達到最大值，通過時間依賴性誘導后續(xù)級聯反應導致繼發(fā)性腦損傷。使用caspase-1 特異性抑制劑Ac-YVAD-cmk 后，cmk 組各時間點焦亡因子表達均低于CO 組，隨著細胞焦亡的抑制，也導致IL-1β 和IL-18 的釋放減少，減輕了炎癥因子所介導的炎癥作用，使得cmk組大鼠行為學改變較CO組有所改善。研究表明，海馬突觸的可塑性可被TNF-α和IL-1β 通過神經元特異性機制直接抑制，而IL-18則通過間接機制導致海馬神經元細胞損傷［19］。通過使用IL-1β 功能性抑制劑或IL-1β 受體拮抗劑可減輕大鼠術后學習記憶功能障礙和術后神經炎癥［20］。因此，本實驗中cmk 組大鼠行為及認知功能改善可能是由于抑制caspase-1 后導致炎癥因子釋放減少、作用減弱所致。

綜上，本實驗證明細胞焦亡參與了DEACMP 的發(fā)生，中毒早期，焦亡因子反應性升高，快速啟動機體固有免疫反應以應對急性損傷。隨著時間推移，海馬區(qū)神經細胞在持續(xù)、過度的焦亡激活下發(fā)生炎癥級聯放大反應，導致大鼠行為及認知功能發(fā)生改變從而出現遲發(fā)性腦病。對細胞焦亡提前進行干預可以在一定程度上改善遲發(fā)性腦病大鼠的行為和認知功能，有望在未來成為治療DEACMP 的新靶點，但其相關機制尚需更深層次的研究探討。