李涪鋅，白家成，曲雪嘉，王春花，2

(1.牡丹江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157000 ； 2. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150036)

母豬乳汁是新生仔豬營養(yǎng)物質(zhì)需求的最理想來源，對仔豬的繁育意義重大，母豬產(chǎn)乳量多少直接影響新生仔豬的存活率和生長。規(guī)?；B(yǎng)殖場通過多種措施改善后，在排除飼養(yǎng)管理、環(huán)境因素以及母豬乳腺等疾病問題外[1]，母豬缺乳仍常有發(fā)生，特別是初產(chǎn)母豬和老齡母豬，如何有效提高母豬產(chǎn)乳量已成為養(yǎng)豬業(yè)關(guān)注的熱點。中獸醫(yī)認(rèn)為，導(dǎo)致母豬缺乳的原因主要與營養(yǎng)不良、分娩過程致使母豬氣血虛弱，以及喂養(yǎng)過度、運動缺乏等造成脂肪堵塞致使母豬氣血瘀滯有關(guān)[2]，臨床常在母豬生產(chǎn)前后飼料中添加補氣、養(yǎng)血、理氣活血、通經(jīng)下乳類中藥改善母豬缺乳癥狀[3]。蘿藦(Metaplexisjaponica)又名奶漿草，為蘿藦科蘿摩屬多年生草質(zhì)纏繞藤本植物，亞洲地區(qū)均有分布，具有補氣益精、行氣止血、消腫解毒、通乳、止帶之功效，可用于治療體質(zhì)虛弱、乳汁不足、遺精等[4]。《本草匯言》中記載“蘿藦補血、生血，功過歸、地；壯精培元，力堪枸杞；化毒解疔，與金銀花、半枝蓮、紫花地丁，共效驗亦相等也”[5]，蘿藦催乳作用可能與其補血、生血、化毒解疔之功效有關(guān)。中獸醫(yī)古籍《豬經(jīng)大全》也記載了蘿藦治療缺乳母豬的方法[6]，但其藥效基礎(chǔ)和機(jī)制未見報道。田間、溝邊雜草蘿藦價格低廉且催乳作用明確，具有開發(fā)為母豬催乳功能類飼料添加劑的價值。但目前蘿藦的研究主要集中在藥用成分分離和鑒定以及其抗癌、增強(qiáng)免疫作用方面，在催乳功效上的基礎(chǔ)研究還屬空白，因此明確蘿藦對母豬泌乳性能藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與調(diào)控機(jī)制是蘿藦開發(fā)的關(guān)鍵。本試驗基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)虛擬篩選蘿藦調(diào)控母豬泌乳的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和靶點，為明確蘿藦藥效基礎(chǔ)以及研究調(diào)控泌乳的作用機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 蘿藦化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 基于參考文獻(xiàn)[7-10]獲得蘿藦化學(xué)成分，借助ChemBioDraw軟件繪制化合物的分子結(jié)構(gòu)式，并導(dǎo)入PharmMapper服務(wù)器，進(jìn)行潛在靶點預(yù)測分析，打分值(z-score)>0.9的蛋白作為該化合物的重要靶點蛋白，通過Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建蘿藦化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)，分析化合物和靶點間的連接度(Degree)。

1.2 蘿藦靶點PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 在GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org)以關(guān)鍵詞“Lactation disorders”和“Hypogalactia”檢索，設(shè)定推理分?jǐn)?shù)(Inference score)、關(guān)聯(lián)分?jǐn)?shù)(Relevance score)>20篩選缺乳相關(guān)靶點。將蘿藦重要靶點與缺乳相關(guān)靶點代入在線數(shù)據(jù)庫STRING 11.0(https://string-db.org)，物種選擇為“Susscrofa”，獲取蘿藦化合物靶點蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)信息，通過Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建蘿藦與缺乳靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，分析確定蘿藦調(diào)控泌乳的核心靶點。

1.3 蘿藦核心靶點GO和KEGG富集分析 將蘿藦與缺乳直接相關(guān)的核心靶點(Degree≥40)上傳數(shù)據(jù)庫DAVID(https://david.ncifcrf.gov)，物種限定為“Susscrofa”，以P<0.05作為具有統(tǒng)計差異篩選條件，進(jìn)行基因本體(Gene ontology,GO)生物學(xué)過程富集和京都基因與基因組百科全書(KEGG pathway analysis，KEGG)代謝通路富集分析，探討蘿藦促進(jìn)母豬泌乳的分子機(jī)制。

1.4 蘿藦核心靶點的歸經(jīng)分析 將關(guān)鍵靶點(Degree≥20)輸入BIOGPS數(shù)據(jù)庫(http://biogps.org/#goto= welcome)，物種限定“Pig”，搜索各靶點器官分布信息，通過Cytoscape 3.7.1軟件繪制蘿藦靶點-歸經(jīng)網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 蘿藦化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 共收集到蘿藦的化學(xué)成分64個，包括C21甾體(29個)、萜類(4個)、黃酮類(9個)、苯丙素類(5個)、生物堿類(4個)和其他類化合物(13個)。利用PharmMapper服務(wù)器繪制并搜索化合物靶點，去除無靶點化合物14個，共獲得50個含有靶點的化合物作為蘿藦活性化合物進(jìn)行分析(表1)?；衔?靶點網(wǎng)絡(luò)(圖1)共包括457個節(jié)點(50個化合物，407個靶點)和1 564條邊，其中，紅色節(jié)點代表蘿藦化合物，節(jié)點大小與Degree相關(guān)，圈內(nèi)紅色節(jié)點代表蘿藦關(guān)鍵化合物(Degree>65)，藍(lán)色節(jié)點代表靶點，該網(wǎng)絡(luò)說明蘿藦泌乳功效可能是多成分、多靶點作用的結(jié)果。在蘿藦化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)中，每個化合物有平均靶點數(shù)目31.28個，每個靶點平均與8.14個化合物相互作用，芹菜素(Apigenin)、山奈酚(Kaempferol)、表兒茶素(Epicatechin)、異鼠李素(Isorhamnetin)和鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)等為蘿藦重要化合物(Degree≥10)。從靶點角度來看，前列腺素合酶G/H-1(Prostaglandin G/H synthase 1)、孕激素受體(Progesterone receptor)、碳酸酐酶Ⅱ(Carbonic anhydrase 2)等為蘿藦重要靶點(Degree≥10)。Degree≥60的蘿藦化合物信息見表2，Degree≥20的蘿藦靶點信息見表3。

表1 蘿藦化合物Table 1 Metaplexis japonica compounds

圖1 化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Compound-target network紅色節(jié)點:蘿藦化合物; 圈內(nèi)紅色節(jié)點:蘿藦重要化合物; 藍(lán)色節(jié)點:靶點; 節(jié)點大小與Degree相關(guān)Red node:Metaplexis japonica compounds; Red node in the circle: Important compounds of Metaplexis japonica； Blue node:Targets. Node size was related to Degree

表2 蘿藦Degree≥60的核心化合物基本信息Table 2 Basic information for Degree≥60 core compounds in Metaplexis japonica

2.2 蘿藦靶點PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 為了更好地理解蘿藦促進(jìn)母豬泌乳的分子機(jī)制，利用STRING數(shù)據(jù)庫分析蘿藦重要靶點與缺乳相關(guān)靶點PPI關(guān)系，如圖2所示，PPI網(wǎng)絡(luò)共包括327個節(jié)點，直接與缺乳相關(guān)靶點連接的蘿藦化合物靶點74個，為蘿藦調(diào)控母豬泌乳的核心靶點。其中，TP53、ALB、TNF、IL-6、COMT、MAOA、POR、HTR2A、SLC6A4、SLC6A3、GPRIN1為化合物與豬缺乳共同靶點，在蘿藦調(diào)控母豬泌乳性能中起到關(guān)鍵作用。

表3 蘿藦Degree≥20的靶點基本信息Table 3 Basic information for Degree≥20 targets in Metaplexis japonica

圖2 蘿藦與母豬缺乳靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 PPI network of Metaplexis japonica and sow hypogalactia左側(cè)圓形節(jié)點:蘿藦靶點; 右側(cè)圓形節(jié)點:母豬缺乳靶點; 中間圓形節(jié)點:化合物與母豬缺乳共同靶點; 節(jié)點大小、顏色深淺與Degree成正比Circle nodes on the left side:Targets of Metaplexis japonica； Circle nodes on the right side：Targets of sow hypogalactia; Middle circle nodes:Common targets of compounds and sow hypogalactia. The size and color depth of the node was proportional to Degree

2.3 蘿藦核心靶點GO和KEGG富集分析 將蘿藦與缺乳直接相關(guān)的核心靶點(Degree≥40)蛋白輸入DAVID數(shù)據(jù)庫，如圖3所示，GO功能富集分析得到GO條目115個(P<0.05)，生物學(xué)過程(BP)條目84個，占73%；細(xì)胞組成(CC)條目10個，占9%；分子生物學(xué)功能(MF)相關(guān)條目21個，占18%。如圖4所示，蘿藦調(diào)控母豬泌乳的核心靶點KEGG通路富集得到106條有效信號通路，其中母豬泌乳性能相關(guān)的信號通路包括雌激素信號通路(Estrogen signaling pathway)、催乳素信號通路(Prolactin signaling pathway)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)等，為蘿藦調(diào)控母豬泌乳性能重要信號通路網(wǎng)。

2.4 蘿藦核心靶點的歸經(jīng)分析 利用BIOGPS數(shù)據(jù)庫對關(guān)鍵靶點(Degree≥20)定位分析，共70個靶點，保留每個基因表達(dá)量最高的組織(心臟、血液、巨噬細(xì)胞、胸腺、胰腺、腎臟、肝臟、腸等)，利用Ctyoscape

圖3 蘿藦核心靶點GO富集分析Fig.3 GO analysis of Metaplexis japonica core targets

圖4 蘿藦核心靶點KEGG通路Fig.4 KEGG pathway analysis of Metaplexis japonica core targets

軟件繪制靶點-歸經(jīng)網(wǎng)絡(luò)圖。如圖5所示，將查找到的組織器官根據(jù)其所在系統(tǒng)進(jìn)行分類，這些組織和器官主要分布在免疫系統(tǒng)(胸腺、脾、巨噬細(xì)胞、腸系膜淋巴結(jié))、血液循環(huán)系統(tǒng)(血液、心臟、腹主動脈)、神經(jīng)系統(tǒng)(腦)、消化系統(tǒng)(大腸、小腸、肝臟、胰腺)、生殖系統(tǒng)(子宮、胎盤)、運動系統(tǒng)(骨)、呼吸系統(tǒng)(肺、氣管)、泌尿系統(tǒng)(腎臟、輸尿管)。其中有24個靶點作用于免疫系統(tǒng)、20個靶點作用于消化系統(tǒng)、9個靶點作用于血液循環(huán)系統(tǒng)、7個靶點作用于泌尿系統(tǒng)。表明蘿藦促進(jìn)母豬泌乳作用的靶點多作用于免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和血液循環(huán)系統(tǒng)。

圖5 蘿藦靶點-器官定位網(wǎng)絡(luò)Fig.5 Metaplexis japonica target-organ localization network深藍(lán)色節(jié)點:生殖系統(tǒng); 黃色節(jié)點:血液循環(huán)系統(tǒng); 粉色節(jié)點:呼吸系統(tǒng); 綠色節(jié)點:消化系統(tǒng); 橘色節(jié)點:免疫系統(tǒng); 棕色節(jié)點:神經(jīng)系統(tǒng); 紫色節(jié)點:泌尿系統(tǒng); 紅色節(jié)點:運動系統(tǒng); 藍(lán)色節(jié)點:關(guān)鍵靶點Dark blue node:Reproductive system; Yellow node:Blood circulation system; Pink node:Respiratory system; Green node:Digestive system; Orange node：Immune system; Brown node：Nervous system；Purple node：Urinary system； Red node:Exercise system； Blue node:Key target

3 討論

在養(yǎng)殖生產(chǎn)中，母豬乳汁質(zhì)量不僅是衡量哺乳母豬營養(yǎng)狀況的重要指標(biāo)，更關(guān)系到出生仔豬的健康狀況。因此，有效防控母豬產(chǎn)后缺乳的發(fā)生可提高養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益和養(yǎng)殖者的積極性。在獸醫(yī)臨床中常用補氣養(yǎng)血類中藥，如當(dāng)歸、川芎、白芍、地黃、黃芪、阿膠等，兼以通乳類中藥，如王不留行，治療母豬產(chǎn)后乳量不足。研究顯示，在妊娠母豬生產(chǎn)前后飼料中添加補氣養(yǎng)血類中藥可防控產(chǎn)后氣血不足引起的母豬產(chǎn)后缺乳現(xiàn)象[11]。中藥蘿藦的催乳應(yīng)用歷史悠久，喂食鮮草可增加產(chǎn)后母豬乳量。蘿藦具有一定研究與開發(fā)價值，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)虛擬篩選蘿藦調(diào)控母豬泌乳的物質(zhì)基礎(chǔ)和靶點，可為其在動物營養(yǎng)、中獸醫(yī)領(lǐng)域應(yīng)用和開發(fā)提供基礎(chǔ)，為中獸藥、中藥飼料添加劑的研究拓展新思路。

3.1 蘿藦促進(jìn)母豬泌乳的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)分析 在進(jìn)行潛在靶點預(yù)測分析時，文獻(xiàn)多將打分值(z-score)降序排列后取z-score>0.5作為化合物的重要靶點蛋白[12]，本試驗獲得的相關(guān)靶點較多，故以z-score>0.9為參數(shù)，篩選蘿藦化合物的重要靶點蛋白。經(jīng)分析顯示，蘿藦含有C21甾體、萜類、黃酮類、木脂素類等化合物，其中芹菜素(Apigenin)、山奈酚(Kaempferol)、表兒茶素(Epicatechin)、異鼠李素(Isorhamnetin)和鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)等為蘿藦重要化合物，在下乳通乳、補氣補血、抗炎作用中起到不同程度的作用。芹菜素具有抗氧化和保護(hù)血管的作用，可通過調(diào)節(jié)體內(nèi)膽固醇的代謝，促進(jìn)膽固醇吸收、轉(zhuǎn)化和逆向轉(zhuǎn)運，降低血脂水平和加速血液循環(huán)，從而促進(jìn)肥胖母豬產(chǎn)后乳汁分泌[13]。Zhong等研究發(fā)現(xiàn)，山奈酚具有抑制STAT3和IL-6表達(dá)的作用，為桔梗促進(jìn)乳汁分泌的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[14]。表兒茶素可通過抑制iNOS的合成減少NO的釋放，從而發(fā)揮抗炎作用[15-16]。異鼠李素具有抗腫瘤、降血脂、降血壓、抗炎癥和抗氧化的作用[17]，可抑制炎癥因子IL-1β和IL-6的分泌，降低iNOS活性和NO含量[18]，發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)作用，是維持乳腺健康和高效泌乳的有效成分。鄰苯二甲酸二丁酯可提高泌乳中期母豬乳腺上皮細(xì)胞p-Akt和cyclin D1的表達(dá)，誘導(dǎo)PRLR、STAT5基因表達(dá)增多[19]，通過誘導(dǎo)催乳素與其受體結(jié)合，促進(jìn)母豬乳腺上皮細(xì)胞泌乳。綜上所述，蘿藦主要通過多種化合物的多靶點、多作用通路共同實現(xiàn)治療產(chǎn)后母豬乳汁分泌的目的，芹菜素、山奈酚、表兒茶素、異鼠李素和鄰苯二甲酸二丁酯等是蘿藦促進(jìn)母豬泌乳的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。

3.2 蘿藦促進(jìn)母豬泌乳的靶點分析 在GeneCards數(shù)據(jù)庫以關(guān)鍵詞“Lactation disorders”和“Hypogalactia”檢索，獲得直接與缺乳相關(guān)靶點連接的蘿藦化合物靶點共327個，文獻(xiàn)多以推理分?jǐn)?shù)(Inference score)、關(guān)聯(lián)分?jǐn)?shù)(Relevance score)>20篩選缺乳相關(guān)靶點[20]，本試驗為探討其關(guān)鍵靶點，參考該域值進(jìn)行篩選缺乳相關(guān)靶點，篩選后共獲得74個直接與缺乳相關(guān)靶點連接的蘿藦化合物靶點。本試驗結(jié)果顯示，TP53、ALB、TNF、IL-6、COMT、MAOA、POR、HTR2A等靶點為蘿藦直接作用于母豬缺乳的關(guān)鍵靶點。TP53是蘿藦與母豬產(chǎn)后缺乳疾病共同靶點，可以使癌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗癌作用，同時可以調(diào)節(jié)機(jī)體正常的生命活動[21]。ALB 是血液循環(huán)中的主要循環(huán)蛋白，轉(zhuǎn)運多種內(nèi)源性和外源性化合物，還是一種多功能的蛋白質(zhì)載體，多用于藥物靶向[22]。TNF具有抗腫瘤、抗病毒、激活免疫細(xì)胞，誘發(fā)炎癥反應(yīng)作用，在機(jī)體自穩(wěn)、防御反應(yīng)中起到重要作用。TNF還是一個重要的內(nèi)源性致熱原，是不同病因所致發(fā)熱機(jī)制中的一個共同環(huán)節(jié)[23]。IL-6促炎癥細(xì)胞因子可視為研究缺乳的定性指標(biāo)[24]，缺乳發(fā)生時血清IL-6會明顯升高，通過抑制IL-6可以促進(jìn)乳腺炎癥的改善和乳汁分泌的增加。COMT具有基因多態(tài)性，可顯示不同的活性，因而決定不同的兒茶酚雌酮的分解速度，可將兒茶酚雌酮甲基化為可溶于水的代謝產(chǎn)物排出體外，在與雌激素刺激有關(guān)的乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌等婦科腫瘤的發(fā)病過程中起到重要的作用[25-26]。MAOA抑制劑Clorgyline可定向改變?nèi)橄侔┘?xì)胞的生長、遷徙、侵襲[27]。POR為機(jī)體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上對多種內(nèi)源、外源物質(zhì)的代謝至關(guān)重要的一種酶[28]，可參與和調(diào)控膽固醇、性激素和毒素等內(nèi)源和外源物質(zhì)的代謝[29]。HTR2A(5-羥色胺2A受體)可以調(diào)節(jié)5-羥色胺(5-HT)，5-HT是參與調(diào)節(jié)胃腸道運動和分泌功能的重要神經(jīng)遞質(zhì)，可以調(diào)節(jié)情緒、食欲、睡眠等，并能調(diào)節(jié)血液循環(huán)，因此在母豬飲食中添加含HTR2A的藥物，可預(yù)防其因氣血瘀滯或肝郁氣滯等原因?qū)е碌漠a(chǎn)后缺乳[30]。此外，5-HT可以使乳腺組織呈高度泌乳狀態(tài)，具有促進(jìn)乳汁分泌的作用[31]。這些核心靶點主要富集在多種激素調(diào)節(jié)、能量代謝和細(xì)胞增殖等通路網(wǎng)，包括雌激素信號通路(Estrogen signaling pathway)、催乳素信號通路(Prolactin signaling pathway)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)等。催乳素信號通路是哺乳中最重要的通路，可以由催乳素激活，其最具代表性的作用是能夠誘導(dǎo)細(xì)胞上皮生長和刺激產(chǎn)后乳汁分泌。綜上所述，蘿藦可通過TP53、ALB、TNF、IL-6、COMT、MAOA、POR、HTR2A等多靶點調(diào)節(jié)母豬能量與營養(yǎng)代謝、激素水平、情緒狀態(tài)等，其促進(jìn)泌乳的作用機(jī)制可能與調(diào)控催乳素信號通路和雌激素信號通路有關(guān)。

綜上所述，蘿藦主要通過芹菜素、山奈酚、表兒茶素、異鼠李素作用TP53、ALB、TNF、IL-6、COMT、MAOA、POR、HTR2A等靶點調(diào)節(jié)免疫、改善血液循環(huán)促進(jìn)產(chǎn)后母豬泌乳。