姚俊勝， 楊 波， 楊 光， 曹洪偉， 王劍宇

（上海理工大學(xué) 健康科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200093）

米糠是稻米脫殼過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，其中含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素、膳食纖維等營養(yǎng)物質(zhì)[1]。米糠油是將米糠用壓榨或溶劑浸出等方法進(jìn)行處理后獲取的，其不飽和脂肪酸含量達(dá)80%以上，且主要為油酸和亞油酸，富含甾醇、微生物E、谷維素等多種生物活性成分，是世界公認(rèn)的健康營養(yǎng)油[2-3]。

酪蛋白酸鈉是一種被廣泛研究、和商業(yè)相關(guān)的食品材料，它可以提供蛋白質(zhì)，并且具有良好的乳化性和耐熱性，可用于改善食品材料的粘性和凝膠特性[4]。宮曉玥等[5]利用酪蛋白酸鈉減小了椰奶粒徑、增大了ζ-電位從而減少了界面張力，使椰奶的穩(wěn)定性得到提高。

超聲波由于具有較強(qiáng)的穿透性[6]，在食品領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用于食品生產(chǎn)、食品改性以及食品分析等方面，尤其是食品乳化加工過程。譬如超聲波乳化技術(shù)通過超聲空化作用處理兩種或兩種以上的不相溶液體，使其中一種被均勻地分散在另一種液體之中，形成乳狀液[7]，能有效改善乳化液的各種穩(wěn)定性。Li等[8]利用超聲波制備大豆油體系的蛋白乳液，乳液的界面性質(zhì)結(jié)構(gòu)和氧化穩(wěn)定性得到增強(qiáng)。王中江等[9]利用超聲波制備的大豆蛋白-磷脂酰膽堿納米乳液，其乳化產(chǎn)率較高，并且具有較好的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性。

乳液在多種食品加工應(yīng)用中起著關(guān)鍵作用，例如奶酪、加工肉制品、烘焙食品等。鑒于米糠油和酪蛋白酸鈉的高營養(yǎng)價(jià)值及米糠油較高的烘焙價(jià)值，本研究以米糠油為油相、以酪蛋白酸鈉為乳化劑，利用超聲波制備乳液，討論乳液制備最佳工藝，為后期應(yīng)用到食品中提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

食品級(jí)酪蛋白酸鈉（山東百思特食品健康有限公司），米糠油（浙江得樂康食品股份有限公司），其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JY98-IIIDN 超聲波破碎儀，上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；DHR-1旋轉(zhuǎn)流變儀，沃特世科技（上海）有限公司；MGL-16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，美瑞克儀器（上海）有限公司；E200生物顯微鏡，尼康儀器（上海）有限公司；UPH-IV-20TNP超純水機(jī)，四川優(yōu)普超純科技有限公司；TDL-80-2B離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；LC-MSH-PRO磁力攪拌器，邦西儀器科技（上海）有限公司；WFJ 7200可見分光光度計(jì)，尤尼柯（上海）儀器有限公司；AL204電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酪蛋白酸鈉添加量對(duì)米糠油乳液的影響

a.米糠油乳液的制備

在50 ml的燒杯中加入10 g米糠油，另取一個(gè)50 ml燒杯加入10 g蒸餾水，酪蛋白酸鈉添加量分別為油水總質(zhì)量的0.4%，0.5%，0.6%，0.7%，0.8%，0.9%。將酪蛋白酸鈉加入到蒸餾水中加熱攪拌1 h，另一個(gè)裝有米糠油的燒杯也同時(shí)以相同的溫度加熱攪拌1 h，攪拌結(jié)束后將兩相混合，利用超聲波破碎儀進(jìn)行超聲處理，超聲功率為240 W，超聲總時(shí)間為1 min 30 s（開4 s，關(guān)6 s），將制備好的乳液用NaOH或HCl將pH值調(diào)至7。每個(gè)處理組做3次重復(fù)。

b.乳化活性的測(cè)定

參考Pearce等[10]提出的比濁法，從新鮮制備的乳液底部吸取50μl的乳液于小燒杯中，并于小燒杯中加入5 ml 0.1%的SDS溶液，混合均勻后用分光光度計(jì)測(cè)定500 nm處的吸光值A(chǔ)0，1%SDS溶液為空白對(duì)照。通過公式計(jì)算得出乳化活性

式中，C為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，g/ml。

c.界面蛋白吸附量的測(cè)定

將Keerati-u-rai等[11]的方法稍作修改，制作的新鮮乳液在10 000 r/min離心30 min，并用注射器將下層清液吸出，測(cè)定清液中的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度。界面蛋白吸附量計(jì)算式為

式中：C0表示乳液中初始蛋白質(zhì)量濃度，g/ml；Cf表示離心后下層清液中的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，g/ml。

d.米糠油乳液黏度的測(cè)定

采用流變儀測(cè)定乳液黏度，取適量米糠油乳液置于40 mm平板上，使其均勻分布。測(cè)試溫度25℃，剪切速率1～300 s-1，總剪切時(shí)間180 s。

e.米糠油乳液平均粒徑及分布的測(cè)定

參照楊貴妃等[12]的方法，用超純水將待米糠油乳液稀釋1000倍，使用激光粒徑儀測(cè)定米糠油乳液的粒徑，平衡時(shí)間為120 s，每組樣品測(cè)定3次，取平均值。

f.米糠油乳液微觀結(jié)構(gòu)的觀察

將制備好的新鮮乳液用攪拌棒拌勻，吸取1 ml乳液加入到10 ml的SDS溶液中，混勻后吸取10μl滴到載玻片上，并蓋好蓋玻片。將制備好的樣片用光學(xué)顯微鏡觀察，選擇10倍目鏡、40倍物鏡觀察，選擇視野清晰、最具代表性的區(qū)域進(jìn)行拍攝。

1.3.2 脂水比例對(duì)米糠油乳液的影響

對(duì)上述米糠油乳液的制備步驟稍作修改，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)固定為0.6%，制作脂水比分別為1∶2，2∶3，1∶1，3∶2，2∶1的乳液，超聲功率為240 W，超聲總時(shí)間為1 min 30 s（開4 s，關(guān)6 s），將制備好的乳液用NaOH或HCl將pH值調(diào)至7。每個(gè)處理組重復(fù)3次。不同脂水比的米糠油乳液的乳化活性、乳液黏度、平均粒徑及分布、乳液微觀結(jié)構(gòu)觀察均同1.3.1。

1.3.3 超聲強(qiáng)度對(duì)米糠油乳液的影響

將米糠油乳液的制備稍作修改，蛋白質(zhì)添加量固定為0.6%，脂水比為3∶2，分別用超聲強(qiáng)度為120，240，360，480，600 W來制備，將制備好的乳液用NaOH或HCl將pH值調(diào)至7。每個(gè)處理組重復(fù)3次。

超聲強(qiáng)度對(duì)界面蛋白吸附量、對(duì)油滴粒徑及分布的影響同前述。超聲強(qiáng)度對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響參照劉瀟[13]的方法稍作修改，乳液在20℃、10 000 g條件下進(jìn)行離心30 min，將離心后的乳析層取出并濾干水分。利用紅外光譜（FTIR）對(duì)濾去水分的乳析層樣品進(jìn)行掃描，采用Peak Fit 軟件對(duì)紅外光譜中的酰胺I區(qū)（1600～1700 cm-1）進(jìn)行處理，根據(jù)Byler等[14]的方法計(jì)算蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次實(shí)驗(yàn)的每個(gè)處理有3個(gè)平行樣。用SPSSStatistics 26和Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用Origin 2021軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酪蛋白酸鈉添加量對(duì)乳化液的影響

2.1.1 酪蛋白酸鈉添加量對(duì)乳化活性的影響

蛋白乳化液油水混合能力即油脂的乳化效果通常采用乳化活性來表征，其代表每單位質(zhì)量的蛋白質(zhì)（g）能夠乳化油脂的表面積（m2）[15]。

在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于0.5%時(shí)，高強(qiáng)度的超聲處理使在油水界面形成的蛋白質(zhì)膜被破壞，不能形成乳液，所以超聲制備乳液的最低蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)起點(diǎn)定為0.5%。圖1給出了蛋白添加對(duì)乳化活性的影響，圖中a?e表示數(shù)據(jù)之間具有顯著性差異（P值小于0.05）。隨著蛋白質(zhì)添加量的增加，乳化活性呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，在水分含量一定的情況下，高濃度的蛋白會(huì)造成無法充分吸水溶脹，反而降低乳化效果。李良等[16]在研究大豆蛋白和乳清蛋白混合濃度變化（1.5%～2.5%）對(duì)乳化活性的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，維持乳狀液高乳化活性蛋白濃度存在最佳濃度點(diǎn)。

圖1 蛋白添加量對(duì)乳化活性的影響Fig.1 Effect of protein addition on emulsifying activity

2.1.2 酪蛋白酸鈉添加量對(duì)界面蛋白吸附量的影響

由圖2可知，超聲波制備的米糠油乳液的界面蛋白吸附量均高于80%，呈現(xiàn)增長趨勢(shì)，隨后趨于平穩(wěn)。蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.8%之后，界面蛋白吸附量逐漸達(dá)到飽和臨界值。超過80%的酪蛋白酸鈉均作用在油水界面上，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加會(huì)使越來越多的蛋白包裹住油滴，甚至形成多層吸附，這有利于界面膜的穩(wěn)定性。Castellani等[17]研究油水乳化界面時(shí)發(fā)現(xiàn)，蛋白覆蓋率高的乳液呈現(xiàn)出更穩(wěn)定的趨勢(shì)，因?yàn)楦叩鞍赘采w率降低了乳化液的界面張力。

圖2 蛋白質(zhì)濃度對(duì)乳化液蛋白吸附量的影響Fig.2 Effect of protein addition on protein adsorption

2.1.3 酪蛋白酸鈉添加量對(duì)乳化液黏度的影響

乳液的黏度與液滴在體系中運(yùn)動(dòng)和遷移的速率有關(guān)，黏度大的乳液中連續(xù)相和分散相的流動(dòng)性差，這樣有利于保持乳液的穩(wěn)定。

圖3是黏度在剪切率1～300 s-1的變化。剪切率為1 s-1時(shí)，蛋白質(zhì)添加量的增加導(dǎo)致乳液黏度的增加，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)量達(dá)到0.8%時(shí)，乳液黏度趨于穩(wěn)定。所有乳液均呈現(xiàn)出剪切變稀的行為，說明該乳液是非牛頓假塑性流體[18]。隨著剪切速率的增加，乳液的黏度減小，各組之間黏度差距逐漸減小，最終趨于平穩(wěn)。李成倍等[19]通過研究酪蛋白酸鈉水溶液發(fā)現(xiàn)隨著蛋白質(zhì)添加量的增加，水溶液的黏度也會(huì)增加。因此，酪蛋白酸鈉溶液本身的黏度越大，制作成乳液之后對(duì)油滴的運(yùn)動(dòng)和遷移限制就越大，有利于體系的穩(wěn)定。

圖3 蛋白質(zhì)添加量對(duì)乳液黏度的影響Fig.3 Effect of protein addition on the viscosity of emulsion

2.1.4 酪蛋白酸鈉添加量對(duì)乳液粒徑及分布的影響

由圖4(a)可知，超聲制備的乳液的平均粒徑均低于10μm，隨著蛋白質(zhì)添加量的增加，油滴的平均粒徑逐漸減小，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到0.8%時(shí)，平均粒徑變化不明顯。蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于0.8%時(shí)，不會(huì)影響平均粒徑的大小，如果想進(jìn)一步減小平均粒徑，可能要采取其他措施。

由圖4(b)可知，隨著蛋白質(zhì)添加量的增加，峰逐漸變窄并向左移動(dòng)，說明乳狀液中的油滴的粒徑在逐漸減小，并且油滴大小逐漸相近且均勻。油滴變得更均勻，因此會(huì)減少油滴的聚合或者大油滴的出現(xiàn)，這樣的乳化液體系會(huì)相對(duì)穩(wěn)定。

2.1.5 酪蛋白酸鈉添加量對(duì)乳液微觀結(jié)構(gòu)的影響

由圖5可見，隨著酪蛋白酸鈉添加量的增加，乳液的液滴大小明顯減小。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)添加量的增加，會(huì)有更多的蛋白質(zhì)將打散的小油滴包裹住。上面分析到界面蛋白吸附量的增加，使更多的蛋白質(zhì)作用在油水表面，導(dǎo)致油滴難以聚合，大油滴的數(shù)量明顯減少。

圖4 蛋白質(zhì)添加量對(duì)乳液平均粒徑（左）及分布（右）的影響Fig.4 Effect of protein addition on the average particle size(left)and distribution(right)of the emulsion

圖 5 不同蛋白質(zhì)添加量的乳液微觀結(jié)構(gòu)觀察Fig. 5 Observation of the microstructure of emulsion with different protein additions

2.2 脂水比例對(duì)乳液的影響

2.2.1 脂水比例對(duì)乳液乳化活性的影響

脂水比對(duì)米糠油乳液的乳化活性影響如圖6所示，隨著油相的增多，乳化活性呈增長趨勢(shì)。由于蛋白質(zhì)含量一定，水相含量越多，蛋白水溶液的濃度越低，油相體積在乳液體系中變少，導(dǎo)致超聲處理后乳液中的油水界面面積減少，乳化活性降低。當(dāng)脂水比達(dá)到2∶1時(shí)，無法制備穩(wěn)定的乳液。這是由于油相體積過大，沒有足夠多的

圖 6 脂水比對(duì)乳化活性的影響Fig. 6 Effect of lipid/water ratio on emulsifying activity

蛋白質(zhì)包裹油滴；另外一個(gè)原因可能是油滴數(shù)量過高，連續(xù)相無法繼續(xù)維持各油滴之間的緩沖作用，無法形成穩(wěn)定的乳液。因此3∶2為最適脂水比。

2.2.2 不同脂水比對(duì)乳液粒徑及分布的影響

如圖7所示，當(dāng)脂水比小于1∶1時(shí)，乳狀液的平均粒徑及分布幾乎沒有差異，當(dāng)脂水比達(dá)到3∶2時(shí)，平均粒徑減小，因?yàn)楫?dāng)油相比例較低時(shí)，會(huì)有較多的蛋白質(zhì)沒有吸附，導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生耗散絮凝，因此粒徑增加。還有一種原因就是油相增多，導(dǎo)致分散在水相中的油滴數(shù)量增多，體系中的更多的蛋白質(zhì)將油滴包裹住，粒徑呈減小趨勢(shì)。

圖 7 脂水比對(duì)乳液平均粒徑及分布的影響Fig.7 Effect of lipid/water ratio on the average particle size and distribution of the emulsion

2.2.3 不同脂水比例的乳液微觀結(jié)構(gòu)觀察

圖8是不同脂水比的米糠油乳液的光學(xué)顯微鏡觀察，樣品a，b，c的分散性明顯高于樣品d，樣品d的油滴比較緊密，并且油滴的大小更加均勻。如圖8(e)所示，當(dāng)脂水比達(dá)到2∶1時(shí)，會(huì)有較大的油脂聚集體，因?yàn)橛偷螖?shù)量增多，單位界面面積可獲得的顆粒數(shù)減少，油滴之間相互擠壓，導(dǎo)致部分油滴變形或破乳，這也驗(yàn)證了2.2.1中的分析。

2.2.4 脂水比例對(duì)乳液黏度的影響

圖8 不同脂水比的乳液的光學(xué)顯微鏡圖Fig. 8 Optical microscope images of emulsions with different lipid/water ratio

圖9脂水比對(duì)乳液黏度的影響Fig.9 Effect of lipid/water ratio on the viscosity of emulsion

圖9 為米糠油乳液的黏度在剪切率1～300 s-1時(shí)的變化。剪切率為1 s-1時(shí)，米糠油乳液中油相增加，乳液的黏度呈增長趨勢(shì)，脂水比在3∶2時(shí)的黏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于脂水比1∶2時(shí)的黏度。由圖可知，隨著剪切率的增加，脂水比3∶2時(shí)的黏度一直遠(yuǎn)大于其余各組。米糠油本身就具有一定的黏度，油相增多導(dǎo)致黏度增大。另一方面，油相體積增多，分布在較少的水相中，導(dǎo)致分散的空間較小，乳滴比較密集，導(dǎo)致乳液黏度增大。Dickinson[20]在研究蛋白質(zhì)穩(wěn)定水包油乳狀液時(shí)發(fā)現(xiàn)，乳液剪切的黏度增加和油滴在乳液體系中的堆疊程度有關(guān)。王小慶等[21]也研究了油相比例對(duì)黑豆分離蛋白乳液的影響，也得出了類似結(jié)論，增加了油相的黑豆分離蛋白乳液，由于油脂分子和蛋白質(zhì)分子之間作用，增強(qiáng)了蛋白質(zhì)分子之間的相互作用，使得蛋白質(zhì)分子之間的連接更加緊密，制成乳液后其黏度逐漸增大。

2.3 超聲強(qiáng)度對(duì)米糠油乳液的影響

2.3.1 超聲強(qiáng)度對(duì)界面蛋白吸附量的影響

如圖10所示，不同超聲強(qiáng)度制備的米糠油乳液的蛋白吸附量均在80%以上。彭松林等[22]用均質(zhì)機(jī)制備蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的大豆油乳液，界面蛋白吸附量僅為33.71%。超聲作用大大提高了乳液的界面蛋白吸附量。一方面是超聲作用導(dǎo)致乳液體系溫度升高，促進(jìn)了蛋白質(zhì)的溶解，體系中可利用的蛋白質(zhì)增多[23]；另一方面是超聲作用使體系中的分散相數(shù)量變多，因此油水界面面積增大，會(huì)有更多的蛋白質(zhì)吸附在油水界面上。羅昭鋒等[24]發(fā)現(xiàn)超聲處理可誘導(dǎo)蛋白聚集，而高壓處理不會(huì)引起聚集。王中江等[9]通過分析濁度與界面蛋白吸附量，發(fā)現(xiàn)超聲處理可部分誘導(dǎo)納米乳液液滴表面蛋白聚集，增加了界面蛋白含量。

圖10 超聲強(qiáng)度對(duì)乳液界面蛋白吸附量的影響Fig.10 Effect of ultrasonic intensity on the absorption of protein on emulsion

隨著超聲強(qiáng)度的增加，界面蛋白吸附量先增加后降低。超聲功率在240～360 W的界面蛋白吸附量最大，但是再提升超聲強(qiáng)度會(huì)降低其吸附量，導(dǎo)致這種情況的原因是超聲強(qiáng)度過大，劇烈的超聲作用影響了蛋白質(zhì)的吸附作用。

2.3.2 超聲強(qiáng)度對(duì)乳液粒徑及分布的影響

圖11給出了超聲強(qiáng)度對(duì)乳液粒徑的影響。由圖11(a)可知，超聲強(qiáng)度升高到240 W后油滴的平均粒徑無明顯差異。由圖11(b)發(fā)現(xiàn)，240 W時(shí)油滴的平均粒徑差異很小，但是超聲波強(qiáng)度的增大會(huì)使粒徑分布曲線變窄，說明高強(qiáng)度超聲波會(huì)使乳液中的油滴粒徑變得更加均勻。Pongsawatmanit等[25]用超聲波處理對(duì)β-乳球蛋白穩(wěn)定的棕櫚水包油乳劑也得到了相似的結(jié)論：超聲波強(qiáng)度可以影響粒徑的大小和分布，增強(qiáng)超聲波強(qiáng)度可以使油滴粒徑變小。

2.3.3 超聲強(qiáng)度對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

圖11 超聲強(qiáng)度對(duì)油滴平均粒徑及分布的影響Fig.11 Effect of ultrasonic intensity on theaverageparticle size and distribution of oil droplets

圖12 不同超聲強(qiáng)度對(duì)酪蛋白酸鈉紅外光譜的影響（波數(shù)1 600～1 700 cm-1）Fig.12 Effect of intensity ultrasound on FTIR of sodium caseinate（wave number1 600～1 700 cm-1）

超聲強(qiáng)度對(duì)酪蛋白酸鈉紅外光譜的影響見圖12。超聲波造成酪蛋白酸鈉的二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化見圖13，主要是β-轉(zhuǎn)角和β-折疊的比例發(fā)生改變，但是進(jìn)一步增加超聲波強(qiáng)度對(duì)酪蛋白酸鈉二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響并不明顯。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化可能有利于蛋白快速遷移到油脂表面，因此巰基和疏水基團(tuán)的暴露使疏水相互作用或者共價(jià)鍵增強(qiáng)，有利于乳液界面的穩(wěn)定。

圖13 超聲強(qiáng)度對(duì)酪蛋白酸鈉二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響Fig.13 Effect of ultrasonic intensity on the secondary structure of ammonium caseinate

3 結(jié)論

通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，酪蛋白酸鈉-米糠油乳液的乳化特性與蛋白添加量、脂水比、超聲強(qiáng)度有關(guān)。

a.蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥0.6%時(shí)，界面蛋白吸附量達(dá)到90%，并且乳液中的油滴平均粒徑較小且分布均勻，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%時(shí)的乳化活性較高，說明蛋白利用率較高，蛋白質(zhì)添加量的增加會(huì)導(dǎo)致乳液黏度的增加。

b.對(duì)黏度影響最大的是脂水比，當(dāng)脂水比達(dá)到3∶2時(shí)，黏度遠(yuǎn)大于其余各組，這與油滴在乳液體系中的堆積有關(guān)。

c.超聲強(qiáng)度大大提高了乳液的各項(xiàng)性質(zhì)，但是超聲強(qiáng)度不宜過高，當(dāng)超聲強(qiáng)度大于360 W時(shí)，界面蛋白吸附量會(huì)下降。超聲強(qiáng)度升高會(huì)使油滴在乳液中的分布更加均勻。超聲波影響了酪蛋白酸鈉的二級(jí)結(jié)構(gòu)，酪蛋白酸鈉的β-轉(zhuǎn)角和β-折疊的比例發(fā)生了變化。

綜上所述，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到0.6%，脂水比為3∶2，超聲強(qiáng)度在240～360 W時(shí)，酪蛋白酸鈉-米糠油乳液的蛋白利用率高且穩(wěn)定性較好。