周 宇，黃在興，鮑興祿，李 晶，劉朋虎*

姬松茸菌褶、擔(dān)孢子及菌絲體微觀形態(tài)觀察

周 宇1,2，黃在興3，鮑興祿4，李 晶2，劉朋虎2*

1. 福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建福州 350002；2. 福建農(nóng)林大學(xué)國家菌草工程技術(shù)研究中心，福建福州 350002；3. 廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院應(yīng)用微生物研究所/廣西大學(xué)食用菌研究所，廣西南寧 530005；4. 福建省武夷山市吳屯鄉(xiāng)鄉(xiāng)村振興發(fā)展中心，福建武夷山 354309

姬松茸（）不僅營養(yǎng)豐富還具有很高的藥用價(jià)值，是一種名貴的食藥用菌，其產(chǎn)業(yè)發(fā)展前景廣闊。但由于姬松茸種質(zhì)資源匱乏，對姬松茸的遺傳背景認(rèn)識不足，阻礙了其雜交育種技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)有的種質(zhì)資源難以滿足實(shí)際生產(chǎn)需要。本研究以姬松茸J1菌株為實(shí)驗(yàn)材料，通過對姬松茸生殖相關(guān)結(jié)構(gòu)進(jìn)行微觀形態(tài)觀察，探究姬松茸相關(guān)的生物學(xué)特性。利用掃描電子顯微鏡和熒光顯微鏡觀察姬松茸不同生長發(fā)育時期菌褶、擔(dān)孢子和菌絲體微觀形態(tài)特征。結(jié)果表明：桑葚期菌褶和菌髓處于發(fā)育階段，菌褶片狀物不明顯；珊瑚期后能明顯觀察到菌褶片狀物，相互平行排列，由菌髓和其兩側(cè)的子實(shí)層組成，排列緊密，厚度均勻，且著生少量擔(dān)子，但菌髓呈不規(guī)則排列；成形期菌褶更為清晰、排列規(guī)整，內(nèi)菌幕未破裂，菌褶間隙包含表面凸起排列的擔(dān)孢子和雜亂的導(dǎo)管狀細(xì)胞，導(dǎo)管狀細(xì)胞緊密關(guān)聯(lián)；成形期菌褶擔(dān)子較為飽滿，有褶皺，擔(dān)子上著生有3個孢子?；?個孢子梗，各擔(dān)孢子之間有細(xì)小的連接絲。通過DAPI對擔(dān)孢子核數(shù)進(jìn)行染色觀察，發(fā)現(xiàn)姬松茸大多數(shù)擔(dān)孢子屬于雙核孢子，少量屬于單核和無核孢子；通過DAPI對菌絲體細(xì)胞核進(jìn)行染色觀察，發(fā)現(xiàn)姬松茸菌絲體屬于多核，有隔膜，但未見鎖狀聯(lián)合。本研究明確了姬松茸不同生長發(fā)育時期的菌褶、擔(dān)子、擔(dān)孢子以及菌絲體的微觀形態(tài)特征，豐富了姬松茸的生物學(xué)研究和生活史過程認(rèn)識，為姬松茸雜交育種、擔(dān)孢子交配型、遺傳轉(zhuǎn)化體系等研究奠定了基礎(chǔ)。

姬松茸；菌褶；擔(dān)孢子；細(xì)胞核

姬松茸（）又名巴西蘑菇、陽光蘑菇、小松菇、巴氏蘑菇等，不僅味道鮮美，營養(yǎng)豐富，還具有多種藥用價(jià)值，在降血脂、抗糖尿病、抗炎、免疫調(diào)節(jié)以及抗癌等方面表現(xiàn)出較好的抑制或治療作用[1-5]。姬松茸在美食、保健、醫(yī)學(xué)和藥學(xué)界受到廣泛關(guān)注。近年來，經(jīng)過引種栽培，姬松茸已在中國、日本、美國、巴西等國家大面積推廣栽培，其產(chǎn)業(yè)發(fā)展總體保持較好勢頭，但同時也面臨產(chǎn)量不穩(wěn)定、重金屬富集能力強(qiáng)、種質(zhì)資源匱乏等問題，阻礙了該產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[6]。

優(yōu)良菌種的選育是解決上述問題的有效手段[6-7]。然而，目前對姬松茸交配型、生活史過程相關(guān)場所的顯微變化等育種相關(guān)的基本生物學(xué)信息的了解十分有限，限制了雜交育種技術(shù)在姬松茸優(yōu)良菌種選育上的應(yīng)用。菌褶作為食用菌擔(dān)孢子的發(fā)育場所，功能性孢子的形成對于食用菌生殖和育種至關(guān)重要；其次，菌褶在蘑菇分類與生活史研究中也具有重要作用。目前，已有眾多學(xué)者關(guān)于食用菌菌絲體、擔(dān)孢子掃描電鏡樣品制備方法的探索，對于不同的食用菌部位和不同的觀察要求，所參考的方法不盡相同[8-10]。但目前尚無姬松茸不同生長發(fā)育階段菌褶、擔(dān)子、擔(dān)孢子以及菌絲體等的顯微結(jié)構(gòu)變化的相關(guān)報(bào)道，本研究運(yùn)用掃描電子顯微和熒光顯微觀察技術(shù)驗(yàn)證并完善姬松茸的不同生長發(fā)育階段的形態(tài)特征，旨在豐富食用菌育種相關(guān)的基礎(chǔ)生物學(xué)研究，以期為遺傳育種、擔(dān)孢子交配型、遺傳轉(zhuǎn)化體系等研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 供試菌株為姬松茸J1，菌株保藏于國家菌草工程技術(shù)研究中心菌種保種室。

1.1.2 培養(yǎng)基 復(fù)壯培養(yǎng)基：馬鈴薯230 g，蔗糖20 g，磷酸二氫鉀2 g，硫酸鎂0.5 g，維生素B1 10 mg，瓊脂20 g/L，加蒸餾水定容至1 L，pH為7。

母種培養(yǎng)基：麥粒100%。

發(fā)酵料配方：稻草35.70%，牛糞14.29%，麩皮13.29%，谷殼35.70%，KH2PO40.02%，CaCO31%。

1.1.3 試劑與儀器 5%戊二醛，0.2 mol/L磷酸緩沖溶液（pH 7.4），1%鋨酸，10 μg/mL DAPI染色液均購于北京蘭杰柯科技有限公司；日立（HITACHI）HCP-2型臨界點(diǎn)干燥儀，日本EIKO IB-5型離子鍍膜儀，日本JEOL JSM-6380LV掃描電子顯微鏡和日本Nikon NI-U熒光顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 子實(shí)體形態(tài)觀察 姬松茸是一類具有菌褶的傘狀真菌。為了下一步的菌褶掃描電子顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)，本研究選取桑葚期、珊瑚期、成形期和成熟期4個不同發(fā)育時期為觀察對象[11]。不同時期子實(shí)體采集標(biāo)準(zhǔn)見圖1。桑葚期能分辨出為傘形，子實(shí)體棕褐色；珊瑚期菌蓋開始撐開，能看見內(nèi)菌幕生長；成形期內(nèi)菌幕形成，菌柄伸長，色澤圓潤潔白；成熟期內(nèi)菌幕逐漸消失。

1.2.2 菌褶掃描電子顯微鏡觀察 將采集的新鮮子實(shí)體菌褶部位進(jìn)行預(yù)處理，處理方法參照趙建霞等[12]的方法略有改動。取不同時期的菌褶放入離心管，用5%戍二醛固定樣品4 h；棄預(yù)固定液，使用0.2 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.4）漂洗樣品，清洗3次，每次10～15 min；再使用1%鋨酸固定4 h（通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行）；然后使用0.2 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.4）再漂洗；使用50%、70%、80%、90%、100%酒精逐級脫水，每遍間隔10～15 min，其中100%酒精置換3次；使用環(huán)氧丙烷作為中間溶劑轉(zhuǎn)換2次；采用臨界干燥儀干燥，使樣品表面不受或少受表面張力影響的條件下除去乙醇；處理好后用離子鍍膜儀進(jìn)行噴金。最后利用掃描電子顯微鏡觀察。

A：桑葚期；B：珊瑚期；C：成形期；D：成熟期。

1.2.3 菌褶擔(dān)孢子、擔(dān)孢子和菌絲細(xì)胞核熒光顯微鏡觀察 將剛采集回來的成形期子實(shí)體，用干凈的鑷子輕輕將菌褶分離，染色后于熒光顯微鏡下觀察擔(dān)孢子細(xì)胞核。擔(dān)孢子細(xì)胞核的觀察通過孢子印法收集孢子，對孢子進(jìn)行稀釋后染色觀察。菌絲體細(xì)胞核的觀察，利用復(fù)壯培養(yǎng)基培養(yǎng)菌絲，將配置好的培養(yǎng)基高溫滅菌后，在超凈工作臺上把培養(yǎng)基倒入平板，等待至凝固，使用打孔器接種姬松茸菌絲到平板中央，并把蓋玻片45°斜插入培養(yǎng)基上，待菌絲長至蓋玻片2/3時，取出蓋玻片進(jìn)行染色觀察。

熒光顯微觀察參照胡曉棣等[13]的染色方法略有改動，以上樣品統(tǒng)一使用DAPI進(jìn)行染色觀察，將10 μg/mL DAPI利用PBS緩沖液（pH 6.8, 0.1 mol/L）進(jìn)行稀釋，DAPI最終染色濃度為5 μg/mL。將上述準(zhǔn)備好的樣品，利用DAPI（5 μg/mL）對樣品進(jìn)行避光染色5 min，最后置于熒光顯微鏡激發(fā)光波長340 nm與發(fā)射光波長488 nm下觀察，激發(fā)出藍(lán)色熒光。

2 結(jié)果與分析

2.1 姬松茸菌褶形態(tài)變化

對姬松茸桑葚期菌褶觀察發(fā)現(xiàn)，子實(shí)層體呈彎曲狀，菌褶處于發(fā)育階段，觀察到明顯菌褶形態(tài)，菌髓還處在發(fā)育階段（圖2A）。進(jìn)一步對圖2A菌褶處放大觀察，發(fā)現(xiàn)子實(shí)體基部細(xì)胞還處于生長發(fā)育階段，菌褶上的擔(dān)子細(xì)胞已有雛形初現(xiàn)，極少部分擔(dān)子細(xì)胞末端開始膨大（圖2B）。對姬松茸珊瑚期菌褶觀察發(fā)現(xiàn)，菌褶排列緊密厚度均等，具有一定的規(guī)則性，且能明顯看到片狀物。圖2C以一條150°斜線為界限，角度大于150°的部分就是菌褶（圖2C-a），小于150°的部分為菌褶的基部（圖2C-b），可以看到菌褶是由菌髓和其兩側(cè)的子實(shí)層組成，子實(shí)層上著生擔(dān)子。相較于排列整齊的擔(dān)子，菌髓呈不規(guī)則排列。對圖2C菌褶部分依次進(jìn)行放大觀察（圖2D～圖2F），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌褶中的基部細(xì)胞和擔(dān)子細(xì)胞已有明顯的分化趨勢。

A、B：桑葚期菌褶；C～F：珊瑚期菌褶, a為菌褶，b為菌褶基部。

2.2 姬松茸菌褶間隙導(dǎo)管狀細(xì)胞

姬松茸菌褶是菌蓋子實(shí)層體的皺褶部分，由菌褶原發(fā)育而成的片狀結(jié)構(gòu)。從橫切面看，每個菌褶的兩側(cè)有子實(shí)層。姬松茸菌褶子實(shí)層的下層有一圈子實(shí)層基，即菌髓。擔(dān)子著生于子實(shí)層，對姬松茸菌褶間隙依次放大觀察發(fā)現(xiàn)，菌褶間隙包含表面凸起排列的擔(dān)孢子和雜亂的導(dǎo)管狀細(xì)胞（圖3A，圖3B）。此外，每片菌褶呈相互平行排布，且菌髓內(nèi)細(xì)胞組織的排列與擔(dān)子大致是垂直關(guān)系，這可能與固定擔(dān)孢子形態(tài)和運(yùn)輸營養(yǎng)物質(zhì)有關(guān)。桑葚期菌褶基部里的導(dǎo)管狀細(xì)胞緊密關(guān)聯(lián)，推測這種導(dǎo)管狀細(xì)胞具有支撐和輸送作用（圖3C，圖3D）。

A、B：菌褶與菌褶之間縫隙圖；C、D：菌褶內(nèi)部導(dǎo)管狀細(xì)胞。

2.3 姬松茸擔(dān)子形態(tài)

姬松茸擔(dān)子之間有細(xì)小的連接絲，擔(dān)子較為飽滿，未發(fā)現(xiàn)著生孢子梗（圖4A～圖4D）；通過進(jìn)一步放大觀察，可以觀察到3個孢子?；?個孢子梗，同時還觀察到擔(dān)子有褶皺（圖4E，圖4F）。從2個擔(dān)子頂端的孢子?？梢钥吹剑薨櫟牡逆咦庸ｉ_始膨脹，這可以說明姬松茸子實(shí)體發(fā)育后子實(shí)層裸露，其上的擔(dān)子由飽滿圓滑形狀轉(zhuǎn)變成褶皺蜂窩狀，頂端的孢子梗膨脹有釋放擔(dān)孢子的趨勢。

2.4 成形期菌褶擔(dān)孢子熒光顯微觀察

姬松茸成形期菌褶的表面著生大量擔(dān)孢子（圖5），能明顯觀察到雙核（圖5A，圖5B）。收集該時期彈射的孢子，對其進(jìn)行熒光條件下顯微觀察（圖5C，圖5D），進(jìn)一步確認(rèn)擔(dān)孢子大多屬于雙核擔(dān)孢子（圖5D），也有少量單核和無核（圖5D），但擔(dān)孢子的雙核屬于同核或者異核還需進(jìn)一步研究確認(rèn)。

A～D：成形期擔(dān)子；E～F：成形期擔(dān)子著生3個或4個孢子，a和b為4個孢子梗，c為3個孢子梗。

A、B：菌褶碎片（小紅圈代表雙核孢子）；C、D：熒光觀察圖（紅箭頭指向雙核孢子，白箭頭指向單核孢子，黃箭頭指向無核孢子）。Bars=100 mm。

2.5 菌絲細(xì)胞核觀察

利用DAPI進(jìn)行姬松茸菌絲染色觀察，結(jié)果如圖6所示，姬松茸細(xì)胞核顏色為藍(lán)色，紅色箭頭所指的是菌絲細(xì)胞核，可以觀察到姬松茸菌絲為多核，且有隔膜；通過進(jìn)一步觀察，未發(fā)現(xiàn)鎖狀聯(lián)合。

紅色箭頭指向細(xì)胞核；藍(lán)色箭頭指向隔膜。Bars=100 mm。

3 討論

本研究通過對姬松茸子實(shí)體不同發(fā)育時期的菌褶變化和擔(dān)孢子發(fā)育過程進(jìn)行顯微觀察，發(fā)現(xiàn)菌褶與擔(dān)孢子存在發(fā)育不同步，菌褶為擔(dān)孢子生長輸送營養(yǎng)物質(zhì)，并提供生長發(fā)育空間。子實(shí)體不同發(fā)育時期菌褶變化差異較大，桑葚期有菌褶雛形出現(xiàn)，該時期的菌褶還處于待發(fā)育狀態(tài)，但能看見少量的擔(dān)孢子，說明擔(dān)孢子形成初期主要靠菌髓和子實(shí)層提供營養(yǎng)；珊瑚期能明顯看出菌褶片狀物，此時的擔(dān)孢子凸起并出現(xiàn)褶皺；成形期擔(dān)孢子上著生孢子梗，觀察到擔(dān)孢子上著生有3個或4個孢子梗，并觀察到擔(dān)孢子之間有絲狀連接物，這與同屬的雙孢蘑菇觀察到的結(jié)果較為一致[12]。而HERREIRA等[14]利用掃描電鏡觀察姬松茸擔(dān)孢子，發(fā)現(xiàn)菌株CS2和CS7以2個孢子梗和3個孢子梗為主，菌株CS1、CS9和CS10以4個孢子梗為主，說明不同菌株間的孢子梗具有差異性。通過食用菌菌褶形態(tài)特征的掃描電鏡觀察，有助于開展食用菌孢子收集和孢子萌發(fā)的相關(guān)育種工作。許多研究者大都選擇八成熟或成熟期的子實(shí)體進(jìn)行單孢分離試驗(yàn)[15-17]，而對于成形期的研究報(bào)道甚少。成熟期收集的孢子較易感染雜菌，選擇成形期的孢子進(jìn)行分離實(shí)驗(yàn)其活力是否可行，還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

解析食用菌不同發(fā)育時期菌褶的形態(tài)特征，對深入研究食用菌分子方面的機(jī)理具有一定參考價(jià)值。陳美元等[18]以雙孢蘑菇菌褶為轉(zhuǎn)化受體，運(yùn)用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將耐熱相關(guān)基因028-1成功轉(zhuǎn)入雙孢蘑菇非耐熱菌株8213。喬燕楠等[19]采用根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，將雙元載體pCghG轉(zhuǎn)化雙孢蘑菇不同組織，結(jié)果表明，菌褶部位轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)67.1%。喻義贛[20]利用香菇不同組織進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，研究表明，幼嫩菌褶是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化香菇的最適組織。食用菌菌褶部位被廣泛運(yùn)用于分子遺傳轉(zhuǎn)化，作為食用菌遺傳轉(zhuǎn)化體系的理想材料。目前，還未建立姬松茸穩(wěn)定有效的遺傳轉(zhuǎn)化體系，姬松茸的相關(guān)分子研究受到一定制約，完善姬松茸的基本生物學(xué)研究是當(dāng)下至關(guān)重要的一步。

此外，本研究還對姬松茸細(xì)胞核進(jìn)行觀察，結(jié)果表明姬松茸擔(dān)孢子大多屬于雙核，菌絲體為多核，有隔膜，未見鎖狀聯(lián)合。而楊利梅[21]對磚紅線蓋牛肝菌（）進(jìn)行顯微觀察發(fā)現(xiàn)，牛肝菌菌絲為雙核，無鎖狀聯(lián)合，這與本研究結(jié)果類似。而另有研究表明，刺芹側(cè)耳（）、鳳尾菇（）、靈芝（）等食用菌均觀察到細(xì)胞核和鎖狀聯(lián)合[22-23]。這說明同一擔(dān)子菌門不同屬之間，菌絲體結(jié)構(gòu)和細(xì)胞核數(shù)存在差異。本研究觀察到擔(dān)孢子雙核和菌絲體多核對姬松茸的雜交育種工作提供理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

（1）姬松茸子實(shí)體桑葚期菌褶還未發(fā)育健全，片狀物不明顯；珊瑚期后能明顯觀察到菌褶片狀物，能看見少部分擔(dān)子；成形期菌褶清晰排列規(guī)整，內(nèi)菌幕未破裂。

（2）姬松茸菌褶間隙有大量導(dǎo)管狀細(xì)胞，菌褶里面導(dǎo)管狀細(xì)胞緊密關(guān)聯(lián)，并起支撐和輸送作用。

（3）姬松茸成形期菌褶著生擔(dān)子，擔(dān)子上著生有3個孢子?；?個孢子梗；姬松茸擔(dān)孢子大多屬于雙核，菌絲體為多核，未見鎖狀聯(lián)合。

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Microscopic Observations of Gills, Basidiospores and Mycelium in

ZHOU Yu1,2, HUANG Zaixing3, BAO Xinglu4, LI Jing2, LIU Penghu2*

1. College of Horticulture, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China; 2. National Engineering Research Center of Juncao Technology, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China; 3. Institute of Applied Microbiology, College of Agriculture, Guangxi University / Institute of Edible Fungi, Nanning, Guangxi 530005, China; 4. Wutun Town Rural Revitalization Development Center, Wuyishan, Fujian 354309, China

is a precious edible and medicinal mushroom, which is not only rich in nutrition but also has high medicinal value, and its industrial development has a broad prospect. However, the lack of germplasm resources ofand insufficient knowledge of the genetic background ofhave hindered the development of its hybrid breeding technology, and the existing germplasm resources can hardly meet the practical needs of production.strains J1 was used as research materials,it is proposed to investigate the biological properties related toby micro-morphological observation of the reproduction-related structures of. The microscopic morphological characteristics of gills, basidiospores and mycelium in different growth and development stages were observed by scanning electron microscope and fluorescence microscope. The gills and trama were in the developmental stage and the hyphae lamellae were not obvious, and the gill sheets were not obvious during the morula state. The gill sheets were obviously observed,arranged parallel to each other,composed of trama and the fruiting layers on both sides, which were closely arranged, uniform in thickness, and a small amount of basidia were borne after the coral stage, but the trama was irregularly arranged. During the forming stage, the gills were clear and regular, and the inner veil was not ruptured, the gill space contains basidiospores and disorganized duct-like cells arranged in raised surface, and the duct-like cells in the gill were closely related. During the forming stage, the gill basidium was relatively full and wrinkled. There were 3 or 4 sporozoites on the gill basidia, and there were small connecting filaments between the basidiospores. The observation of basidiospore nuclei by DAPI staining showed that the most basidiospores were dinuclear spores, and a few were mononuclear and enucleated spores. The observation of mycelial nuclei by DAPI staining showed that the mycelium ofmycelium was multinucleated and had septa, but there was no lock-like association. This study would clarify the microscopic morphological characteristics of gills, basidia, basidiospores and mycelium in different growth and development stages of, enrich the knowledge of biological studies and life history processes of, and lay a foundation for the hybrid breeding, basidiospore mating types, genetics transformation system of

; gills; basidiospore; nucleus

S567.3

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2022.12.010

2022-01-12；

2022-03-27

福建省科技廳農(nóng)業(yè)引導(dǎo)性（重點(diǎn)）項(xiàng)目（No. 2020N0007）；福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)科交叉融合項(xiàng)目（No. XKJC-712021030）；中央引導(dǎo)地方科技發(fā)展專項(xiàng)（No. 2020L3030）。

周 宇（1997—），男，碩士，研究方向：食用菌栽培與育種。*通信作者（Corresponding author）：劉朋虎（LIU Penghu），E-mail：phliu1982@163.com。