陳清偉 張偉仁 李慶龍 李榮華，3，* 母昌考，3 王春琳，3 宋微微，3

（1寧波大學(xué)海洋學(xué)院應(yīng)用海鮮生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，浙江寧波 315211；2浙江海洋高效健康養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江寧波 315211；3農(nóng)業(yè)農(nóng)村部綠色海水養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗室（省部共建），浙江寧波 315211）

類固醇激素在維持生命、調(diào)控生殖功能、機(jī)體發(fā)育等方面具有重要作用［1］。雄激素是一類含有雄烷基結(jié)構(gòu)的類固醇類物質(zhì)的總稱，由19個碳原子構(gòu)成［2］。已有研究表明，雄激素是脊椎動物生物體脂質(zhì)代謝［3］、腦神經(jīng)調(diào)節(jié)［4］和生殖發(fā)育［5］重要的參與者。

在脊椎動物的脂肪代謝中，雄激素與雄激素受體結(jié)合后會直接或間接影響脂肪細(xì)胞的增殖分化、脂肪分解等，使得生物體脂肪含量發(fā)生改變［6］。睪酮（testosterone，T）可通過增強(qiáng)線粒體能量代謝來降低脂肪含量［7］。雄激素對蛋白質(zhì)代謝也具有重要作用，在雄激素受體介導(dǎo)下，雄激素可促進(jìn)骨骼肌蛋白質(zhì)合成及肌肉質(zhì)量增長［8］。丙酸睪酮（testosterone propionate，TP）是以17β丙酸酯形式合成的睪酮衍生物，在脊椎動物血漿中可迅速被水解成游離睪酮，發(fā)揮雄激素調(diào)節(jié)功能［9］。有研究發(fā)現(xiàn)，閹割后的小鼠精囊大部分氨基酸濃度顯著提高，但經(jīng)丙酸睪酮注射后可恢復(fù)正常［10］。目前，已在擬穴青蟹（Scylla paramamosain）［11］、巴倫支海紅帝王蟹（Paralithodes camtschaticus）［12］和中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）［13］等多種甲殼動物中檢測到雌、雄性激素的存在，且性激素含量隨生長發(fā)育呈波動變化。但關(guān)于性激素對甲殼動物氨基酸和脂肪酸代謝方面影響的研究較少。

三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）屬于節(jié)肢動物門（Arthropoda），甲殼綱（Crustacea），十足目（Decapoda），梭子蟹科（Portunidae），是我國重要的經(jīng)濟(jì)蟹類。目前，關(guān)于三疣梭子蟹體內(nèi)的性激素種類及其發(fā)揮的作用尚鮮有報道。本研究比較了投喂含不同水平丙酸睪酮的飼料對三疣梭子蟹氨基酸和脂肪酸組成的影響，以期為外源性激素對無脊椎動物氨基酸和脂肪酸代謝影響的相關(guān)研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗用三疣梭子蟹蟹苗于2021年6月購自浙江省寧波市奉化區(qū)臭皮匠水產(chǎn)養(yǎng)殖場，選取健康的450只Ⅰ期三疣梭子蟹幼蟹，購回后用鹽度22的消毒海水暫養(yǎng)。試驗飼料為天邦全熟化配合飼料，購自廣東天邦飼料科技有限公司（風(fēng)干基礎(chǔ)：粗蛋白40%、粗脂肪6%、粗纖維5%、粗灰分18%、總磷1.2%、賴氨酸2%、水12%）；試驗用丙酸睪酮購自上海麥克林生化科技有限公司，其有效成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%（以C22H32O3計）。

1.2 主要儀器

2AB電熱鼓風(fēng)干燥機(jī)，天津泰斯特儀器有限公司；LX0711箱式高溫電阻爐，天津萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；NAI-6索氏抽提脂肪測定儀，上海那艾實(shí)驗儀器有限公司；KA-1A自動定氮儀，上海本昂科學(xué)儀器有限公司；1290-6460液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀、1260高效液相色譜儀，美國Agilent公司；BR4I離心機(jī)、Trace1310 ISQ氣相色譜-質(zhì)譜儀，美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 飼料制作將丙酸睪酮粉末溶于無水乙醇中，在飼料表面均勻噴灑，制備成濃度為200（TP 200）和400 mg·kg-1的丙酸睪酮飼料（TP 400），對照組（TP 0）不添加丙酸睪酮粉末，在干燥陰涼處自然通風(fēng)過夜晾干，使酒精充分揮發(fā)。于-20℃條件下干燥密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 喂養(yǎng)試驗選擇規(guī)格整齊、活力好的C1期三疣梭子蟹450只［初始體質(zhì)量（0.02±0.00）g］，隨機(jī)分成3個試驗組，設(shè)1個對照組和2個處理組，每個試驗組均設(shè)3個重復(fù)組，每個重復(fù)投放50只幼蟹，養(yǎng)殖于9個綠色帆布池（長×寬×高=150 cm×100 cm×60 cm）中，每一只幼蟹均有獨(dú)立的養(yǎng)殖筐（圖1）。對照組投喂經(jīng)無水乙醇處理后未添加丙酸睪酮的試驗飼料，試驗組分別投喂含有200和400 mg·kg-1丙酸睪酮的飼料，養(yǎng)殖周期為90 d。試驗期間，每天按體質(zhì)量的5%投喂飼料，根據(jù)前一天的攝食量調(diào)整投喂量，并于60 min后將殘餌清理干凈。每天08：00和15：00各投喂1次，并記錄蛻殼情況。試驗期間對角充氧，各組試驗水體每天換水量為30%（廢水收集由專人處理）。鹽度維持在22～23，平均水溫為20～25℃，溶解氧高于6.0 mg·L-1，pH值為7.0～7.5，氨氮含量低于0.10 mg·L-1，亞硝酸鹽氮含量低于0.01 mg·L-1。試驗結(jié)束后，每只個體均先測量生長指標(biāo)后取血清、肌肉和肝胰腺。血清于4℃過夜24 h后，離心取得上清儲存于-80℃冰箱，其余樣品取得后立即放入-80℃冰箱儲存，用于相關(guān)指標(biāo)測定。

圖1 三疣梭子蟹養(yǎng)殖設(shè)施Fig.1 Equipment of P.trituberculatus culture

1.3.3 生長及表觀性狀的測定按照高天龍等［14］的測量方法，隨機(jī)挑選各組存活個體逐一用游標(biāo)卡尺測量全甲寬（full carapace width，F(xiàn)CW）、甲寬（carapace width，CW）、體長（body length，BL）、體高（body height，BH）、大 螯 長 節(jié) 長（fixed finger length of the claw，F(xiàn)FLC）、大螯不動指長（meropodit length of the claw，MLC）和第一步足長節(jié)長（meropodit length of the first peraeopod，MLFP），精確到0.01 mm；用電子天平稱量體重（body weight，BW），精確到0.01 g。根據(jù)測定的數(shù)據(jù)計算增重率（weight gain rate，WGR）、特定生長率（specific growth rate，SGR）、肝胰腺指數(shù)（hepatosomatic index，HIS）；根據(jù)統(tǒng)計的三疣梭子蟹死亡情況計算成活率（survival rate，SR）。各指標(biāo)計算公式［15］如下：

式中，W0、Wt分別為三疣梭子蟹的初始體質(zhì)量和終末體質(zhì)量，g；Wh為肝質(zhì)量，g；Nf、Ni分別為試驗開始和結(jié)束時三疣梭子蟹的尾數(shù)；t為養(yǎng)殖天數(shù)，d。

1.3.4 體組成含量測定肌肉和肝胰腺的水分含量按照常壓干燥法測定［16］；粗蛋白含量按照凱氏定氮法測定［17］；粗脂肪含量采用索氏抽提法測定［18］；粗灰分含量采用第一法測定［19］。

1.3.5 血清性激素含量測定采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀測定梭子蟹血清中的TP、T和雌二醇（estradiol，E2）含量。移取100μL樣品，加100μL乙腈溶液，渦旋，4℃、15 000 r·min-1條件下離心10 min，取上清用50μL初始流動相稀釋，過膜上機(jī)測定。色譜參數(shù)：C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm），柱溫35℃，流動相A為0.1%甲酸-水，流動相B為乙腈，梯度洗脫條件為0～0.5 mm，70% A，3% B；0.5～3.5 min，40% A，60% B；3.5～4.5 min，10% A，90% B；4.5～6.5 min，10% A，90% B；6.5～6.6 min，70% A，30% B。進(jìn)樣量5 μL，流速0.3 mL·min-1。

1.3.6 氨基酸含量測定氨基酸含量測定參考《GB/T 5009.124-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸含量的測定》［20］，在水解管中放入適當(dāng)質(zhì)量的樣品，加入20 mL 6 mol·L-1的HCl溶 液，采 用 高 效 液 相 色 譜 儀測定。

1.3.7 脂肪酸含量測定脂肪酸含量測定參考劉磊等［21］的方法，稱取適當(dāng)質(zhì)量的樣品，以十九烷酸甲酯為內(nèi)標(biāo)，通過氣相色譜-質(zhì)譜儀測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用Levene法對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗，當(dāng)不滿足齊性方差時對百分比數(shù)據(jù)進(jìn)行反正弦或平方根處理。采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）檢驗方法比較不同處理組的差異，P<0.05表示差異顯著。試驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。采用Graphpad Prism 8軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 血清激素含量變化

由表1可知，對照組和試驗組血清中均未檢測出TP，且對照組血清中未檢出T和E2。試驗組T和E2含量均隨飼料中TP添加水平的提高而升高，且T含量高于E2含量。

表1 不同丙酸睪酮水平下三疣梭子蟹血清中激素含量Table 1 Serum hormoneof P.trituberculatus at different testosterone propionate levels /（μg·L-1）

2.2 三疣梭子蟹生長、存活指標(biāo)和蛻殼間期比較

由表2可知，TP飼料投喂對三疣梭子蟹的生長和成活均產(chǎn)生顯著影響（P<0.05）。TP 200組WGR和SGR顯著高于對照組，TP 400組顯著低于對照組。蛻殼間期分析結(jié)果表明（表3），TP 200組蛻殼間期最短，僅TP 200組與TP 400組在Ⅵ～Ⅶ期蛻殼間期有顯著差異（P<0.05），其余各時期不同處理間的蛻殼間期均無顯著差異。由表4可知，TP對三疣梭子蟹各形態(tài)性狀產(chǎn)生了不同影響，TP 200組多項生長指標(biāo)顯著高于對照組及TP 400組。

表2 不同丙酸睪酮水平下三疣梭子蟹生長和成活比較Table 2 Comparison of growth and survival of P.trituberculatus at different testosterone propionate levels

表3 不同丙酸睪酮水平下三疣梭子蟹蛻殼間期Table 3 Molting interphase of P.trituberculatus at different testosterone propionate levels /d

表4 不同丙酸睪酮水平下三疣梭子蟹形態(tài)性狀的比較Table 4 Comparison of morphological characters of P.trituberculatus at different testosterone propionate levels

2.3 丙酸睪酮對三疣梭子蟹體組成的影響

三疣梭子蟹肌肉和肝胰腺營養(yǎng)組成分析結(jié)果顯示（圖2），僅TP0和TP 400組間肝胰腺粗脂肪含量呈現(xiàn)顯著差異，TP 0組的粗脂肪含量最高，TP 400組最低。

圖2 不同丙酸睪酮水平下三疣梭子蟹肌肉和肝胰腺的體組成fig.2 Proximate composition in the muscle and hepatopancreas of P.trituberculatus at different testosterone propionate levels

2.4 丙酸睪酮對肌肉和肝胰腺中的氨基酸含量的影響

由表5可知，三疣梭子蟹肌肉中共檢測到17種氨基酸。僅TP0組精氨酸（Arg）含量分別與TP 200和TP 400組存在顯著差異。隨著飼料中丙酸睪酮水平的提高，三疣梭子蟹肌肉Arg和總氨基酸含量呈下降趨勢。肝胰腺中共檢測到17種氨基酸（表6）。有4種氨基酸（丙氨酸、賴氨酸、組氨酸及精氨酸）含量在各處理間整體存在顯著差異，其中TP 200組丙氨酸（Ala）和組氨酸（His）含量顯著高于TP 0組；TP 400組賴氨酸（Lys）含量顯著低于其余組；TP 0組精氨酸（Arg）含量顯著高于TP 200組。

表5 不同丙酸睪酮水平下三疣梭子蟹肌肉氨基酸含量Table 5 Amino acid in muscle of P.trituberculatusat different testosterone propionate levels/（g·100 g-1）

表6 不同丙酸睪酮水平下三疣梭子蟹肝胰腺氨基酸含量Table 6 Amino acid in hepatopancreas of P.trituberculatus at different testosterone propionate levels/（g·100 g-1）

2.5 丙酸睪酮對肌肉和肝胰腺脂肪酸含量的影響

三疣梭子蟹肌肉中共檢測到18種脂肪酸（表7），其中飽和脂肪酸有6種，單不飽和脂肪酸有4種，多不飽和脂肪酸有8種。各組間脂肪酸的組成和含量均無顯著差異。肝胰腺中共檢測到21種脂肪酸（表8），其中飽和脂肪酸有7種，單不飽和脂肪酸有6種，多不飽和脂肪酸有8種。在飽和脂肪酸（saturated fatty acid，SFA）中，TP 0組的C16：0、C18：0和C20：0顯著高于其余組。在單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acid，MUFA）中，TP 0組的C18：1n9c、C20：1和C22：1N9顯著高于其余組（P<0.05）。在多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）中，TP 0組的C18：2n6c顯著高于其余組；TP 0組的C20：2、C20∶5n3和C22∶6n3顯著高于TP 400組；TP 0組的C20∶4n6顯著高于TP 200組。多不飽和脂肪酸和高度不飽和脂肪酸總量均隨丙酸睪酮添加量的提高呈下降趨勢，但無顯著差異。

表7 不同丙酸睪酮水平下三疣梭子蟹肌肉脂肪酸含量Table 7 Fatty acid in muscle of P.trituberculatus at different testosterone propionate levels /（g·100 g-1）

表8 不同丙酸睪酮水平下三疣梭子蟹肝胰腺脂肪酸含量Table 8 Fatty acid in hepatopancreas of P.trituberculatus at different testosterone propionate levels/（g·100 g-1）

3 討論

3.1 丙酸睪酮對三疣梭子蟹血清性激素的影響

甲殼動物體內(nèi)具有微量的E2和T，已在多種蟹類體內(nèi)檢測出。Huang等［11］研究發(fā)現(xiàn)雌性擬穴青蟹（Scylla paramamosain）血淋巴中E2濃度在發(fā)育早期最低（18.48 pg·mL-1），隨著生長發(fā)育進(jìn)程的推進(jìn)，E2濃度開始增加，接近成熟階段時達(dá)到峰值（75.42 pg·mL-1），雄性擬穴青蟹在成熟階段的血淋巴T濃度達(dá)到峰值（607 pg·mL-1）。Dvoretsky等［12］研究發(fā)現(xiàn)巴倫支海紅帝王蟹（Paralithodes camtschaticus）血淋巴中同時存在T和E2，T和E2含量范圍分別在0.08～1.39 g·mL-1和217.70～100.10 pg·mL-1之間。在中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）中也有相關(guān)的研究報道，血淋巴的E2含量范圍為31.91～180.74 pg·mL-1［13］。本研究中，對照組未檢測到性激素，可能與試驗蟹處于性腺發(fā)育早期、體內(nèi)的性激素含量較少有關(guān)，但試驗組檢測到較高的性激素含量，表明三疣梭子蟹具有較強(qiáng)的性激素富集能力。

對脊椎動物的研究表明，性激素及其衍生物在體內(nèi)存在轉(zhuǎn)化途徑，如TP作為一種睪酮酯，在血漿中可迅速被水解成游離T［22］，從而促使血清睪酮含量增高；同時，T經(jīng)芳香化酶催化可以轉(zhuǎn)化為E2［23-24］。本研究試驗組血清中未檢測到飼料添加物TP，但存在較高的T含量，同時，試驗組中檢測到較高的E2含量，可能也與雄激素及其衍生物在體內(nèi)的轉(zhuǎn)化及代謝通路有關(guān)。在岸蟹（Carcinus maenas）的睪丸和輸精管中存在一種17-β羥基類固醇還原酶，可將雄烯二酮還原成T，將E1還原成E2，但該過程不可逆［25］。本研究試驗組三疣梭子蟹血清中雌雄性激素含量檢測結(jié)果表明，三疣梭子蟹中可能存在與脊椎動物類似的激素轉(zhuǎn)換機(jī)制，但其性激素合成與代謝的具體途徑還需進(jìn)一步深入研究。

3.2 丙酸睪酮對三疣梭子蟹生長性能的影響

在對魚類的研究中發(fā)現(xiàn)，一定量的雄激素可通過調(diào)節(jié)生長激素（growth hormone，GH）和胰島素樣生長因子（insulin-like growth factors，IGFs）的表達(dá)等途徑促進(jìn)魚類生長［26］。本研究結(jié)果表明，添加不同濃度的TP對三疣梭子蟹的生長產(chǎn)生了不同的影響，低濃度組（TP 200）三疣梭子蟹生長指標(biāo)顯著提高，但高濃度組（TP 400）生長指標(biāo)顯著降低，形態(tài)測量結(jié)果也表明，TP 200組多項生長指標(biāo)顯著高于對照組及TP 400組。Alam等［27］在對非洲鯰的研究中發(fā)現(xiàn)，高濃度（100 mg·kg-1）TP飼料投喂試驗魚，40 d增重顯著高于對照組；但高濃度（125 mg·kg-1）TP飼料投喂試驗魚卻在體重上與對照組無顯著差異，表明激素對生長的調(diào)控作用存在劑量依賴效應(yīng)。有研究表明，性類固醇激素對不同物種生長性能的影響具有性別差異。例如，在尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）中，長期注射E2明顯促進(jìn)雌魚生長，但對雄魚的生長無顯著影響［26］；麥穗魚（Pseudorasboraparva）暴露于100和200 ng·L-1濃度的17α-甲基睪酮21 d后，可以顯著抑制雄魚的生長，但對雌魚無顯著影響［28］。而在本試驗中，各組三疣梭子蟹雌雄個體在生長上并無顯著差異，因此在生長數(shù)據(jù)統(tǒng)計中合并進(jìn)行分析。蛻殼是甲殼動物生長的關(guān)鍵，本研究中，TP對蛻殼間期無顯著性影響，但有研究表明在高濃度E2（500 μg·L-1）中暴露14 d的糠蝦（Americamysis bahia）累計蛻皮周期總數(shù)顯著減少，且總長度和體重顯著下降［29］，表明外源性激素也會對甲殼類動物蛻皮過程產(chǎn)生影響，具體調(diào)控機(jī)制可能與激素的種類和劑量有關(guān)。

3.3 丙酸睪酮對三疣梭子蟹氨基酸和脂肪酸組成的影響

雄激素可調(diào)控骨骼肌蛋白質(zhì)代謝，促進(jìn)骨骼肌蛋白質(zhì)合成［30］。有研究指出，T可以激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號途徑的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK1/2），而被激活的ERK1/2可引起細(xì)胞生長相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化，從而調(diào)節(jié)骨骼肌生理代謝過程［30］。大鼠細(xì)胞試驗發(fā)現(xiàn)，雌激素也促進(jìn)了肌細(xì)胞的增殖分化，抑制蛋白質(zhì)分解［31］。在本試驗中，含有較高雄激素及雌激素的試驗組肌肉的粗蛋白含量高于對照組，但差異不顯著。雖然試驗組和對照組肌肉及肝胰腺的總氨基酸含量無顯著差異，但試驗組肌肉和肝胰腺中的Arg含量均顯著低于對照組。Arg是目前發(fā)現(xiàn)的動物細(xì)胞內(nèi)功能最多的氨基酸［32］，具有調(diào)控蛋白質(zhì)合成與動態(tài)平衡及生長發(fā)育、調(diào)節(jié)動物機(jī)體消化吸收脂溶性物質(zhì)、降低動物機(jī)體血糖水平、刺激生長激素分泌和協(xié)同平衡脂肪代謝等功能［32-33］。Arg作為一氧化氮（nitric oxide，NO）的底物，通過產(chǎn)生NO來調(diào)節(jié)脂肪酸和氨基酸的代謝，而NO作為一種信號分子，可刺激肝臟中的脂肪酸氧化，抑制脂質(zhì)合成［34］。本研究中，肝胰腺Arg和脂肪酸同時下降可能是由于Arg作為底物不斷被催化成NO，從而抑制了脂肪酸的合成。但有關(guān)性激素與Arg代謝、蛋白質(zhì)調(diào)控的機(jī)制還有待進(jìn)一步的深入研究。

肝臟是動物脂質(zhì)代謝的主要場所。研究表明，在脊椎動物中，雄激素有抑制脂肪形成和脂質(zhì)合成的作用［6］，雄激素通過提高肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶（carnitine palmitoyltransferase-I，CPT1）的mRNA表達(dá)水平，增加脂肪酸在線粒體中的氧化，提供能量，從而降低脂肪水平［35］；雌激素也在脂肪代謝中起到重要調(diào)控作用，Jones等［36］建立了一種雌激素缺乏小鼠模型，研究表明雌激素缺乏的小鼠肝臟脂肪積累增加。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，試驗組血清檢出了較高的雌雄性激素含量，同時試驗組肝胰腺多種脂肪酸（如C16：0、C18：0、C18：1n9c、C20：1等）與對照組相比顯著降低，表明飼料中添加丙酸睪酮在一定程度上抑制了三疣梭子蟹肝胰腺中脂肪酸的合成以及體組成中粗脂肪的積累，性激素在無脊椎動物中可能具有與脊椎動物相似的調(diào)控脂肪代謝機(jī)制。

4 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，TP投喂提高了三疣梭子蟹體內(nèi)的T和E2含量，外源性激素對三疣梭子蟹的生長、氨基酸及脂肪酸代謝產(chǎn)生不同影響。與對照組相比，TP 200組成活率顯著降低，增重率顯著提高；TP 200和TP 400組三疣梭子蟹肌肉和肝胰腺中總氨基酸含量無顯著差異，但精氨酸含量均顯著降低；試驗組肌肉脂肪酸的組成和含量無顯著差異，但肝胰腺中多種脂肪酸含量顯著降低，粗脂肪含量也呈下降趨勢。表明飼料中添加TP在一定程度上抑制了三疣梭子蟹肝胰腺中脂肪酸的合成以及體組成中粗脂肪的積累，性激素在無脊椎動物中可能具有與脊椎動物相似的轉(zhuǎn)換代謝機(jī)制，但具體的轉(zhuǎn)換機(jī)制以及激素對肝胰腺脂肪酸合成的影響機(jī)制均有待進(jìn)一步深入研究。