玉斯日古楞，白兆星，吳貞思，陳彥汝，么宏強(qiáng)

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010011 ； 2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物疾病臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010011)

花生四烯酸(Arachidonic acid,AA)是一種人體必需脂肪酸，也是一種多不飽和脂肪酸，是在生物體內(nèi)分布最廣、含量最豐富的一種脂肪酸。在心血管系統(tǒng)中，細(xì)胞色素P450(Cytochrome P450,CYP)是代謝AA的主要酶類。AA經(jīng)過細(xì)胞色素P450表氧化酶途徑生成環(huán)氧二十碳三烯酸(Epoxyeicosatrienoic acids,EETs)和20-羥基二十碳四烯酸(20-hydroeicosatetraenoic acid,20-HETE)，這些代謝產(chǎn)物具有較強(qiáng)的生物活性[1-4]。

隨著人們生活水平的提高，糖尿病的發(fā)病率越來越高，糖尿病所導(dǎo)致的心腦血管系統(tǒng)和腎臟等并發(fā)癥也明顯增多。糖尿病的主要病理生理問題是胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞損傷[5]。研究發(fā)現(xiàn)，EETs與糖尿病的發(fā)生有密切關(guān)系，在防治糖尿病過程中具有重要作用[6]。20-HETE在糖尿病、心血管疾病、腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中也具有非常重要的作用[6-8]。有研究表明，11,12-EET和14,15-EET有很強(qiáng)的促進(jìn)有絲分裂作用，它們可以有效促進(jìn)腎臟內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂[9-10]。那么，EETs和20-HETE是否具有促進(jìn)胰島β細(xì)胞增殖的作用？目前尚無定論。因此，本試驗(yàn)將探討EETs和20-HETE對(duì)胰島β細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞來源 胰島β細(xì)胞：MIN6小鼠胰島β細(xì)胞(hz10123)，購(gòu)自上海滬震生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑 PBS(10010023)、青霉素-鏈霉素(15140122)、DMEM培養(yǎng)基(11995065)、胰酶-EDTA溶液(25200056)和胎牛血清(10270106)，均購(gòu)自Gibco公司；20-HETE、11,12-EET(ab141537)、14,15-EET(ab141538)、LY 294002和PI3-kinase抑制劑(ab120243)，均購(gòu)自Abcam公司；20-Hydroxy(H3023)，購(gòu)自Sigma公司；HRP標(biāo)記羊抗小鼠二抗(BA1051)，購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.1.3 主要儀器 流式細(xì)胞分析儀，購(gòu)自Beckman公司；微量移液器，購(gòu)自Eppendorf公司；二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱(3111)和離心機(jī)(MICROCL 17)，均購(gòu)自Thermo公司；生物安全柜(BS-1300IIA2)，購(gòu)自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；倒置熒光顯微鏡(CKX41)，購(gòu)自O(shè)LYMPUS公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代 MIN6細(xì)胞采用胰酶消化、PBS清洗后，加入培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液。取適量細(xì)胞懸液進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色，在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)活細(xì)胞并計(jì)算細(xì)胞密度。取2×106個(gè)細(xì)胞，加10 mL新鮮DMEM培養(yǎng)基至10 cm培養(yǎng)皿中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)到90%以上時(shí)，進(jìn)行試驗(yàn)，其余細(xì)胞凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 CCK-8試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖 將細(xì)胞接種到96孔板上，每孔的細(xì)胞數(shù)量調(diào)整到約2×104個(gè)。培養(yǎng)12 h后將細(xì)胞分組處理(表1)，即分別加入不同濃度EETs或不同濃度比的20-HETE/EETs(1∶10和1∶20)，每組3個(gè)重復(fù)。在不同時(shí)間點(diǎn)(培養(yǎng)12、24 h和48 h)收取細(xì)胞樣品，采用CCK-8方法檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況，測(cè)定OD450 nm值，以明確EETs和20-HETE/EETs對(duì)β細(xì)胞增殖的影響是否具有時(shí)間和濃度依賴性。

表1 細(xì)胞分組和處理Table 1 Cell grouping and treatment

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 將細(xì)胞接種到6孔板上，每孔的細(xì)胞數(shù)量約3×105個(gè)，培養(yǎng)12 h后分組處理細(xì)胞(表2)。繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，胰蛋白酶消化、收集細(xì)胞，PBS清洗2次，使用預(yù)冷的75%酒精4 ℃固定過夜。離心去上清，PBS清洗、重懸，加入終濃度為50 μg/mL的RNase，37 ℃消化30 min后，加入碘化丙啶(PI)染色液避光放置20 min，最后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。用CellQuest軟件、ModFit軟件分析試驗(yàn)結(jié)果，統(tǒng)計(jì)分析各組細(xì)胞周期的分布。

表2 細(xì)胞分組和處理Table 2 Cell grouping and treatment

1.2.4 Western blot檢測(cè)細(xì)胞增殖相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 為探索EETs和20-HETE/EETs對(duì)胰島β細(xì)胞增殖影響的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，采用信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑干預(yù)處理β細(xì)胞增殖(表3)，即給予β細(xì)胞EETs和20-HETE/EETs刺激的同時(shí)，給予PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制劑(LY294002，終濃度為15 mmol/L)，孵育24 h后，收集細(xì)胞，提取蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。蛋白變性10 min，按配方配制SDS-PAGE膠，電泳，轉(zhuǎn)PVDF模，室溫封閉2 h，加一抗4 ℃孵育過夜；次日加二抗于搖床上室溫孵育2 h。加ECL化學(xué)發(fā)光混合液，曝光顯影，使用Image J軟件分析蛋白質(zhì)條帶的灰度值，統(tǒng)計(jì)分析蛋白表達(dá)量。

表3 細(xì)胞分組和處理Table 3 Cell grouping and treatment

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理 應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”方式表示，單因素多組之間比較采用One-way ANOVA，之后組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.01表示差異極顯著，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)細(xì)胞增殖的影響 胰島β細(xì)胞經(jīng)過傳代、計(jì)數(shù)、分組，用EETs和20-HETE/EETs分別處理，12、24 h和48 h時(shí)進(jìn)行CCK-8檢測(cè)。結(jié)果如圖1所示，在12、24 h和48 h時(shí)，與空白組(B組)相比較，溶劑組(C組)對(duì)胰島β細(xì)胞增殖的影響均不顯著(P>0.05)，說明溶劑對(duì)胰島β細(xì)胞增殖無影響。與空白組(B組)相比較，在12 h和24 h時(shí)，濃度為100 nmol/L的14,15-EET(E組)對(duì)胰島β細(xì)胞增殖具有極顯著促進(jìn)作用(P<0.01)，其中12 h時(shí)差異最大(圖1A);在48 h時(shí)，各組間沒有明顯差異性(P>0.05)(圖1C)。

圖1 胰島β細(xì)胞的增殖情況Fig.1 Cell proliferation of pancreatic β cellsA:12 h; B:24 h; C:48 h與空白組(B組)比較，*：P<0.05，**：P<0.01；下同Compared with the blank group(group B)，*：P<0.05，**：P<0.01. The same as below

2.2 對(duì)細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，與空白組(A組)比較，濃度為100 nmol/L的11,12-EET處理組(C組)胰島β細(xì)胞中G0/G1期細(xì)胞由(51.27±1.48)%減少至(42.57±1.06)%；而S期細(xì)胞由(28.81±1.89)%升高至(33.17±1.42)%；G2/M期細(xì)胞由(19.92±0.64)%升高至(24.26±0.83)%，兩組間均差異顯著(P<0.05)；濃度為100 nmol/L的14,15-EET處理組(D組)胰島β細(xì)胞中G0/G1期細(xì)胞由(51.27±1.48)%減少至(44.92±1.85)%，兩組間差異顯著(P<0.05)；S期細(xì)胞由(28.81±1.89)%升高至(29.01±1.87)%，但差異不顯著(P>0.05)；G2/M期細(xì)胞由(19.92±0.64)%升高至(26.07±1.03)%，兩組間差異顯著(P<0.05)。

2.3 影響細(xì)胞增殖的機(jī)制 細(xì)胞使用不同濃度EETs、20-HETE/EETs和抑制劑LY294002處理后，采集細(xì)胞、提取蛋白，采用Western blot檢測(cè)AKT磷酸化水平和PI3K活化狀況。結(jié)果如圖3所示，與空白組(A組)相比較，EETs處理組(C組和D組)的PI3K表達(dá)水平顯著上升(P<0.05)，當(dāng)20-HETE/EETs 聯(lián)合處理(E組和F組)時(shí)，PI3K表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與未加LY294002組(C組和D組)相比較，LY294002處理組(H組和I組)極顯著抑制了PI3K表達(dá)水平(P<0.01)。PI3K蛋白表達(dá)量在11,12-EET組(C組)和14,15-EET組(D組)之間無明顯差異(P>0.05)。

3 討論

糖尿病的發(fā)病率逐年增多,尤其是2型糖尿病的患病率逐漸提高，成為繼腫瘤、心腦血管疾病之后的又一個(gè)嚴(yán)重危害健康的慢性非傳染性疾病[11]，其主要病理生理特點(diǎn)是胰島β細(xì)胞功能衰竭[11-12]。因此，β細(xì)胞損傷和功能障礙是糖尿病發(fā)生發(fā)展的主要原因。也就是說，避免β細(xì)胞損失和功能失調(diào)是改善糖尿病發(fā)展的有效方法[13-14]。研究證明，EETs不僅可以促進(jìn)大鼠胰島素的釋放，還可以促進(jìn)腎臟內(nèi)皮細(xì)胞增殖和再生[9，15-16]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，11,12-EET和14,15-EET有很強(qiáng)的促進(jìn)有絲分裂作用，可有效促進(jìn)腎臟內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂[9-10]。20-HETE能夠調(diào)控體內(nèi)不同的生理作用，在糖尿病、心血管疾病和腫瘤等疾病的進(jìn)程中也具有重要作用[5]。研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病腎病大鼠的腎小球中，CYP4A的表達(dá)和20-HETE的產(chǎn)生會(huì)明顯減少，并且糖尿病大鼠的腎臟受損時(shí)，其20-HETE含量會(huì)明顯減少[6]?？梢?，EETs和20-HETE均與糖尿病的發(fā)生有密切聯(lián)系，但對(duì)它們的具體作用及其機(jī)制尚未深入研究。EETs和20-HETE是否可以促進(jìn)胰島β細(xì)胞的增殖，是否可以保護(hù)胰島β細(xì)胞，使其免受損傷或功能失調(diào)，從而改善糖尿病的發(fā)生發(fā)展？目前尚未定論。

圖2 EETs和20-HETE對(duì)胰島β細(xì)胞細(xì)胞周期的影響Fig.2 Effect of EETs and 20-HETE on the cell cycle of pancreatic β cellsA:空白組(A組)流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞DNA直方圖； B:11,12-EET組(C組)流式細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞DNA直方圖； C:EETs和20-HETE作用后胰島β細(xì)胞細(xì)胞周期的變化A:DNA histogram in control group (group A) detected by flow cytometry; B:DNA histogram in 11,12-EET group (group C) detected by flow cytometry; C:Effects of EETs and 20-HETE on cell cycle of pancreatic β cells

圖3 EETs、20-HETE/EETs和LY294002處理后PI3K/AKT蛋白的表達(dá)水平Fig.3 Expression levels of PI3K/AKT protein after EETs,20-HETE/EETs and LY294002 treatmentA:Western blot 結(jié)果； B:PI3K蛋白表達(dá)水平的比較[與空白組(A組)比較，*：P<0.05; 與未加LY294002組(C組和D組)比較，#:P<0.05，##: P<0.01]A:Western blot results; B:Comparison of PI3K protein expression levels[Compared with the blank group (group A),*:P<0.05; Compared with the non-adding LY294002 groups (group C and D),#:P<0.05,##:P<0.01]

因此，本試驗(yàn)通過CCK-8方法檢測(cè)EETs和20-HETE對(duì)胰島β細(xì)胞增殖的影響。試驗(yàn)結(jié)果顯示，在干預(yù)12 h和24 h時(shí)，濃度為100 nmol/L的14,15-EET對(duì)胰島β細(xì)胞的增殖具有極顯著促進(jìn)作用，在12 h時(shí)其促進(jìn)作用最顯著。但是，以不同比例聯(lián)合使用EETs和20-HETE時(shí)，對(duì)胰島β細(xì)胞的增殖無顯著影響。此結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)，14,15-EET的作用具有時(shí)間和濃度依賴性，這與Xu等[6]的研究結(jié)果一致。綜上所述，使用14,15-EET干預(yù)胰島β細(xì)胞12 h時(shí)，細(xì)胞增殖可以達(dá)到高峰，且其促增殖的最佳濃度為100 nmol/L。但聯(lián)合使用EETs和20-HETE時(shí)，14,15-EET未能顯示出上述促增殖的作用。

為進(jìn)一步探討EETs和20-HETE影響胰島β細(xì)胞增殖的可能機(jī)制，本試驗(yàn)還應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)和Western blot方法分別觀察細(xì)胞周期的變化和PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活情況。細(xì)胞周期的G1期為DNA合成前期，此期為過渡至S期做準(zhǔn)備；S期為DNA合成期，可反映細(xì)胞的分裂活力，增殖旺盛的細(xì)胞處于S期的比例較高；G2期為DNA合成后期，M期為有絲分裂期，(S+G2M)%為增殖指數(shù)，代表了細(xì)胞中增殖細(xì)胞的數(shù)量，在一定程度上可反映細(xì)胞的增殖狀態(tài)。本試驗(yàn)的流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，11,12-EET和14,15-EET處理組(C組和D組)的G0/G1期細(xì)胞減少，S期與G2/M期細(xì)胞增多，說明EETs可能促使靜止態(tài)的G1期細(xì)胞活躍，并向S期轉(zhuǎn)變，使DNA合成量增加，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖。此試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證EETs能夠使胰島β細(xì)胞處于增殖狀態(tài)。Western blot試驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組(A組)相比較，EETs處理組(C組和D組)的PI3K表達(dá)水平顯著上升，但20-HETE和EETs 聯(lián)合使用時(shí)(E組和F組)，PI3K表達(dá)水平反而顯著降低；與未加LY294002組(C組和D組)相比較，當(dāng)使用PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑(LY294002)干預(yù)11,12-EET和14,15-EET處理組細(xì)胞后，顯著抑制了PI3K活化狀況。此結(jié)果提示，EETs能夠促進(jìn)胰島β細(xì)胞的增殖，其分子機(jī)制可能是EETs激活了PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，與既往研究結(jié)論[5]相一致；同時(shí)，本試驗(yàn)結(jié)果也進(jìn)一步說明20-HETE和EETs的聯(lián)合使用對(duì)胰島β細(xì)胞的增殖沒有促進(jìn)作用。

綜上所述，本試驗(yàn)證實(shí)EETs可促進(jìn)小鼠胰島β細(xì)胞的增殖(14,15-EET的作用更加顯著)，其機(jī)制可能是EETs激活了PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，使胰島β細(xì)胞處于增殖狀態(tài)，且其促進(jìn)作用具有時(shí)間和濃度依賴性。但是，20-HETE和EETs的聯(lián)合使用，未顯示出促胰島β細(xì)胞增殖的作用，其機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究。