許永華，李美琪，周新芳，張建勛，孫天尊，趙 露

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118)

1970年，Mitchell等首次從油菜花粉中篩選和分離出具有高生理活性的物質(zhì)[1]；1978年，Mandava從油菜花粉中分離純化出蕓薹素(brassin)；1979年，Grove等對(duì)其分子立體構(gòu)型進(jìn)行了鑒定，確定其為多羥基類固醇化合物，命名為油菜素內(nèi)酯(Brassinolide，BL)，之后又分離出許多與BL分子結(jié)構(gòu)相似的化合物，統(tǒng)稱為油菜素甾醇類化合物(BR)[2-6].BR均具有4個(gè)環(huán)的5-α-膽甾烷，是繼生長(zhǎng)素、赤霉素、細(xì)胞分裂素、脫落酸、乙烯之后發(fā)現(xiàn)的植物激素.

BR能夠調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)器官生長(zhǎng)，參與調(diào)節(jié)植物莖的伸長(zhǎng)[3]，調(diào)控植物側(cè)根及根毛的生長(zhǎng)[4]、維管束分化、種子萌發(fā)，還能夠提高植物對(duì)干旱、冷害、鹽脅迫等逆境脅迫的抗性.

BR生物合成經(jīng)由鯊烯還原到油菜素內(nèi)酯前體蕓苔甾醇(campesterol，CR)，以CR為起始，經(jīng)過(guò)至少3條途徑，即早期C-6氧化途徑、晚期C-6氧化途徑、早期C-22和C-23羥化途徑合成油菜素甾酮(castasterone，CS)和油菜素內(nèi)酯.其中，有些步驟存在可逆反應(yīng)，但反應(yīng)機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究[7-9].

擬南芥DWF4基因編碼一個(gè)類固醇類C-22α-羥化酶，催化油菜素內(nèi)酯的生物合成過(guò)程[10].該基因在植物活躍生長(zhǎng)的組織中表達(dá)，如根與莖的頂端組織以及根與莖的接合部位，表達(dá)量受乙烯和茉莉酸甲酯的調(diào)控，參與植物的抗高溫反應(yīng)過(guò)程[11].

DWF4缺失突變體是從擬南芥突變體庫(kù)中篩選矮小表型突變體時(shí)篩選到的[12]，它的表型都是BR缺失的表型，即植株矮小、顏色深綠、葉柄縮短、蓮座葉縮小變圓、角果及花絲縮短，成熟的花粉不能授粉到柱頭上導(dǎo)致雄性不育[13].DWF4缺失表型不能被赤霉素和生長(zhǎng)素恢復(fù)，只能被BR特異性恢復(fù)，所以認(rèn)為它可能參與BR的合成.蛋白序列同源性比對(duì)分析顯示，DWF4編碼一個(gè)細(xì)胞色素P450蛋白，因此也被命名為CYP90B1，它與之前發(fā)現(xiàn)的CYP90A1(CPD)有43%的一致性[8].

對(duì)本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的人參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行的分析發(fā)現(xiàn)，人參Pg90B/724B基因是擬南芥DWF4基因的同源基因，該基因編碼一個(gè)C22-α-羥化酶，為蕓苔素內(nèi)酯生物合成途徑中的一個(gè)限速酶，該蛋白是CYP90B基因家族中的成員.王若宸[14]對(duì)小麥BR生物合成基因TaDWF4進(jìn)行的鑒定與功能研究發(fā)現(xiàn)，小麥中至少存在兩個(gè)具有DWF4功能的基因；司建萍[15]對(duì)胡楊油菜素類固醇合成酶基因DWF4和CPD的功能研究發(fā)現(xiàn)，在調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育方面，PeDWF4的作用與AtDWF4的作用可能存在差異；Jun Sakaguchi等[16]的研究表明，用光處理擬南芥地上組織可增強(qiáng)DWF4在根尖的積累；Yuya Yoshimitsu等[17]研究發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)素誘導(dǎo)的側(cè)根伸長(zhǎng)受到油菜素唑和DWF4突變的抑制，而這一結(jié)果最終導(dǎo)致油菜素內(nèi)酯的表達(dá)被抑制，表明BRs在生長(zhǎng)素控制下對(duì)根伸長(zhǎng)有積極作用.DWF4轉(zhuǎn)錄除了在BR穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮作用，在與根伸長(zhǎng)相關(guān)的BR-生長(zhǎng)素串?dāng)_中也發(fā)揮新的作用.S.Choe等[18]研究發(fā)現(xiàn)，煙草DWF4過(guò)表達(dá)品系與對(duì)照組相比，花序增高、長(zhǎng)角果數(shù)增加、種子數(shù)量增加，DWF4過(guò)表達(dá)導(dǎo)致內(nèi)源性油菜素內(nèi)酯增加.Tingsong等[19]研究發(fā)現(xiàn)，玉米幼苗中ZmDWF4在芽中的表達(dá)遠(yuǎn)高于根中，ZmDWF4在玉米中的表達(dá)受到外源油菜素內(nèi)酯的影響顯著下調(diào)；ZmDWF4的過(guò)表達(dá)可以使DWF4突變體的缺陷(如植株矮小、葉柄縮短和雄性不育)都恢復(fù)到正常水平.

Tanaka等[20]研究發(fā)現(xiàn)，高濃度外源BR處理擬南芥時(shí)，BR的關(guān)鍵合成基因DWF4，CPD，BR6ox1和ROT3表達(dá)下調(diào).據(jù)Noguchi[21]研究報(bào)道，在BRI1突變體中，除DWF4表達(dá)下調(diào)外，其他BR的關(guān)鍵合成基因表達(dá)均無(wú)明顯變化，表明BRs合成受到負(fù)反饋調(diào)節(jié).張燕娣等[22]研究發(fā)現(xiàn)，單莖人參與多莖人參中油菜素內(nèi)酯含量分別為0.24和0.85 ng/g，多莖人參中油菜素內(nèi)酯含量顯著高于單莖人參，而多莖人參中Pg90B/724B基因在轉(zhuǎn)錄組中表達(dá)為下調(diào)；此外，多莖人參中人參皂苷含量及礦質(zhì)元素中大量元素的含量均高于單莖人參.

人參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示的油菜素內(nèi)酯生物合成途徑中，90B/724B基因、734A基因均為關(guān)鍵基因，在多莖人參和單莖人參中的轉(zhuǎn)錄具有顯著差異，90B/724B基因在多莖人參中下調(diào)轉(zhuǎn)錄，734A基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)和轉(zhuǎn)錄下調(diào)同時(shí)存在.這些基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯表達(dá)對(duì)人參植株油菜素內(nèi)酯的生物合成有重要影響，因此本文將人參90B/724B基因命名為Pg90B/724B.

本文對(duì)T1代擬南芥植株以及瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人參葉片進(jìn)行干旱脅迫處理，測(cè)定了可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸、丙二醛、葉綠素、超氧化物歧化酶(SOD)等逆境應(yīng)答生理指標(biāo)的變化情況，以探究Pg90B/724B基因過(guò)表達(dá)植株在干旱脅迫下的生理反應(yīng).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

擬南芥(Arabidopsisthaliana)種子采購(gòu)自ABRC(擬南芥生物資源中心)，4℃處理72 h后，在人工氣候箱中種植.生長(zhǎng)條件為16 h光照、8 h黑暗，22℃.培養(yǎng)基質(zhì)V(草炭土)∶V(蛭石)=3∶1.

人參材料來(lái)自吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)人參育種溫室，3年生植株.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染時(shí)，每株處理2枚葉片；生理指標(biāo)測(cè)定時(shí)，每株人參取1～2枚葉片.用于生理指標(biāo)測(cè)定的材料為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的人參葉片和非轉(zhuǎn)染的人參葉片.

主要試劑：克隆載體pMD19-T、植物轉(zhuǎn)化載體pRI201-AN購(gòu)自寶生物工程有限公司；乙酰丁香酮、牛肉浸膏、卡那霉素等購(gòu)自上海生工.

引物：P1：ATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGAACACG；

P2：CATACCCTTTGTACCGAACATCTTTCACAGC.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1Pg90B/724B基因克隆及表達(dá)載體構(gòu)建

從本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的人參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選得到Pg90B/724B基因序列，用PCR法克隆該基因，構(gòu)建pMD19-T-Pg90B/724B亞克隆載體.用限制性內(nèi)切酶Nde I和Sal I對(duì)目的基因及pRI201表達(dá)載體同時(shí)進(jìn)行雙酶切，將目的片段與pRI201載體再連接，獲得重組載體pRI201-AN-Pg90B/724B，電擊法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404.

1.2.2 重組DNAPg90B/724B瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人參葉片及轉(zhuǎn)染葉片鑒定

用葉片打孔法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人參葉片.挑取根癌農(nóng)桿菌LBA4404(Pg90B/724B+)單克隆搖菌，至菌液D(600)=2.0時(shí)終止培養(yǎng).用注射器吸取菌液在人參葉片上打孔，48 h后采樣.用qRT-PCR方法檢查人參葉片Pg90B/724B基因相對(duì)表達(dá)量，18SrRNA為內(nèi)參基因.

1.2.3 重組DNA pRI201-AN-Pg90B/724B異源轉(zhuǎn)染擬南芥及突變體篩選

采用花粉管導(dǎo)入法轉(zhuǎn)染擬南芥.用新鮮制備的農(nóng)桿菌LBA4404(Pg90B/724B+)菌液充分浸沒(méi)擬南芥花序，花序上的菌液保留24 h后用無(wú)菌超純水洗去殘余菌液；吸干表面水分后將植株移至人工氣候箱中，在22℃，16 h光照、8 h黑暗條件下培養(yǎng)至種子成熟.將收獲的擬南芥種子，4℃低溫處理3 d后進(jìn)行消毒，于篩選培養(yǎng)基(含卡那霉素)上播種，發(fā)芽7 d后根據(jù)幼苗顏色挑選抗性植株.將有抗性的綠色轉(zhuǎn)基因植株(T1代)移栽到營(yíng)養(yǎng)缽中，在22℃，16 h光照、8 h黑暗條件下培養(yǎng)4周后進(jìn)行生理實(shí)驗(yàn).

抗性植株鑒定：從獲得的T1代植株中隨機(jī)取10株擬南芥，PCR法鑒定是否為Pg90B/724B基因陽(yáng)性植株.Pg90B/724B基因相對(duì)表達(dá)量測(cè)定采用qRT-PCR法，18SrRNA為內(nèi)參基因.

1.2.4 干旱脅迫處理

干旱分為大氣干旱、土壤干旱和生理干旱，本實(shí)驗(yàn)采用大氣干旱脅迫方法.將瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的人參與未轉(zhuǎn)染的人參連同營(yíng)養(yǎng)缽移入植物培養(yǎng)箱中，30℃全光照處理2 h，培養(yǎng)箱內(nèi)空氣相對(duì)濕度低于20%.

將長(zhǎng)勢(shì)良好的野生型擬南芥和T1代轉(zhuǎn)基因植株同樣移入全光照培養(yǎng)箱中，30℃處理2 h，培養(yǎng)箱內(nèi)空氣相對(duì)濕度低于20%.

1.2.5 干旱脅迫下植株生理指標(biāo)檢測(cè)

可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定；可溶性糖含量采用蒽酮比色法測(cè)定；脯氨酸含量采用茚三酮比色法測(cè)定；丙二醛含量采用硫代巴比妥酸比色法測(cè)定；超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍(lán)四唑法測(cè)定；葉綠素含量采用乙醇提取比色法測(cè)定.

2 結(jié)果與分析

2.1 Pg90B/724B基因克隆及表達(dá)載體構(gòu)建結(jié)果

從人參越冬芽中提取總RNA，變性瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖1a.特異引物RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1b，顯示目的片段長(zhǎng)度約750 bp，與預(yù)期長(zhǎng)度一致.將目的片段PCR產(chǎn)物與pMD19-T連接，得到重組載體，命名為pMD19-T-Pg90B/724B.轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后提取質(zhì)粒DNA，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖1c，顯示質(zhì)粒DNA長(zhǎng)度為3 500 bp左右，符合預(yù)期.

a.人參總RNA電泳圖；b.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖；c.pMD19-T-Pg90B/724B重組質(zhì)粒DNA電泳圖；d.pRI201-AN-Pg90B/724B重組質(zhì)粒DNA雙酶切(PstⅠ和SacⅠ)產(chǎn)物電泳圖；e.農(nóng)桿菌LBA4404(pRI201-Pg90B/724B+)鑒定

將NdeI和SalI雙酶切的pMD19-T-Pg90B/724B及pRI201載體連接，得到重組pRI201-Pg90B/724B表達(dá)載體.Pst I和Sac I雙酶切重組DNA，得到10 300 bp和1 700 bp左右的片段，接近目的條帶分子大小(見(jiàn)圖1d)，表明Pg90B/724B基因的植物表達(dá)載體構(gòu)建完成.

將重組DNA pRI201-Pg90B/724B電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，隨機(jī)挑取5個(gè)陽(yáng)性克隆，搖菌并提取質(zhì)粒DNA，目的片段PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1e，5個(gè)單克隆均獲得750 bp左右的條帶，表明農(nóng)桿菌LBA4404轉(zhuǎn)化成功.

2.2 重組DNA Pg90B/724B瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人參葉片及轉(zhuǎn)染鑒定結(jié)果

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染處理2 d后，在不同人參植株上分別取轉(zhuǎn)染處理的葉片共10枚，對(duì)轉(zhuǎn)染葉片進(jìn)行PCR鑒定，電泳結(jié)果見(jiàn)圖2a，均檢測(cè)出目的基因片段.轉(zhuǎn)染處理的人參葉片，以18SrRNA為內(nèi)參基因，qRT-PCR法檢測(cè)基因相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果見(jiàn)圖2b.人參葉片瞬時(shí)轉(zhuǎn)染7 d后，打孔處可見(jiàn)黃白色圓斑(見(jiàn)圖2c).

a.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人參葉片RT-PCR鑒定；b.Pg90B/724B基因在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人參葉片中的相對(duì)表達(dá)；c.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染7 d后的人參葉片

2.3 重組DNA Pg90B/724B異源轉(zhuǎn)染擬南芥及陽(yáng)性植株鑒定

對(duì)花粉管導(dǎo)入法得到的轉(zhuǎn)基因擬南芥種子進(jìn)行鑒定.在LB(Kan+)培養(yǎng)基上播種低溫處理后的種子，每皿約2 000粒，22℃、16 h光照、8 h黑暗條件下培養(yǎng)4 d.如圖3a所示，轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株呈綠色，發(fā)育正常，可見(jiàn)2～4枚真葉；非轉(zhuǎn)基因幼苗呈淡黃色、纖弱，生長(zhǎng)停滯，僅有2枚子葉，真葉不發(fā)育.在播種的約170 000粒種子中共得到21株陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株(T1)，轉(zhuǎn)化率約為0.12%.

從T1代擬南芥中隨機(jī)選取10株，以35SF(P1)和90BR(P2)為引物進(jìn)行目的片段擴(kuò)增，對(duì)Pg90B/724B轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行分子鑒定.RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見(jiàn)圖3b，其中1道和6道、10道未檢出目的片段，與抗性基因篩選結(jié)果不一致，需要進(jìn)一步檢測(cè)確認(rèn)；2，3，4，5，7，8，9道有清晰條帶，且分子大小與預(yù)期長(zhǎng)度相符，表明這些植株為Pg90B/724B陽(yáng)性植株，與抗性基因篩選結(jié)果一致，可以確認(rèn)為Pg90B/724B基因陽(yáng)性植株T1代.

以18SrRNA為內(nèi)參基因，qRT-PCR法對(duì)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株進(jìn)行Pg90B/724B基因相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖3c.其中，1為野生型擬南芥(Col)，2—6為轉(zhuǎn)基因植株(Col)，可見(jiàn)在Pg90B/724B過(guò)表達(dá)突變體中，Pg90B/724B基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平不同程度增加，表明T1代突變體中Pg90B/724B基因整合基因組后未引起該基因沉默，基因可以表達(dá)并可能具有生理功能.

a.LB(Kan+)培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株；b.T1代擬南芥Pg90B/724B+鑒定；c.Pg90B/724B基因在擬南芥T1植株中的相對(duì)表達(dá)

2.4 干旱脅迫下瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人參葉片的生理應(yīng)答

植物在受到干旱脅迫時(shí)，一些蛋白質(zhì)的合成會(huì)受到抑制，蛋白質(zhì)含量或是蛋白質(zhì)與氨基酸的比值會(huì)降低；而有些植物卻與此相反，在受到逆境脅迫時(shí)會(huì)產(chǎn)生逆境蛋白，蛋白質(zhì)含量表現(xiàn)為升高.Pg90B/724B基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的人參葉片可溶性蛋白質(zhì)和脯氨酸含量較非轉(zhuǎn)化葉片略有升高(見(jiàn)圖4)，但差異并不顯著，提示Pg90B/724B基因過(guò)表達(dá)可促進(jìn)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸和相關(guān)逆境蛋白的合成，但應(yīng)答干旱脅迫的生理活性可能仍然有限.而過(guò)表達(dá)Pg90B/724B基因的人參葉片，短時(shí)間內(nèi)可溶性糖和超氧化物歧化酶(SOD)含量顯著上升，提示該基因?qū)扇苄蕴羌翱寡趸负铣傻拇龠M(jìn)作用更顯著.干旱脅迫對(duì)膜系統(tǒng)氧化損傷的修復(fù)則依賴于超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化酶的作用.由圖4可見(jiàn)，過(guò)表達(dá)Pg90B/724B基因的人參葉片丙二醛含量顯著升高，表明其膜系統(tǒng)被氧化損傷的更為嚴(yán)重，但與此同時(shí)抗氧化酶SOD的含量也顯著升高，表明其去除活性氧損傷的修復(fù)活性顯著提高.此外，干旱脅迫處理后過(guò)表達(dá)Pg90B/724B基因的人參葉片葉綠素含量略有降低(見(jiàn)圖4).

Wt為未轉(zhuǎn)染人參葉片，Pg90b/724b+為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的人參葉片；Chla：葉綠素a，Chlb：葉綠素b，Chlt：總?cè)~綠素.

2.5 擬南芥突變體(Pg90b/724b+，T1)對(duì)干旱脅迫的生理應(yīng)答

對(duì)篩選出的T1代Pg90B/724B基因過(guò)表達(dá)突變體和野生型擬南芥進(jìn)行干旱脅迫處理，測(cè)定在脅迫應(yīng)答反應(yīng)中兩種類型植株的生理指標(biāo)變化，探究Pg90B/724B基因在逆境脅迫時(shí)發(fā)揮的生理作用，結(jié)果見(jiàn)圖5.由圖5可見(jiàn)，在干旱脅迫條件下Pg90b/724b+過(guò)表達(dá)突變體(T1)的細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可溶性糖、游離脯氨酸以及逆境誘導(dǎo)蛋白——可溶性蛋白質(zhì)含量顯著升高，是野生型植株的2～3倍，提示過(guò)表達(dá)突變體可能具有較高的油菜素內(nèi)酯水平，能更快速響應(yīng)脅迫信號(hào)并調(diào)控細(xì)胞快速合成具有保水功能的小分子糖、氨基酸和蛋白質(zhì)，增加細(xì)胞中束縛水比例，防止細(xì)胞因高溫和干燥而過(guò)度蒸騰失水.此外，Pg90b/724b+過(guò)表達(dá)突變體(T1)也表現(xiàn)出很高的葉綠素水平，總?cè)~綠素含量是野生型植株的4倍以上，葉綠素a和葉綠素b含量分別是野生型植株的4.5倍和4.6倍，推測(cè)干旱脅迫對(duì)過(guò)表達(dá)突變體的葉綠素合成影響較小或葉綠素降解較為緩慢，光合色素?fù)p傷程度有限.這或許是油菜素內(nèi)酯增強(qiáng)植物抗逆性的一種表現(xiàn).

Wt為野生型擬南芥(Col)，Pg90b/724b+(T1)為擬南芥T1突變體；Chla：葉綠素a，Chlb：葉綠素b，Chlt：總?cè)~綠素.

在干旱脅迫條件下，Pg90b/724b+過(guò)表達(dá)突變體(T1)丙二醛含量顯著上升，是野生型植株的4.7倍，表現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞膜系統(tǒng)被氧化損傷的趨勢(shì).而超氧化物歧化酶(SOD)水平只有野生型植株的1.8倍左右，與丙二醛含量增長(zhǎng)相比并不匹配.提示在過(guò)表達(dá)突變體中，超氧化物歧化酶含量升高有限，對(duì)活性氧清除能力有限，造成了膜系統(tǒng)損傷、丙二醛含量升高.這種表現(xiàn)可能與過(guò)表達(dá)突變體中油菜素內(nèi)酯水平較高細(xì)胞生理活動(dòng)及代謝處于活躍狀態(tài)，在干旱脅迫時(shí)更容易受到損傷有關(guān)；另一種可能是目標(biāo)基因的插入位置直接影響了超氧化物歧化酶的表達(dá)，使活性氧清除受到影響，造成細(xì)胞損傷.

3 結(jié)論與討論

本文利用同源植物瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和異源植物穩(wěn)定轉(zhuǎn)染兩種方法，對(duì)Pg90B/724B基因在干旱脅迫時(shí)的生理應(yīng)答進(jìn)行了研究.植物在干旱脅迫下，主要的調(diào)節(jié)機(jī)制為滲透調(diào)節(jié)，這些響應(yīng)機(jī)制并非單一調(diào)節(jié)而是同時(shí)進(jìn)行調(diào)節(jié)，其中之一就是植物會(huì)限制水分的消耗.可溶性蛋白作為植物滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，能夠保護(hù)細(xì)胞膜且有保水作用[23-24].在本實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)基因擬南芥及瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的人參葉片的可溶性蛋白含量均高于野生型擬南芥及未轉(zhuǎn)染的人參葉片，說(shuō)明在干旱脅迫過(guò)程中，Pg90B/724B基因可能通過(guò)參與油菜素內(nèi)酯的合成調(diào)節(jié)、促進(jìn)可溶性蛋白的產(chǎn)生、積累，從而使轉(zhuǎn)基因植株對(duì)干旱脅迫具有更好的耐受能力和抗性.而脯氨酸作為參與植物滲透調(diào)節(jié)過(guò)程中最有效的滲透調(diào)節(jié)物之一，水和能力強(qiáng)，可與蛋白質(zhì)結(jié)合防止蛋白質(zhì)脫水變性，在植物抗逆境脅迫過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用.轉(zhuǎn)基因植株和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的人參葉片中脯氨酸含量相比于未轉(zhuǎn)染的野生型植株和人參葉片均有升高，說(shuō)明T1代植株和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的人參葉片在干旱脅迫中積累了更多的脯氨酸，能更好地對(duì)抗干旱脅迫.可溶性糖為植物代謝活動(dòng)的主要參與者，含量升高有助于植物體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸和儲(chǔ)存[25-26]，同時(shí)作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在逆境脅迫時(shí)發(fā)揮作用[27].研究表明，T1代植株與瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的人參葉片中，可溶性糖的含量與未轉(zhuǎn)染的人參葉片及野生型植株相比均有增加，證明轉(zhuǎn)基因植株具有更強(qiáng)的保水能力，增加了植株對(duì)于干旱的耐受性.植物遭受干旱脅迫時(shí)的反應(yīng)與低溫脅迫一樣，會(huì)產(chǎn)生大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)，造成膜的氧化損傷，而超氧化物歧化酶(SOD)與過(guò)氧化氫酶(CAT)、過(guò)氧化物酶(POD)可清除活性氧，降低活性氧的毒害作用，在植物抗逆過(guò)程中起著重要的作用.T1代植株與瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的人參葉片SOD含量均高于未轉(zhuǎn)染的野生型植株和人參葉片，表明Pg90B/724B基因可能會(huì)增強(qiáng)植物的抗氧化能力.

丙二醛是細(xì)胞膜氧化產(chǎn)物，其含量高低可以表征細(xì)胞膜受損傷的程度，是逆境脅迫下考察植物受損傷程度的重要指標(biāo)[28].在干旱脅迫過(guò)程中，細(xì)胞膜發(fā)生氧化分解，促使丙二醛大量積累.本文的研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因擬南芥及瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的人參葉片丙二醛含量高于野生型擬南芥及非轉(zhuǎn)染的人參葉片，造成這種現(xiàn)象的原因有待于在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的T3代純合體植株中進(jìn)行進(jìn)一步的探究.

植物的葉綠素與植物的光合作用和營(yíng)養(yǎng)狀況有著密切的聯(lián)系[29]，葉綠素含量的高低直接影響著光合作用的強(qiáng)弱.當(dāng)植物遭遇干旱脅迫時(shí)，由于失水導(dǎo)致葉綠素含量降低.本文的研究結(jié)果表明，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的人參葉片和未轉(zhuǎn)染的人參葉片葉綠素含量無(wú)顯著差異，但T1代植株與野生型植株相比葉綠素含量存在極顯著差異，葉綠素含量在轉(zhuǎn)基因擬南芥中升高，表明T1代植株在干旱脅迫時(shí)仍保持一定的光合作用能力.

總之，通過(guò)對(duì)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的人參葉片及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的擬南芥突變體進(jìn)行的分析可知，人參Pg90B/724B基因可能參與了干旱脅迫條件下對(duì)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成的調(diào)節(jié)，增強(qiáng)植物的保水性進(jìn)而增強(qiáng)植物在干旱脅迫中的耐受性，一定程度上提高了植株的耐旱能力.