楊 蛟，張力劼，王雪美，翁 莉，劉梓涵，蔡曉鋒

（上海師范大學生命科學學院，上海 200234）

0 引言

植物作為自養(yǎng)生物可以通過光合作用將無機碳同化為糖類，滿足自身能量需求以及供應(yīng)其他異養(yǎng)生物［1］.這些同化物包括多種糖：單糖（葡萄糖和果糖）、蔗糖、淀粉和多元醇等，在植物的綠色組織中合成，以淀粉或其他有機化合物的形式運輸?shù)讲煌M織和器官中儲存.這些糖類物質(zhì)是各種代謝途徑的前體、結(jié)構(gòu)構(gòu)件、短距離和長距離信號分子，及壓力條件下的滲透保護劑成分［2］.同時，糖的轉(zhuǎn)運能調(diào)控莖和果實之間的碳分配，參與調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育和能量傳遞［3-4］.植物體內(nèi)糖的積累受干旱、鹽度、滲透脅迫、低溫和高溫等環(huán)境脅迫的影響［5］.

植物通過多種糖轉(zhuǎn)運蛋白調(diào)節(jié)碳水化合物的分配，這些糖轉(zhuǎn)運蛋白協(xié)調(diào)參與感知生物和非生物脅迫反應(yīng)，和適應(yīng)環(huán)境的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［6］，包括糖外排轉(zhuǎn)運蛋白（SWEETs）、蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白（SUTs）和單糖轉(zhuǎn)運蛋白（MSTs）［7］.SWEET家族成員是最近被發(fā)現(xiàn)的，主要參與韌皮部裝載以及液泡糖的輸出［8-10］.SWEET廣泛分布于各種生物中，包括原核生物、動物和植物［4，11］.真核SWEET蛋白在結(jié)構(gòu)上具有7次跨膜α-螺旋（TMH/TM），在細胞膜中以3-1-3拓撲排列，由2個具有3次重復(fù)的TMH組成的MtN3基序和位于其中起連接作用的1個TMH構(gòu)成［12］；與真核SWEET蛋白相反，原核SWEET蛋白（即半SWEET蛋白）僅含有一個3-TM，這可能表明真核SWEET蛋白是通過復(fù)制和融合原核半SWEET蛋白中存在的基本3-TM單元而進化來的.不同家族的膜轉(zhuǎn)運蛋白具有膜轉(zhuǎn)運蛋白正常運作和穩(wěn)定性所需的共同拓撲結(jié)構(gòu)［13］.3-TM包含重復(fù)氨基酸序列，結(jié)構(gòu)域帶有高度保守的脯氨酸和谷氨酰胺基序，因此SWEET被稱為PQ-loop家族轉(zhuǎn)運蛋白［14］，因為該結(jié)構(gòu)域首先在豆科植物中發(fā)現(xiàn)，也被命名為MtN3家族轉(zhuǎn)運蛋白［15］.

菠菜是一種被廣泛種植的重要綠葉蔬菜作物，可用于鮮食和加工［16］，富含鐵、葉黃素、葉酸、維生素、礦物質(zhì)和抗氧化劑（http：//ndb.nal.usda.gov/ndb/search/list）.與大多數(shù)作物一樣，菠菜的生產(chǎn)受到疾病、害蟲和雜草侵擾的生物脅迫，以及鹽分、干旱和高溫等非生物脅迫的阻礙.目前，菠菜育種計劃的主要目標是開發(fā)具有強抗病性（特別是抗霜霉?。⒎巧锩{迫耐受性、耐抽薹，以及高產(chǎn)量和高質(zhì)量的優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源［17］.本研究以現(xiàn)有菠菜基因組信息為基礎(chǔ)［18］，通過生物信息學方法篩選鑒定菠菜SoSWEET蛋白家族成員，以上海師范大學植物種質(zhì)資源中心保存的菠菜種質(zhì)為材料，分析了SoSWEET蛋白家族的基因在菠菜功能葉、功能葉柄、薹葉、薹葉柄、根、莖和霜霉病脅迫處理下的抗病、感病材料葉片的表達譜，為后續(xù)深入研究菠菜SoSWEET蛋白家族成員的功能提供重要參考.

1 材料與方法

1.1 菠菜SoSWEET蛋白家族成員鑒定

為系統(tǒng)全面地鑒定菠菜SoSWEET基因家族成員，從Pfam（http：//pfam.xfam.org/）網(wǎng)站下載SWEET保守結(jié)構(gòu)域的隱馬爾可夫模型文件（PF04193，PF03083），在菠菜數(shù)據(jù)庫（http：//spinachbase.org/？q=home）下載全基因組、蛋白序列及注釋文件，利用TBtools軟件［19］從菠菜全基因組蛋白序列中篩選得到候選蛋白序列，將去除重復(fù)后的候選蛋白序列提交到NCBI-CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）數(shù)據(jù)庫進行蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)合Pfam和NCBI-CDD，剔除不含結(jié)構(gòu)域或含結(jié)構(gòu)域不完整的蛋白序列，對所有的菠菜SoSWEET蛋白序列根據(jù)染色體位置重命名.

1.2 基因結(jié)構(gòu)、蛋白理化性質(zhì)及功能域分析可視化

利用在線工具ExPASy（https：//web.expasy.org/protparam/）分析編碼氨基酸序列的理化性質(zhì)；利用在線工具（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/euk-multi-2/）對蛋白質(zhì)序列進行亞細胞定位.通過在線網(wǎng)站NCBI Conserved Domain（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）對蛋白序列的保守結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測；利用MEME suite（http：//memesuite.org/tools/meme）進行蛋白質(zhì)保守基序分析（數(shù)目設(shè)置為10）；啟動子序列用TBtools提取，并上傳至PlantCARE網(wǎng)站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）預(yù)測順式作用元件，通過TBtools軟件結(jié)合基因組注釋文件實現(xiàn)可視化.

1.3 SoSWEET蛋白家族系統(tǒng)進化分析

從擬南芥（Arabidopsis thaliana）基因組數(shù)據(jù)庫（http：//www.arabidopsis.org/）和水稻（Oryza sativa）基因組數(shù)據(jù)庫（http：//rice.plantbiology.msu.edu/）下載AtSWEET和OsSWEET蛋白序列，對菠菜、擬南芥、水稻SWEET基因家族成員蛋白序列進行ClustalW多重比對，用MEGA7.0軟件鄰位連接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，自檢值取1 000次抽樣.

1.4 試驗材料與采樣

以上海師范大學植物種質(zhì)資源中心保存的菠菜種質(zhì)為材料，將種子播種于穴盤，以體積比為1∶1的草炭土/珍珠巖作為基質(zhì)，在人工氣候室中進行育苗.待幼苗長出兩片真葉時，選取長勢一致的幼苗移植到培養(yǎng)盆中，在人工氣候室進行培養(yǎng).設(shè)定人工氣候室光周期為10 h光照/14 h黑暗，溫度控制在21℃（光照）/18℃（黑暗），光照強度約為5 000 lx，濕度控制在70%左右，在菠菜植株開花期采集不同發(fā)育階段的根、莖、功能葉、功能葉柄、薹葉、薹葉柄等樣品.所有采集樣本經(jīng)液氮速凍后置于-80℃冰箱中保存.

1.5 霜霉病接種處理

霜霉病接種液以主流生理小種為接種病原物，接種液中孢子囊濃度為1×105mL-1.于第一片真葉4～6 cm長時接種，采用噴霧接種法，使病原孢均勻噴灑在真葉上，直至菌液將要從葉片上滴落.接種后于溫度20℃左右、濕度100%左右的溫室中，黑暗保濕約24 h，將植株置于15～20℃溫室中培養(yǎng).于接種后0，2，4，6，8 d采集菠菜高感材料（Sp73）、高抗材料（US61）葉片，各樣本除霜霉病處理外其余生長條件均同步控制，所有采集樣本經(jīng)液氮速凍后置于-80℃冰箱中保存.

1.6 RNA提取及表達結(jié)果分析

使用Trizol法提取菠菜總核糖核酸（RNA），用于實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（QRT-PCR）的cDNA使用Primer-BLAST（https：www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast）進行引物設(shè)計，使用TaKaRa Prime Script?RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成互補cDNA，使用TaKaRa TB GreenTMPremix Ex TaqTM（Tli RNase H Plus）試劑盒在Applied Biosystems 7500 Real Time PCR儀器上進行QRT-PCR.采用So18s基因作為內(nèi)參基因，每個反應(yīng)設(shè)定3次重復(fù).用2-ΔΔCt法計算相對表達量，用軟件SPSS 25.0統(tǒng)計分析，Origin 2018和TBtools 5.0對結(jié)果作圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 菠菜SoSWEET蛋白家族成員全基因組鑒定與理化性質(zhì)分析

根據(jù)菠菜基因組數(shù)據(jù)信息，鑒定出16個菠菜SoSWEET蛋白家族成員，根據(jù)其在染色體上的位置進行命名排序（圖1），依次命名為SoSWEET1～SoSWEET16.其中，1號和5號染色體上存在3個菠菜SoSWEET基因，2號和4號染色體上存在2個菠菜SoSWEET基因，3號染色體上存在1個菠菜SoSWEET基因，6號染色體上存在5個菠菜SoSWEET基因.

圖1 菠菜SoSWEET蛋白家族成員染色體分布圖

菠菜SoSWEET蛋白家族成員氨基酸數(shù)量在648～1 140之間，分子質(zhì)量在54 070.32～95 868.64 u之間，理論等電點（pI）在5.06～5.19之間，不穩(wěn)定系數(shù)、脂肪族氨基酸指數(shù)和親水性（GRAVY）的平均值間都表現(xiàn)不同差異；亞細胞定位6個蛋白質(zhì)于細胞膜，5個蛋白質(zhì)定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，5個蛋白質(zhì)定位于細胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（表1）.

表1 菠菜SoSWEET蛋白家族理化性質(zhì)

2.2 菠菜SoSWEET蛋白家族系統(tǒng)進化分析

為了研究菠菜SoSWEET蛋白家族的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，將16個菠菜SoSWEET、17個水稻OsSWEET和17個擬南芥AtSWEET蛋白的氨基酸序列進行多序列比對，并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹.依據(jù)進化樹結(jié)果，將50個SWEET蛋白分成4個亞族（圖2），其中第I亞族包含3個SoSWEET蛋白（SoSWEET5，6和8）、3個擬南芥AtSWEET蛋白和6個水稻OsSWEET蛋白；第Ⅱ亞族包含6個SoSWEET蛋白（SoSWEET1，2，4，9，15和16）、5個擬南芥AtSWEET蛋白和5個水稻OsSWEET蛋白；第Ⅲ亞族包含7個SoSWEET蛋白（SoSWEET 3，7，10，11，12，13和14）、7個擬南芥AtSWEET蛋白和5個水稻OsSWEET蛋白；而第Ⅳ亞族不含SoSWEET蛋白.

圖2 菠菜、擬南芥、水稻SWEET蛋白系統(tǒng)進化樹

2.3 菠菜SoSWEET蛋白家族保守基序分析

在構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹的基礎(chǔ)上，使用MEME在菠菜SoSWEET蛋白中鑒定了10個高度保守的基序，在相同進化樹分支上的SoSWEET蛋白基序相對保守（圖3），所有菠菜SoSWEET蛋白都包含基序1，2和4，它們構(gòu)成了菠菜SoSWEET蛋白中最高度保守的部分；除SoSWEET15蛋白外，基序3存在于15個菠菜SoSWEET蛋白序列中；基序10存在于12個菠菜SoSWEET蛋白序列中；大多數(shù)基序的相對位置是相似的，總體而言來自同一分支的菠菜SoSWEET蛋白成員通常具有類似的基序組成，表明分支內(nèi)的功能相似性和分支之間的多樣化.

圖3 菠菜SoSWEET蛋白家族保守基序分析.（a）進化樹分析；（b）保守基序分布；（c）保守基序氨基酸殘基序列

2.4 菠菜SoSWEET蛋白家族保守結(jié)構(gòu)域分析

在構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的基礎(chǔ)上，對菠菜SoSWEET蛋白保守結(jié)構(gòu)域進行了比較分析（圖4），在同一進化樹分支的SoSWEET蛋白所含的MtN3_slv（CDD登錄號Pfam03083）和PQ-loop superfamily（CDD登錄號cl21610）結(jié)構(gòu)域具有一致的數(shù)量（2個）和相似的分布.其中，SoSWEET15只含有1個數(shù)量MtN3_slv和PQ-loop superfamily結(jié)構(gòu)域；SoSWEET3還含有PQ-loop（CDD登錄號Pfam04193）結(jié)構(gòu)域；SoSWEET11，SoSWEET14和SoSWEET13還含有SemiSWEET_2（CDD登錄號NF037968）和SemiSWEET_2 superfamily（CDD登錄號cl40515）.由此可知，菠菜SoSWEET蛋白家族MtN3_slv結(jié)構(gòu)域具有一定的保守性，但該結(jié)構(gòu)域的分布位置和數(shù)量具有一定分化.

圖4 菠菜SoSWEET蛋白家族保守結(jié)構(gòu)域分析.（a）進化樹分析；（b）保守基序分布

2.5 菠菜SoSWEET蛋白家族基因結(jié)構(gòu)分析

在構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的基礎(chǔ)上，對菠菜SoSWEET蛋白家族的外顯子和內(nèi)含子進行分析，進一步了解該基因家族的基因結(jié)構(gòu).由圖5可知，菠菜SoSWEET蛋白家族基因被不同數(shù)量和大小的內(nèi)含子打斷.大多數(shù)SoSWEET蛋白家族的基因含有5個內(nèi)含子，其中SoSWEET12，SoSWEET13和SoSWEET15含3個內(nèi)含子，SoSWEET1，SoSWEET7，SoSWEET14和SoSWEET16含4個內(nèi)含子，SoSWEET2最多含8個內(nèi)含子.

圖5 菠菜SoSWEET蛋白家族基因結(jié)構(gòu)分析.

2.6 菠菜SoSWEET蛋白家族啟動子順式作用元件分析

在構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的基礎(chǔ)上，通過PlantCARE網(wǎng)站對菠菜SoSWEET蛋白家族基因起始密碼子上游2 kp的序列進行了順式作用元件預(yù)測（圖6）.結(jié)果表明，菠菜SoSWEET蛋白家族基因啟動子上包含光響應(yīng)、生長發(fā)育、植物激素響應(yīng)和逆境脅迫響應(yīng)等順式作用元件，如與植物生長發(fā)育調(diào)控相關(guān)的細胞周期調(diào)節(jié)（cell cycle）和參與晝夜節(jié)律調(diào)控的順式調(diào)控元件（circadian）；植物激素調(diào)控元件中的脫落酸響應(yīng)、赤霉素響應(yīng)、茉莉酸甲酯和水楊酸反應(yīng)；與逆境脅迫相關(guān)的干旱誘導(dǎo)和低溫反應(yīng)元件等.

圖6 菠菜SoSWEET蛋白家族啟動子順式作用元件分析.（a）進化樹分析；（b）保守基序分布

2.7 菠菜SoSWEET蛋白家族組織表達分析

為探究菠菜SoSWEET基因在菠菜不同部位表達情況，研究了其在菠菜不同組織的表達分析（圖7）.結(jié)果表明，所有基因在根、莖、葉和葉柄中都有表達；SoSWEET2，SoSWEET5，SoSWEET6，SoSWEET8等8個基因在根中的表達量高于其他部位，而SoSWEET13表達量較低；SoSWEET蛋白家族的基因在功能葉、功能葉柄和莖中的表達低于其他組織中的；SoSWEET1，SoSWEET3和SoSWEET13在薹葉中表達量較高；SoSWEET4，SoSWEET7，SoSWEET9和SoSWEET11在薹葉柄中表達量較高.各形態(tài)部位中，紅色光澤尖葉中SoSWEET1，SoSWEET5，SoSWEET6，SoSWEET8等9個基因表達量高于其他部位，而SoSWEET2表達量最低；SoSWEET13在紫紅葉柄中表達量最高；SoSWEET2除在紅色光澤尖葉中表達較低外，在其他部位的表達量整體較高.總之，16個菠菜SoSWEET基因在不同組織和形態(tài)部位具有不同的表達模式.

圖7 菠菜SoSWEET蛋白家族（a）組織表達分析和（b）在不同種質(zhì)中的表達分析

2.8 菠菜SoSWEET蛋白家族霜霉病脅迫處理表達分析

接種病原菌后，16個基因表現(xiàn)出不同響應(yīng)變化（圖8），SoSWEET1，SoSWEET9，SoSWEET10，SoSWEET13和SoSWEET14基因在接種前6 d表達量較低，而在第8天表達量升高；SoSWEET2，SoSWEET4，SoSWEET5，SoSWEET8，SoSWEET10，SoSWEET11和SoSWEET15基因在接種后24 h、黑暗處理前2 d、霜霉病脅迫處理后2～8 d的表達量明顯變化；SoSWEET3和SoSWEET5基因于接種后8 d表達量在抗性品種高于感性品種，在霜霉病脅迫時上調(diào)表達且表達量較高.

圖8 菠菜SoSWEET蛋白家族霜霉病脅迫處理表達分析

3 討論

糖是原核生物和真核生物的重要能量來源.生物體建立了不同的方法，通過維持糖流入和流出的速率來控制糖跨細胞膜的轉(zhuǎn)運.過去的20年里，在細菌、真菌、植物和人類中發(fā)現(xiàn)了各種糖轉(zhuǎn)運蛋白，它們在生長發(fā)育、新陳代謝和體內(nèi)平衡中發(fā)揮著重要作用［8］，如在植物發(fā)育過程中參與花粉壁形成［20］、種子灌漿［21］、韌皮部加載蔗糖距離運輸［10］和調(diào)節(jié)赤霉素反應(yīng)［22］.在全基因組分析的基礎(chǔ)上，已在植物中鑒定出多種SWEET基因，其中擬南芥中的17個［8］、高粱中的23個［23］、番茄中的29個［24］和葡萄中的17個［25］.

本研究從菠菜基因組中共鑒定到了16個SWEET蛋白家族成員，按水稻和擬南芥分類方法，根據(jù)進化樹分成4個亞族［8］，第I亞族包含3個SoSWEET蛋白，第Ⅱ亞族包含6個SoSWEET蛋白，第Ⅲ亞族包含7個SoSWEET蛋白，而第Ⅳ亞族不含SoSWEET蛋白，菠菜SWEET蛋白家族基因與水稻和擬南芥具有一定的同源性，同一亞族中的基因具有相似的結(jié)構(gòu)特征，與先前其他物種中SWEET蛋白家族結(jié)構(gòu)特征相似［26-28］.系統(tǒng)分析了染色體分布、理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、保守基序、順式作用調(diào)控元件等，每個家族成員都含有MtN3_slv/PQ-loop superfamily結(jié)構(gòu)域，表明菠菜SWEET蛋白家族在進化中相對保守，但SoSWEET15蛋白氨基酸序列只含有1個數(shù)量MtN3_slv/PQ-loop superfamily結(jié)構(gòu)域，與其他15個蛋白含2個結(jié)構(gòu)域不同（圖4）.

菠菜的葉形態(tài)特征是具有高商業(yè)價值的關(guān)鍵表型特征［29］，其他葉片特征，如葉柄顏色（紫色或綠色）和邊緣形狀（葉裂刻）也對消費者有吸引力［30］；對野生糧食作物進行遺傳改良、馴化育種促進了現(xiàn)代高產(chǎn)作物品種的發(fā)展，其中許多作物具有抗病蟲害以及非生物形式脅迫的能力［31］.菠菜SoSWEET基因在根、莖、葉和葉柄中都有表達，8個菠菜SoSWEET基因在根中表達量高于其他部位，紅色光澤尖葉、野生型多深裂刻尖葉、野生型綠葉柄和光澤圓葉中各基因都有相應(yīng)表達特征，16個基因在不同組織和形態(tài)部位具有不同的表達模式（圖7）.

許多病原體從宿主獲取葡萄糖，可能劫持專門用于植物發(fā)育的宿主糖外排系統(tǒng)［32］.研究證明，水稻OsSWEET11可以通過單向機制向病原體提供糖［33-34］，病原體特異性調(diào)節(jié)SWEET蛋白基因表達水平可能會改變感染部位的糖外流，從而影響病原體生長和植物免疫［12］.霜霉病是影響全球商業(yè)菠菜生產(chǎn)的最主要菠菜病害，主要感染葉面組織，降低產(chǎn)量并降低作物可銷售部分的質(zhì)量.使用攜帶顯性抗性基因（Dm基因）的品種是控制該病害的最有效策略，然而病原菌迅速進化為新的毒力表型可以擊敗單個Dm基因.菠菜育種計劃是不斷尋找新霜霉病抗性來源和新的抗性基因［35］.隨著高等植物全基因組序列的公布，已在超過30個植物物種中鑒定出SWEET基因（在植物基因組中的數(shù)量為17～108不等）.在這些物種中，一些SWEET基因起到S基因（功能易感性基因）的作用［12］.水稻細菌性枯萎病是研究最廣泛的例子，其中43個已知的抗性基因中有5個是SWEET基因的隱性等位基因［36］.而在霜霉病脅迫處理下，菠菜感病品種、抗病品種中的SoSWEET2，4，5，8，10，11和SoSWEET15基因在霜霉病脅迫處理后表達量明顯變化，SoSWEET3和SoSWEET5于接種后8 d表達量在抗性品種高于感性品種，在霜霉病脅迫時上調(diào)表達且表達量較高（圖8）；病原菌感染植物后，許多SWEET基因表達的變化會改變植物機體對疾病的抵抗力.然而，導(dǎo)致植物激素或其他防御相關(guān)基因上調(diào)是否是由糖改變引起的，值得進一步研究.