段賢捷，翁海燕，沈國棟，司呈云，安星妃，章禮玉，周 瑜

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)約占口腔頜面部惡性腫瘤的90%左右，具有很強的侵襲性和隱匿性，1990—2017年，我國口腔鱗癌新發(fā)病例增長280.0%，病死人數(shù)增長196.8%[1]。盡管治療水平一直不斷進步，多學科討論模式也在持續(xù)發(fā)展，但OSCC患者的總體生存率并未得到顯著改善[2]。準確的診斷和預后標志物有助于改善OSCC患者的預后，然而這方面的研究尚不完善，仍需繼續(xù)篩選出與OSCC相關的新的生物標志物。

泛素樣含PHD和環(huán)指域1(ubiquitin like with PHD and ring finger domains 1，UHRF1)，也被稱為ICBP90，是DNA甲基化和組蛋白修飾之間的重要聯(lián)系[3]。UHRF1的分子結構包含多個功能域，可以通過其獨特的SET和環(huán)指相關蛋白結構域與組蛋白去乙酰化酶1和DNA甲基轉移酶1形成復合物[4]，并將DNA甲基化模式復制到新合成的DNA中，以調(diào)節(jié)組蛋白修飾和DNA甲基化[5]。研究已證實UHRF1在多種惡性腫瘤如肝母細胞瘤、肺癌、膀胱癌、食管鱗狀細胞癌等中高表達，可被用作診斷、治療和預后效果評估的生物標志物[6-9]。UHRF1的高表達可以促進癌細胞的增殖、降低腫瘤細胞的凋亡水平并調(diào)節(jié)各種癌細胞的遷移、侵襲[10]。

這些研究表明，UHRF1是一個有價值的預后生物標志物，但迄今為止，UHRF1在口腔鱗癌發(fā)生、發(fā)展及預后中的作用尚不清楚。因此，我們對UHRF1在口腔鱗癌組織中的表達水平及其對預后的影響進行分析，了解UHRF1在口腔鱗癌中的表達情況及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2008年12月至2016年12月間，于中國科學技術大學附屬第一醫(yī)院口腔頜面外科接受手術治療的OSCC病例資料共210例。納入標準包括：①年齡>18周歲；②病理證實的原發(fā)性口腔黏膜鱗狀細胞癌；③病理資料完整；④術后隨訪資料完整。排除標準包括：①復發(fā)性或轉移性腫瘤；②術前接受過放射治療；③無法獲得完整的臨床資料或術后失訪。根據(jù)以上標準，共計111例患者納入研究。本研究符合醫(yī)院倫理委員會的倫理標準，并已獲得倫理委員會的批準(批件號：2022KY倫審第036號)。

1.2 免疫組織熒光染色

所有患者的病理石蠟切片均從醫(yī)院病理科獲得，腫瘤組織的石蠟切片固定在帶電載玻片上，在二甲苯溶液中脫蠟，使用乙醇溶液再水化。抗原修復及血清封閉后，應用UHRF1特異性一級抗體(1∶200稀釋；abs136449；中國上海Absin)滴加在標本上，4 ℃孵育過夜，加入相應二抗，DAPI復染細胞核。使用Ⅸ71熒光顯微鏡(奧林巴斯，日本)對兩種抗原的定位及定量分析，并采集圖片。腫瘤浸潤前沿(Invasive tumor front，ITF)定義為位于腫瘤與宿主組織和器官交界處的3～6層細胞或散在浸潤的細胞團，癌旁正常組織為距離腫瘤邊緣>1 cm的正常組織。

1.3 浸潤深度的測量

所有腫瘤石蠟切片的病理標本均由兩名的頭頸病理學專家單獨進行評估，并通過數(shù)字顯微鏡和計算機(奧利巴斯生物顯微鏡，BX53F，日本)測量浸潤深度。浸潤深度按照國際公認的標準，其定義為：從鄰近正常黏膜基底膜距腫瘤侵襲最前沿的垂直距離。具體測量是根據(jù)口腔鱗癌患者腫瘤標本的HE染色切片，連接距離腫瘤兩側最近正常黏膜上皮的基底膜做一條直線，將此直線至腫瘤侵襲最深處的垂直距離作為浸潤深度。

1.4 染色結果判定及分組依據(jù)

染色結果均由兩位頭頸病理學專家單獨觀察，通過免疫反應強度分布指數(shù)(immunoreactivity intensity distribution index, IRIDI)進行定量分析。IRIDI是染色強度的評分與陽性細胞分布的評分的乘積[11]。染色強度得分如下，不染色：0分；染色：1分；中等染色：2分；強染色：3分。陽性細胞分布得分如下：陽性細胞<5%，0分；6%～25%陽性細胞，1分；26%～50%陽性細胞，2分；51%～75%陽性細胞，3分；陽性細胞超過75%，4分。對于每個樣本，最終得分是5個隨機視野的IRIDI平均值。根據(jù)IRIDI，我們按患者UHRF1表達水平分為低表達組(得分≤4)和高表達組(得分>4)。

1.5 預后指標

病理淋巴結陽性是術中行選擇性頸淋巴結清掃，術后病理顯示清掃的頸淋巴結有癌細胞累及；術后局部復發(fā)和頸淋巴結轉移的標準為手術后至少3個月以上發(fā)生的由組織病理學證實的局部腫瘤再生或頸部淋巴結轉移[12]。

1.6 統(tǒng)計學分析

統(tǒng)計軟件采用SPSS(26.0，IBM)進行數(shù)據(jù)分析，計量資料采用方差分析，組間比較使用LSD法分析，分類資料采用卡方檢驗，精準檢驗使用Fisher確切概率法。運用Kaplan-Meier法分析口腔鱗癌組織中UHRF1表達水平對患者生存時間的影響，組間差異采用Log-rank方法比較。采用Cox比例風險模型對影響口腔鱗癌患者預后的危險因素進行分析，計算危險比(hazard ratios，HR)。若P<0.05則認為結果具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 UHRF1在口腔鱗癌中的表達

UHRF1在口腔鱗癌組織中表達如圖1所示，在111例口腔鱗癌患者的組織切片中，UHRF1在腫瘤組織中明顯高表達。使用方差分析比較了腫瘤組織與癌旁正常組織、以及腫瘤組織與腫瘤侵襲前沿的UHRF1表達水平的差異，結果顯示，腫瘤組織的UHRF1表達水平較癌旁正常組織(P<0.001)或腫瘤侵襲前沿(P<0.001)均顯著增高(圖1)。

口腔鱗癌患者癌旁正常組織(A)、腫瘤侵襲前沿(B)及腫瘤組織(C)HE染色切片；口腔鱗癌患者癌旁正常組織(D)、侵襲前沿(E)及腫瘤組織(F)UHRF1蛋白免疫熒光染色切片；G：患者腫瘤組織、侵襲前沿及正常組織UHRF1表達差異。****為P<0.0001

2.2 UHRF1表達水平與患者臨床病理特征的關系

我們根據(jù)染色結果，將患者分為UHRF1高表達組和低表達組，其中高表達組66例，占59.5%；低表達組45例，占40.5%?；颊叩呐R床病理特征及其與UHRF1表達的關系如表1所示，與UHRF1表達水平相關的臨床病理特征包括：患者的性別(P=0.014)、腫瘤大小(P=0.024)及浸潤深度(P<0.001)。

表1 UHRF1表達水平與患者基本臨床病理特征的關系

2.3 UHRF1表達水平對患者術后局部復發(fā)的影響

入組患者中出現(xiàn)腫瘤術后局部復發(fā)的共有40人，占36.0%。UHRF1高表達組患者術后腫瘤局部復發(fā)有33人，復發(fā)率為50.0%，低表達組復發(fā)7人，復發(fā)率為15.6%。使用Fisher確切概率法比較兩組患者術后局部復發(fā)的差異，結果如圖2所示，UHRF1高表達的患者其術后復發(fā)率明顯高于低表達組(P<0.001)。

***：P<0.001

2.4 UHRF1表達水平對患者頸淋巴結轉移的影響

本研究中，出現(xiàn)術后頸淋巴結轉移的患者共20例，占18.0%，其中UHRF1高表達組中，頸淋巴結轉移的患者有16例，占24.2%；低表達組術后頸淋巴結轉移4例，占8.9%。使用Fisher確切概率法比較兩組患者頸淋巴結轉移的差異，結果如圖3所示，高表達組的頸淋巴結轉移率明顯高于低表達組(P=0.046)。

*：P<0.05

2.5 UHRF1表達水平對患者病理淋巴結陽性的影響

入組患者術中接受選擇性頸淋巴結清掃的有83人，19人病理淋巴結陽性，占22.9%。其中，UHRF1高表達組中18人病理淋巴結陽性，占所有病理淋巴結陽性患者的94.7%。使用Fisher確切概率法比較兩組患者病理淋巴結陽性的差異，結果顯示，在UHRF1高表達組與低表達組患者之間，病理淋巴結陽性率存在顯著差異(36.0%vs.3.0%，P<0.001，圖4)。

***：P<0.001

2.6 UHRF1表達水平對患者生存率的影響

UHRF1表達水平對患者生存率的影響如圖5所示，使用Log rank比較兩組間生存率的差異，結果顯示，UHRF1高表達組與低表達組之間，患者的5年總體生存率(33.3%vs.73.3%，P<0.001)、疾病特異性生存率(37.3%vs.76.7%，P<0.001)和無疾病生存率(28.8%vs.71.1%，P<0.001)均存在明顯差異。

UHRF1低表達組與高表達組患者總體生存率(A)、疾病特異性生存率(B)及無疾病生存率(C)之間的差異(P<0.001)

2.7 Cox風險回歸模型

在單變量分析中，浸潤深度的大小(P=0.001)、UHRF1表達(P<0.001)、隱匿性淋巴結陽性(P=0.005)、術后局部復發(fā)(P<0.001)及術后頸淋巴轉移(P<0.001)均與患者的生存率有關(表2)。通過單變量分析，我們篩選出與患者生存率相關的危險因素進行多變量分析，結果顯示，腫瘤組織的UHRF1表達水平(P=0.002)、頸淋巴結轉移(P<0.001)及術后局部復發(fā)(P<0.001)是影響患者生存率的重要危險因素(表3)。

表2 患者單變量Cox回歸分析

表3 患者多變量Cox回歸分析

3 討 論

口腔鱗狀細胞癌(OSCC)是頭頸部鱗狀細胞癌的重要組成部分，其發(fā)病率占全身惡性腫瘤的3%～5%[13]。盡管治療技術和理念在不斷進步，但口腔鱗癌的總體生存率并沒有顯著改善。術后復發(fā)及轉移是導致患者手術失敗的主要原因，一旦出現(xiàn)復發(fā)或轉移，患者的生存率則明顯下降[14]。因此，如何控制術后復發(fā)及轉移是改善患者預后的關鍵。

影響口腔癌患者預后的主要因素包括腫瘤的發(fā)生部位、大小、病理分級、浸潤深度(depth of Invasion，DOI)、淋巴結外擴展(extranodal extension，ENE)、神經(jīng)周侵犯(perineural invasion，PNI)、脈管栓塞、切緣陽性等[15]。但在臨床上發(fā)現(xiàn)，即使一些預后指標良好的口腔癌患者，術后復發(fā)及頸淋巴結轉移率也很高。因此，影響口腔鱗癌預后的指標可能遠不止以上這些。隨著對口腔鱗癌生物學分子機制的探索，許多影響腫瘤侵襲與增殖的相關分子也被用于指導患者的治療及預后，如DLX6、CLDN17等[16-17]。而大量的研究顯示，UHRF1在許多惡性腫瘤中高表達，并與腫瘤的轉移、侵襲、增殖等惡性行為密切相關[6-9]，但是UHRF1在OSCC中的表達及功能研究甚少。

本研究通過免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)UHRF1在OSCC腫瘤組織中明顯高表達(P<0.001)，UHRF1表達水平與患者的性別、腫瘤大小及浸潤深度有關(P<0.05)。另外，浸潤深度已被納入第八版TNM分期系統(tǒng)，對口腔癌患者的頸淋巴結轉移、術后局部復發(fā)及生存率有很好的預測作用，是影響患者預后的重要危險因素[18]。而本研究數(shù)據(jù)表明，UHRF1高表達的患者，其浸潤深度也較高(P<0.001)。其次，數(shù)據(jù)顯示，患者的性別也與UHRF1表達水平有關，男性患者的UHRF1表達水平明顯高于女性患者(P=0.014)，這可能與男性患者吸煙量多于女性有關。據(jù)報道，安徽省30歲以上的男性吸煙人數(shù)比例高達57.6%，而女性僅為5.8%[19]。在Unoki等[7]的研究中也發(fā)現(xiàn)，UHRF1在男性患者中的表達水平顯著高于女性患者，且與患者的吸煙有關，這與本研究結果發(fā)現(xiàn)一致。

腫瘤的轉移與復發(fā)是導致口腔鱗癌患者預后不良的主要因素[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，UHRF1的表達水平與患者的術后局部復發(fā)(P<0.001)及頸淋巴結轉移密切相關(P=0.046)。UHRF1高表達的口腔癌患者通常存在著較高的術后局部復發(fā)率及頸淋巴結轉移率，因此對于UHRF1高表達的患者，應給予更為積極的治療方式，包括同期頸淋巴結清掃或增加術后輔助治療，提高患者的生存率。

為提高患者生存率，如何在早期識別出頸部轉移及何時選擇頸淋巴清掃術尤為重要，因為即使是早期OSCC中仍約有20%的頸部隱匿性淋巴結轉移無法發(fā)現(xiàn)[20]。對轉移風險較大的OSCC患者，可以在術中選擇頸淋巴結清掃，提高患者術后的生存率。本研究入組患者共有83例術中行頸淋巴結清掃，術后19例病理示淋巴結陽性，其中18例的UHRF1高表達。數(shù)據(jù)顯示UHRF1表達水平與病理淋巴結陽性有顯著關系(P<0.001)，UHRF1高表達的口腔鱗癌患者，其病理淋巴結陽性率也較高。通過分析OSCC患者中UHRF1表達水平與生存率之間的相關性，結果顯示，UHRF1高表達的OSCC患者的5年總體生存率、疾病特異性生存率和無疾病生存率均顯著低于低表達組的患者(P<0.001)。在單變量分析中，UHRF1表達水平、浸潤深度、病理淋巴結陽性、術后局部復發(fā)及術后頸淋巴結轉移影響患者生存率的暴露因素(P<0.05，表2)。而多變量分析結果顯示，UHRF1表達水平(HR：2.93，95%CI：1.48～5.81，P=0.002)、術后頸淋巴結轉移(HR：2.75，95%CI：1.56～4.83，P<0.001)及術后局部復發(fā)(HR：3.20，95%CI：1.81～5.68，P<0.001)是影響患者生存率的危險因素，UHRF1作為影響OSCC患者生存率的重要危險因素，其高表達組死亡風險是低表達組的2.93倍。

目前，UHRF1在腫瘤中的作用尚存在爭議。盡管大量的研究表明，高表達的UHRF1與患者的不良預后有關[6-9]，但在肝癌細胞中發(fā)現(xiàn)，UHRF1缺陷型的癌細胞，可以誘導上皮間充質(zhì)轉化的發(fā)生，從而增加細胞的增殖、遷移及侵襲能力[21]。而我們的研究結果顯示，UHRF1在口腔鱗癌腫瘤組織中表達水平明顯高于侵襲前沿及癌旁正常組織(P<0.001)。在口腔鱗癌患者中，UHRF1的高表達的意味著更高的腫瘤局部復發(fā)率及頸淋巴結轉移率(P<0.05)，這些患者的生存率也明顯降低(P<0.001)，UHRF1可以作為口腔鱗癌重要的預后指標。但UHRF1引起口腔鱗癌發(fā)生、發(fā)展、遷移、侵襲等生物學行為的機制還需進一步探索。