李曉艷， 莫立穩(wěn)， 程 瑩， 吳綺楠

(1.西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院， 四川 成都 6100312.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬大足醫(yī)院內(nèi)分泌科， 重慶 402360)

糖尿病腎病是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥，是終末期腎功能衰竭的重要誘發(fā)因素。其特征是蛋白尿、腎小球濾過率下降、高血壓、系膜基質(zhì)擴張、腎小球基底膜增厚和腎小管間質(zhì)纖維化[1]。糖尿病腎病進(jìn)展的病理機制，包括炎癥和纖維化。目前糖尿病患者的治療策略主要是血糖控制和降壓/降脂治療；然而，這些措施對糖尿病患者的腎臟并不能起到保護作用。因此，開發(fā)針對糖尿病腎病的新治療方法是一個非常重要的領(lǐng)域。銀杏葉是世界上應(yīng)用最廣泛的植物治療產(chǎn)品之一，其提取物對治療糖尿病性心肌病、高血壓、神經(jīng)退行性疾病、白內(nèi)障等多種疾病具有有益的特性。白果內(nèi)酯是銀杏葉提取物中的一種倍半萜，占2.9%-3.2%。研究表明，白果內(nèi)酯通過調(diào)節(jié)多種信號通路在治療高血糖腦缺血、氧化應(yīng)激和神經(jīng)保護作用中發(fā)揮重要作用[2，3]。白果內(nèi)酯能降低非酒精性脂肪肝炎大鼠的α-平滑肌肌動蛋白陽性表達(dá)，減輕肝纖維化[4]。白果內(nèi)酯可改善鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的未成熟大鼠糖尿病肝損傷和代謝紊亂。然而，白果內(nèi)酯在糖尿病腎病調(diào)節(jié)中的具體作用和機制尚不明確。因此，本研究使用腎小球系膜細(xì)胞系創(chuàng)建了高糖細(xì)胞模型，以評估白果內(nèi)酯的治療效果，并破解可能的抗炎和抗纖維化機制，以期為白果內(nèi)酯在預(yù)防或控制糖尿病腎病中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料:人腎小球系膜細(xì)胞(HMC)(上海雅吉)，白果內(nèi)酯(20mg，含量≥98%；北京Solarbio)，針對細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子2(suppressor of cytokine signaling 2，SOCS2)的小干擾RNA、小干擾RNA陰性對照(上海GenePharma)，SOCS2抗體、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)抗體、結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)抗體、纖連蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)抗體、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附測定法(Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA)試劑盒、白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)ELISA試劑盒(美國Abcam)，Lipofectamine 2000、二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白試劑盒、增強化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific)，ECL試劑盒(北京SBS Genetech)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與高糖損傷:腎小球系膜細(xì)胞HMC在補充10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的低糖DMEM培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)，所處環(huán)境為37℃、5% CO2培養(yǎng)箱。為了模擬高糖環(huán)境，將腎小球系膜細(xì)胞HMC在含30mmoL/L葡萄糖培養(yǎng)基中刺激24h[5]。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染:將對數(shù)期的腎小球系膜細(xì)胞HMC(5×105)接種于6孔板，轉(zhuǎn)染時，使用Lipofectamine 2000，將針對SOCS2的小干擾RNA、小干擾RNA陰性對照分別轉(zhuǎn)染腎小球系膜細(xì)胞HMC，即為干擾SOCS2組和NC組。轉(zhuǎn)染24h后，通過Western blotting進(jìn)行抑制SOCS2轉(zhuǎn)染效率的檢測。每個獨立實驗均重復(fù)3次。

1.4實驗分組:實驗共分為：NG組、HG組、HG+低白果內(nèi)酯組、HG+中白果內(nèi)酯組、HG+高白果內(nèi)酯組、HG+高白果內(nèi)酯+NC組和HG+高白果內(nèi)酯+干擾SOCS2組。NG組腎小球系膜細(xì)胞HMC正常培養(yǎng)，NG組根據(jù)1.2進(jìn)行高糖損傷，HG+低、中、高白果內(nèi)酯組細(xì)胞分別在含6μmoL/L、12μmoL/L、24μmoL/L白果內(nèi)酯[6]和30mmoL/L葡萄糖培養(yǎng)基中處理24h。HG+高白果內(nèi)酯+NC組和HG+高白果內(nèi)酯+干擾SOCS2組細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染小干擾RNA陰性對照、針對SOCS2的小干擾RNA 24h后，在含24μmoL/L白果內(nèi)酯和30mmoL/L葡萄糖培養(yǎng)基中處理24h。

1.5Western blotting檢測TGF-β1、CTGF、FN、SOCS2蛋白表達(dá):腎小球系膜細(xì)胞HMC總蛋白使用RIPA測定緩沖液提取。用BCA蛋白試劑盒檢測蛋白濃度。然后，將40μg蛋白樣品上樣到十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳上，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜。之后，將膜用5%脫脂牛奶的TBST溶液在室溫下封閉1h，用特異性抗體一抗(4℃下孵育過夜)、以及相應(yīng)的二抗(室溫下孵育1h)進(jìn)行免疫印跡，最后通過ECL試劑盒進(jìn)行檢測?？贵w為：TGF-β1抗體、CTGF抗體、FN抗體、SOCS2抗體(均1∶1000稀釋)、對照GAPDH抗體(1∶2000)和辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(1∶8000稀釋)。

1.6ELISA檢測TNF-α、IL-6表達(dá):腎小球系膜細(xì)胞HMC經(jīng)不同處理后，在3500r/min離心并收集上清液。根據(jù)TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒隨附說明步驟，測量TNF-α、IL-6表達(dá)。TNF-α、IL-6表達(dá)通過檢測450nm處的吸光度和標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行檢測。

2 結(jié) 果

2.1白果內(nèi)酯對高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜HMC細(xì)胞中纖維化成分的影響:與NG組相比，HG組腎小球系膜HMC細(xì)胞中纖維化成分TGF-β1、CTGF、FN的蛋白表達(dá)量均增加(P<0.05)；與HG組相比，HG+低、中、高白果內(nèi)酯組腎小球系膜HMC細(xì)胞中纖維化成分TGF-β1、CTGF、FN的蛋白表達(dá)量逐漸減少(P<0.05)，并呈現(xiàn)劑量依賴性，見圖1、表1。

表1 腎小球系膜HMC細(xì)胞中纖維化成分的檢測

圖1 白果內(nèi)酯對腎小球系膜HMC細(xì)胞中TGF-β1、CTGF、FN蛋白表達(dá)的影響

2.2白果內(nèi)酯對高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜HMC細(xì)胞中炎性因子的影響:與NG組相比，HG組腎小球系膜HMC細(xì)胞中炎性因子TNF-α、IL-6表達(dá)水平均升高(P<0.05)；與HG組相比，HG+低、中、高白果內(nèi)酯組腎小球系膜HMC細(xì)胞中TNF-α、IL-6表達(dá)水平逐漸降低(P<0.05)，并呈現(xiàn)濃度依賴性。見表2。

表2 腎小球系膜HMC細(xì)胞中炎性因子的檢測

2.3白果內(nèi)酯對高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜HMC細(xì)胞中SOCS2表達(dá)的影響:HG組比NG組降低腎小球系膜HMC細(xì)胞中SOCS2的蛋白表達(dá)(P<0.05)；HG+低、中、高白果內(nèi)酯組比HG組逐漸提高腎小球系膜HMC細(xì)胞中SOCS2的蛋白表達(dá)(P<0.05)，并呈現(xiàn)濃度依賴性。見圖2、表3。

圖2 白果內(nèi)酯對腎小球系膜HMC細(xì)胞中SOCS2蛋白表達(dá)的影響

表3 腎小球系膜HMC細(xì)胞中SOCS2表達(dá)的檢測

2.4抑制SOCS2轉(zhuǎn)染效率的檢測:腎小球系膜HMC細(xì)胞中轉(zhuǎn)染SOCS2小干擾RNA后，干擾SOCS2組SOCS2的蛋白表達(dá)量比相應(yīng)對照NC組減少了約59.74%(P<0.05)。見圖3、表4。

圖3 SOCS2蛋白表達(dá)的檢測

表4 SOCS2轉(zhuǎn)染效率的檢測

2.5抑制SOCS2對白果內(nèi)酯處理的高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜HMC細(xì)胞纖維化成分及炎性因子的影響:與HG+高白果內(nèi)酯+NC組相比，HG+高白果內(nèi)酯+干擾SOCS2組腎小球系膜HMC細(xì)胞的SOCS2蛋白表達(dá)量減少，TGF-β1、CTGF、FN蛋白表達(dá)量和TNF-α、IL-6表達(dá)水平均提升(P<0.05)，見圖4、表5。

表5 抑制SOCS2對白果內(nèi)酯處理的腎小球系膜HMC細(xì)胞纖維化成分及炎性因子的檢測

圖4 抑制SOCS2對白果內(nèi)酯處理的腎小球系膜HMC細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

糖尿病腎病是一種以蛋白尿和腎小球濾過率下降為特征的慢性炎癥性疾病。其中，系膜細(xì)胞功能障礙會促進(jìn)糖尿病腎病發(fā)展，這是由細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)成分的積累引起的。因此，本研究使用高糖處理的腎小球系膜細(xì)胞系對糖尿病腎病進(jìn)行建模[7]，旨在揭示白果內(nèi)酯在糖尿病腎病中的作用機制。

高糖會加速ECM在腎小球系膜細(xì)胞中的聚集，ECM的過度積累隨后導(dǎo)致腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化。TGF-β1已被確定為糖尿病腎病中ECM蛋白合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，主要負(fù)責(zé)ECM的積累，與腎纖維化和腎小球硬化的發(fā)展密切相關(guān)。CTGF也可能通過抑制基質(zhì)分解和誘導(dǎo)ECM合成而導(dǎo)致糖尿病腎病[8]。研究表明，高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜HMC細(xì)胞中TGF-β1、CTGF、FN的蛋白增加，而白果內(nèi)酯的給藥濃度依賴性的降低了腎小球系膜HMC細(xì)胞中TGF-β1、CTGF、FN的水平，延緩了纖維化的趨勢。與黃茸茸等[6]提供的白果內(nèi)酯抑制非酒精性脂肪肝炎大鼠肝纖維化的結(jié)果相似，提示白果內(nèi)酯可作為治療腎纖維化的潛在抗纖維化劑。

本研究通過檢測炎性細(xì)胞因子，發(fā)現(xiàn)白果內(nèi)酯可以降低高糖刺激的腎小球系膜細(xì)胞中TNF-α、IL-6的表達(dá)。白果內(nèi)酯可下調(diào)葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠血清中TNF-α、IL-6等炎性細(xì)胞因子的水平，減少阿爾茨海默病細(xì)胞和小鼠模型中TNF-α和IL-6釋放以降低神經(jīng)細(xì)胞中的炎癥[9]。而且白果內(nèi)酯降低了高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞中TNF-α、IL-6表達(dá)水平，呈現(xiàn)濃度依賴性。結(jié)果進(jìn)一步證實了白果內(nèi)酯在糖尿病中的抗炎作用，并顯示了調(diào)節(jié)炎性因子在治療糖尿病腎病中的潛在益處。

此外，白果內(nèi)酯可拮抗高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜HMC細(xì)胞中SOCS2的蛋白表達(dá)降低，提示白果內(nèi)酯可能通過調(diào)節(jié)SOCS2來控制糖尿病腎病的進(jìn)展。SOCS2被認(rèn)為是一種炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，影響糖尿病腎病的發(fā)病機制[10]。為了確定白果內(nèi)酯抑制炎性因子的潛在機制，在腎小球系膜細(xì)胞中轉(zhuǎn)染針成功抑制SOCS2后，發(fā)現(xiàn)白果內(nèi)酯對高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜HMC細(xì)胞纖維化成分及炎性因子的抑制作用被逆轉(zhuǎn)。因此可見白果內(nèi)酯在高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞中具有的抗纖維化和抗炎特性可能歸因于其對SOCS2的促進(jìn)。

綜上，白果內(nèi)酯具有減弱糖尿病腎病并抑制高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞炎癥和纖維化的特性。此外，白果內(nèi)酯的抑制作用是通過上調(diào)SOCS2的表達(dá)來實現(xiàn)的，證明白果內(nèi)酯可能潛在的應(yīng)用于預(yù)防或治療糖尿病腎病以及其他與炎癥相關(guān)的糖尿病疾病。