劉婷婷 董紅艷 馬艷蘭 王婷婷 王學(xué)武

(1.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院干部保健科，新疆 烏魯木齊 830000；2.新疆昌吉州中醫(yī)醫(yī)院針灸科，新疆 昌吉 831100；3.新疆伊犁州婦幼保健院兒童康復(fù)科，新疆 伊寧 835000；4.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院藥學(xué)部，新疆 烏魯木齊 830000；5.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院中醫(yī)科，新疆 烏魯木齊 830000)

缺血性心臟病已成為世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率的主要原因，給社會(huì)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。急性心肌梗死(Acute myocardial infarction，AMI)是缺血性心臟病最嚴(yán)重的亞型，常導(dǎo)致猝死[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，美國(guó)每年有150萬人被診斷患有AMI。全世界每年約有2000萬人死于AMI[2]。因此，開發(fā)新的AMI治療藥物對(duì)于改善AMI疾病現(xiàn)狀具有重要意義。AMI的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，已有研究表明，Notch1信號(hào)通路調(diào)節(jié)多種細(xì)胞過程，如發(fā)育、增殖、分化、凋亡和再生[3]。Hes1是Notch1信號(hào)通路的下游靶基因，Hes1通過調(diào)節(jié)Notch1/Hes1磷酸酶及下游信號(hào)通路來保護(hù)心肌細(xì)胞[4]。此外，已有證據(jù)顯示，急性心肌缺血性損傷后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平升高，導(dǎo)致線粒體損傷和細(xì)胞凋亡[5]。D-β-羥基丁酸(D-β-hydroxybutyrate，DβHB)是酮體家族成員之一，是由肝臟中脂肪酸降解產(chǎn)生，隨后轉(zhuǎn)移到肝外組織(包括大腦，心臟和骨骼肌)的重要代謝基質(zhì)之一[6]。有研究表明，DβHB在糖尿病、神經(jīng)退行性疾病、心力衰竭、敗血癥相關(guān)的肌肉萎縮、偏頭痛和癲癇等疾病中均有潛在的治療作用[7]。目前，關(guān)于DβHB在AMI中的作用及其可能的機(jī)制尚不明確。因此，本研究旨在探究DβHB是否通過調(diào)節(jié)Notch1/Hes1通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平發(fā)揮對(duì)AMI的保護(hù)作用，以期為開發(fā)新的AMI治療藥物提供新的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40只SPF級(jí)雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體質(zhì)量(210±10)g，6～7周齡，購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所有大鼠飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房，環(huán)境溫度(20±2)℃，濕度45%～55%，提供充足飲水及飼料。待大鼠適應(yīng)環(huán)境一周后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本研究經(jīng)醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審批通過。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 D-β-羥基丁酸(D-β-hydroxybutyrate，DβHB)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，倍他樂克購(gòu)自阿斯利康制藥有限公司，乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海通善生物科技有限公司，肌酸激酶同工酶(CK-MB)測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京九強(qiáng)生物技術(shù)股份有限公司，TUNEL試劑盒購(gòu)自瑞士Roche公司，Bax、Bcl-2和GAPDH抗體購(gòu)自北京義翹神州，Notch1、NICD、Hes1、ATF4和CHOP抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam，p-PERK、PERK、p-eIF2α和eIF2α抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司，ECL發(fā)光液購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司。

1.3 AMI模型的建立[8]及給藥處理 將40只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、心梗組、DβHB組和陽(yáng)性對(duì)照組，每組10只。戊巴比妥鈉腹腔麻醉大鼠(35 mg/kg)，仰臥位固定，氣管插管，連接呼吸機(jī)及心電監(jiān)護(hù)儀。心梗組、DβHB組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠無創(chuàng)絲線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支近端，隨后前降支供血區(qū)域心肌顏色發(fā)白，心電圖導(dǎo)聯(lián)ST段弓背抬高，此時(shí)AMI大鼠模型成功建立。對(duì)照組大鼠進(jìn)行穿線，但不結(jié)扎。DβHB組大鼠腹腔注射DβHB 100 mg·kg-1·d-1[9]，陽(yáng)性對(duì)照組大鼠腹腔注射倍他樂克12 mg·kg-1·d-1[10]，對(duì)照組和心梗組大鼠注射等量生理鹽水，持續(xù)給藥3周。造模過程中，心梗組大鼠死亡1只，陽(yáng)性對(duì)照組大鼠死亡1只。給藥期間，心梗組大鼠死亡1只，DβHB組大鼠死亡1只。最后，每組大鼠各取8只進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)大鼠心功能 最后一次給藥24 h后，麻醉大鼠，通過二維M型和B型超聲心動(dòng)圖評(píng)估左心室功能。檢測(cè)指標(biāo)包括左室射血分?jǐn)?shù)(Left ventricular ejection fraction,LVEF)、左室短軸縮短率(Left ventricular fractional shortening,LVFS)、左室收縮末內(nèi)徑(Left ventricular end systolic diameter,LVSD)、左心室收縮末期容積(Left ventricular end systolic volume,LVESV)。

1.5 HE染色檢測(cè)大鼠心臟病理學(xué)變化 最后一次給藥24 h后，麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，4℃，2500 rpm離心15 min，取上清液，-80℃條件下保存。隨后取心臟，4%多聚甲醛固定左心室組織72 h，梯度酒精脫水，二甲苯透明。石蠟包埋、切片。石蠟切片常規(guī)二甲苯、乙醇脫蠟至水，蘇木素染色10 min，0.7%鹽酸乙醇分化5 s，流水洗滌后，伊紅液浸染3 min。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。切片于光學(xué)顯微鏡下觀察分析。

1.6 TTC染色檢測(cè)大鼠心肌梗死面積 取各組大鼠心臟組織，于-20℃條件下冷凍30 min后切片。2%TTC溶液37℃避光孵育30 min，PBS洗滌心臟，4%多聚甲醛固定心臟24 h。Image J軟件分析梗塞面積。

1.7 ELISA試劑盒檢測(cè)LDH和CK-MB的水平 取-80℃保存的血清，解凍。按照ELISA試劑盒說明書步驟所示，檢測(cè)血清中LDH和CK-MB的水平。

1.8 TUNEL染色檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡 按照1.5所示，制備心臟組織石蠟切片。切片常規(guī)脫蠟至水，PBS漂洗后，加入蛋白酶K工作液，37℃反應(yīng)30 min，PBS漂洗3次，3%H2O2封閉10 min。滴加TUNEL反應(yīng)混合液，濕盒中37℃孵育1 h。PBS漂洗，加入轉(zhuǎn)化劑，濕盒中37℃孵育20 min。PBS漂洗，加入IDAB底物，反應(yīng)10 min。PBS漂洗后，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水、二甲苯透明，中性樹膠封片。切片于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察分析。

1.9 Western blot檢測(cè)凋亡、Notch1/Hes1通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白水平 將各組大鼠心臟組織剪碎，RIPA裂解液裂解組織，離心取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取30 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)至PVDF膜上。10%脫脂奶粉封閉，隨后加入Bax(1∶2000)、Bcl-2(1∶1000)、Notch1(1∶1500)、NICD(1∶2000)、Hes1(1∶2000)、p-PERK(1∶2000)、PERK(1∶2000)、p-eIF2α(1∶2000)、eIF2α(1∶2000)、ATF4(1∶2000)、CHOP(1∶2000)和GAPDH(1∶1500)抗體，4℃條件下孵育過夜。加入二抗(1∶5000)室溫孵育1 h后，滴加ECL發(fā)光液到膜上，化學(xué)發(fā)光成像儀檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心功能及病理學(xué)變化的比較 與對(duì)照組相比，心梗組大鼠LVEF和LVFS明顯降低，LVSD和LVESV明顯升高(P<0.05)，肌原纖維排列紊亂，存在明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和間質(zhì)水腫；與心梗組相比，DβHB組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠LVEF和LVFS明顯升高，LVSD和LVESV明顯降低(P<0.05)，心肌病理學(xué)變化有明顯改善，見圖1、2和表1。

表1 各組大鼠心功能指標(biāo)的比較Table 1 Comparison of cardiac function indexes of rats in each group

圖1 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)各組大鼠心功能Figure 1 Echocardiogram was used to detect the heart function of rats in each group

圖2 HE染色檢測(cè)各組大鼠心肌病理學(xué)變化(400×)Figure 2 HE staining was used to detect myocardial pathological changes of rats in each group

2.2 各組大鼠梗死面積的比較 與對(duì)照組相比，心梗組大鼠心肌梗死面積明顯升高(P<0.05)；與心梗組相比，DβHB組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠心肌梗死面積明顯降低(P<0.05)，見圖3、表2。

圖3 TTC染色檢測(cè)各組大鼠心肌梗死面積Figure 3 TTC staining was used to detect the area of myocardial infarction in each group of rats

表2 各組大鼠梗死面積的比較Table 2 Comparison of infarct area of rats in each group

2.3 各組大鼠血清LDH和CK-MB活性的比較 與對(duì)照組相比，心梗組大鼠血清LDH和CK-MB活性明顯升高(P<0.05)；與心梗組相比，DβHB組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠血清LDH和CK-MB活性明顯降低(P<0.05)，見表3。

表3 各組大鼠血清LDH和CK-MB活性的比較Table 3 Comparison of serum LDH and CK-MB activities of rats in each group

2.4 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白水平比較 與對(duì)照組相比，心梗組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率和Bax蛋白水平明顯升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平明顯降低(P<0.05)；與心梗組相比，DβHB組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率和Bax蛋白水平明顯降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白水平明顯升高(P<0.05)，見圖4、5和表4。

表4 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率、Bax和Bcl-2蛋白水平比較Table 4 Comparison of rat cardiomyocyte apoptosis rate, Bax and Bcl-2 protein expression in each group

圖4 TUNEL染色檢測(cè)各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡(400×)Figure 4 TUNEL staining was used to detect the apoptosis of rat cardiomyocytes in each group

圖5 Western blot檢測(cè)各組大鼠Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)Figure 5 Western blot was used to detect the expression of Bax and Bcl-2 protein in each group of rats

2.5 各組大鼠Notch1/Hes1通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的比較 與對(duì)照組相比，心梗組大鼠Notch1、NICD和Hes1蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與心梗組相比，DβHB組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠Notch1、NICD和Hes1表達(dá)明顯升高(P<0.05)，見圖6、表5。

圖6 Western blot檢測(cè)各組大鼠Notch1/Hes1通路相關(guān)蛋白的表達(dá)Figure 6 Western blot was used to detect the expression of Notch1/Hes1 pathway related proteins in each group of rats

表5 各組大鼠Notch1、NICD和Hes1蛋白表達(dá)的比較Table 5 Comparison of protein expression of Notch1, NICD and Hes1 in each group of rats

2.6 各組大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)水平的比較 與對(duì)照組相比，心梗組大鼠p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、ATF4和CHOP蛋白水平明顯升高(P<0.05)；與心梗組相比，DβHB組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、ATF4和CHOP蛋白水平明顯降低(P<0.05)，見圖7、表6。

圖7 Western blot檢測(cè)各組大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)Figure 7 Western blot was used to detect the expression of endoplasmic reticulum stress-related proteins in each group of rats

表6 各組大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)的比較Table 6 Comparison of the expression of endoplasmic reticulum stress-related proteins in each group of rats

3 討論

AMI已成為全球發(fā)病率和死亡率的主要原因之一，盡管藥物和導(dǎo)管再灌注(如纖溶和經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療)是目前AMI的主要治療策略，但其會(huì)導(dǎo)致系統(tǒng)性出血和微血管血流再灌注失敗等不良結(jié)果[11]。因此，開發(fā)新的治療策略刻不容緩。本研究旨在探究DβHB對(duì)AMI的作用及其可能的作用機(jī)制，以期為開展新的治療策略提供新的科學(xué)依據(jù)。

酮氧化可提高心臟ATP的產(chǎn)生，心衰時(shí)酮體氧化增加。然而，心力衰竭患者很少有足夠高的DβHB血濃度來滿足心臟需求[12]。最近一項(xiàng)針對(duì)心力衰竭患者的研究報(bào)告表明，輸注DβHB后，心輸出量改善40%，LVEF提高8%[13]。另有研究表明，DβHB治療可減少梗死面積，降低血清中心肌肌鈣蛋白Ⅰ、LDH和CK-MB水平，減少心肌細(xì)胞凋亡，在心肌缺血再灌注小鼠中發(fā)揮保護(hù)作用[14]。本研究結(jié)果表明，DβHB治療可改善AMI大鼠心功能及心肌病理學(xué)變化，降低大鼠心肌梗死面積、LDH和CK-MB活性，抑制心肌細(xì)胞凋亡，提示DβHB在AMI中發(fā)揮保護(hù)作用。

Notch1/Hes1通路在心臟發(fā)生過程中發(fā)揮著控制組織形成的不可或缺的功能，激活Notch1/Hes1通路可能在預(yù)防心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用[15]。越來越多的證據(jù)表明，Notch通路的重新激活可能是對(duì)病理應(yīng)激后提高生存率或刺激組織再生的適應(yīng)性反應(yīng)。心肌梗死后內(nèi)源性Notch激活可促進(jìn)抗凋亡，提高存活率，改善心臟功能[16]。此外，已有研究證明，褪黑素通過激活Notch1/Hes1通路改善大鼠心肌缺血再灌注(Myocardial ischemia/reperfusion，MI/R)損傷，減少心肌細(xì)胞凋亡和氧化損傷[17]。此外，激活Notch1/Hes1通路可通過抑制高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷，改善心肌細(xì)胞肥大[18]。這些研究表明Notch1/Hes1通路在維持心臟功能內(nèi)穩(wěn)態(tài)中的關(guān)鍵作用。本研究結(jié)果顯示，AMI后Notch1/Hes1通路無明顯變化，而DβHB治療可激活Notch1/Hes1通路，在AMI中發(fā)揮保護(hù)作用，抑制心肌細(xì)胞凋亡。

近年來，越來越多的研究關(guān)注內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在急性心肌梗死中的作用。有證據(jù)顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號(hào)通路與缺血性心臟病、原發(fā)性心肌病、心肌肥大和心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[19]。已有研究表明，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可對(duì)AMI后心臟產(chǎn)生保護(hù)作用[20]。葛紅吉等[21]的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，緩解細(xì)胞損傷。哺乳動(dòng)物中未折疊蛋白反應(yīng)的激活是由三種不同的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激傳感器介導(dǎo)的，即蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(Protein kinase R-like ER kinase，PERK)、轉(zhuǎn)錄因子ATF6和內(nèi)核糖核酸酶IRE-1[22]。MI/R損傷激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，促進(jìn)PERK及其靶蛋白真核起始因子2α(Eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α)磷酸化，廣泛抑制細(xì)胞內(nèi)功能蛋白的合成，進(jìn)而增強(qiáng)ATF4的翻譯，誘導(dǎo)CHOP的表達(dá)，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[23]。有研究表明，抑制PERK/eIF2α介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以減輕大鼠心臟的MI/R損傷[24]。本研究結(jié)果顯示，AMI可激活PERK/eIF2α通路，升高ATF4和CHOP表達(dá)，而DβHB治療可抑制PERK/eIF2α通路活化，抑制ATF4和CHOP表達(dá)，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，在AMI中發(fā)揮保護(hù)作用，抑制心肌細(xì)胞凋亡。

4 結(jié)論

DβHB可能通過激活Notch1/Hes1通路和抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激改善大鼠AMI，抑制心肌細(xì)胞凋亡，為明確DβHB對(duì)AMI的作用及作用機(jī)制提供了新的科學(xué)依據(jù)。