安 莉，汪 紅，馬婧瑋，袁永亮，翟南南，鄭鷺飛，吳緒金,

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術研究所，河南鄭州 450002；2.鄭州大學第一附屬醫(yī)院藥學部，河南鄭州 450052；3.SCIEX中國，北京 100015；4.中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術研究所，北京 100081）

鐵棍山藥（Dioscorea oppositeThunb. cv. Tiegun）為薯蕷科植物薯蕷的塊莖，分布于河南省武陟縣、溫縣等地的山藥品種，其性平味甘，健脾止瀉、補肺益腎，具有“補虛羸、除寒邪熱、補中益氣力、長肌肉、久服耳目聰明、輕身不饑、延年”等功效，屬山藥中的極品[1]。鐵棍山藥富含多糖、蛋白、脂類、黃酮、多酚類等多種活性成分，具有調(diào)節(jié)脾胃、增強免疫、抗氧化、抗腫瘤、抗衰老等作用，兼有食用價值和藥用價值[2-3]。

除了鐵棍山藥的藥用飲片外，目前市場上也不斷涌現(xiàn)出以鐵棍山藥為原料制成的零食或保健品，如鐵棍山藥薯片、鐵棍山藥餅干、鐵棍山藥粉等。然而，無論是在直接食用或加工鐵棍山藥過程中，鐵棍山藥皮一般都直接削除丟棄，造成了極大的資源浪費。目前，關于鐵棍山藥皮的報道尚少，僅見對其所含部分成分的研究，如多糖[4]、黃酮類化合物的提取[5]以及多酚化合物的體外抗氧化作用[6]。這些研究僅關注單類化合物，對其所含化學成分的認識不夠全面，無法反映其整體的化學成分特征。此外，鐵棍山藥皮藥用和營養(yǎng)價值尚不明確，這也嚴重阻礙了其再利用。因此，全面、系統(tǒng)識別鐵棍山藥皮所含的化學成分，并挖掘其相應的分子機制，對于鐵棍山藥皮活性功能物質(zhì)的開發(fā)應用具有重要的指導意義。

超高效液相色譜-四極桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-Q/TOF-MS/MS）具有速度快、靈敏度高、分辨率高等特點[7]，根據(jù)化合物質(zhì)譜信息，結(jié)合相關數(shù)據(jù)庫，能夠?qū)χ胁菟?、復方制劑、天然產(chǎn)物等中的化學成分進行快速分離和鑒定。生物信息學是綜合運用系統(tǒng)生物學、計算機科學、信息技術和數(shù)學理論等技術方法的交叉學科[8]，能夠從中草藥、復方制劑、天然產(chǎn)物機制研究、復雜疾病治療等生命科學的海量數(shù)據(jù)中，發(fā)現(xiàn)、挖掘、闡述其中所包含生物學意義[9]。

聯(lián)合UPLC-Q/TOF-MS/MS和生物信息學的方法越來越多地應用于多成分多靶點多通路的機制研究[10-11]。本研究擬采用UPLC-Q/TOF-MS/MS技術結(jié)合質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫對鐵棍山藥皮中的化學成分進行定性識別，并在此基礎上，利用生物信息學對其潛在的靶點進行預測和功能分析，探討鐵棍山藥皮化合物成分的藥用和營養(yǎng)價值，為鐵棍山藥皮的開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山藥皮 河南省溫縣鐵棍山藥的山藥皮；甲醇、乙腈 色譜級，美國EMD Millipore公司；甲酸 色譜級，美國Sigma公司。

Exion 20AD型超高效液相色譜儀、X500R QTOF型高分辨質(zhì)譜儀（SCIEX OS軟件） 美國SCIEX公司；ME204E電子分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司；Milli-Q Synthesis 超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司；DW-HL398S超低溫冷藏冰箱 中科美菱低溫科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 將鐵棍山藥流水清洗干凈，晾干，削皮后即刻將皮置于-80 ℃環(huán)境中過夜冷凍，取出后迅速于冷凍干燥機內(nèi)-90 ℃真空低溫冷凍干燥，待完全干燥后制成鐵棍山藥皮凍干粉，過8號篩。稱取1.0 g，加入5 mL甲醇:水=1:1（v/v）超聲提取30 min，在10000 r/min的條件下離心10 min，吸取上清液進樣[12]。

1.2.2 色譜條件 Waters HSS T3色譜柱（100×3.0 mm，1.8 μm）；流動相：0.05%甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫程序為：0～1.0 min，3% B；1.0～10 min，3%～30% B；10～20 min，30%～99% B；20～26 min，99% B；26～26.1 min，99%～3% B；26.1～30 min，3% B。進樣盤溫度：15 ℃；流速：0.40 mL/min；柱溫：40 ℃。

1.2.3 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜采用電噴霧離子源ESI檢測，在正、負離子模式下進行樣品采集，開啟動態(tài)背景以扣除干擾。相關參數(shù)設置為：氣簾氣流（CUR）25 psi；霧化氣流速（GS1）50 psi；輔助氣流速（GS2）50 psi；離子源電壓（ISVF）5500/-4500 V；離子源溫度（TEM）500 ℃；捕獲電壓（DP）80 V；碰撞電壓（CE）35±15 V。一級質(zhì)譜m/z掃描范圍設為50～1300 Da，掃描累計時間0.25 s，選擇響應最高的碎片進行二級掃描，m/z掃描范圍設為50～1000 Da，掃描累計時間0.1 s。

1.2.4 化合物鑒定 采用SCIEX OS軟件進行質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)的采集和處理，通過質(zhì)量準確度、同位素豐度、二級譜庫確認及保留時間等，根據(jù)SCIEX自建天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫SCIEX TCM Library自動進行峰提取和篩查，進一步根據(jù)獲得的質(zhì)譜信息結(jié)合參考文獻、有機小分子生物活性數(shù)據(jù)庫（PubChem: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）[13]、人類代謝組數(shù)據(jù)庫（HMDB：https://hmdb.ca/）[14]和植物活性分子數(shù)據(jù)庫（Collective Molecular Activities of Useful Plants:CMAUP）[15]進行鐵棍山藥皮中化合物的鑒定識別。

1.2.5 活性成分篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）將所鑒別的化合物成分進行口服生物利用度（oral bioavailability，OB）和藥物相似度（drug-likeness，DL）的查找。根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫分析平臺篩選標準[16]OB≥20%和DL≥0.1篩選出潛在活性成分。

1.2.6 鐵棍山藥皮-化合物-靶點網(wǎng)絡構建 將篩選出的活性成分利用PubChem數(shù)據(jù)庫找到相應的SMILES信 息，通 過SwissTargetPrediction數(shù) 據(jù)庫（http://www.swisstargetprediction.ch/），設定物種“Homo sapiens”進行檢索，選擇Probability值大于0的值，獲取其潛在的作用靶標[17]，利用Cytoscape 3.8.2分析軟件構建鐵棍山藥皮-化合物-靶點相互關系網(wǎng)絡。

1.2.7 潛在作用靶點功能富集分析 將1.2.6項下獲得的作用靶點，通過R軟件中的ClusterProfiler軟件包進行相關靶點的KEGG通路分析[18]，以P＜0.05為篩選條件，獲得鐵棍山藥皮中目標化合物富集的相關通路，進而分析其藥理和營養(yǎng)作用機理。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于UPLC-Q/TOF-MS/MS平臺的鐵棍山藥皮中化學成分識別

采用上述色譜和質(zhì)譜條件對鐵棍山藥皮提取物中的化學成分進行檢測，其正、負離子模式掃描下質(zhì)譜基峰離子流圖如圖1所示。利用SCIEX OS軟件擬合計算可能的分子式，結(jié)合本地SCIEX TCM Library數(shù)據(jù)庫對鐵棍山藥皮質(zhì)譜離子流圖匹配出的化合物進行前期推測，再根據(jù)參考文獻、CMAUP、PubChem、HMDB等數(shù)據(jù)庫提供的一級、二級離子信息等進行進一步確定，最終鑒別出33種化合物，其中酚酸類9種，黃酮類7種，氨基酸有機酸類5種，糖類2種及其他類10種，以上成分相關歸屬及鑒定信息見表1。

圖1 鐵棍山藥皮提取物在正離子模式和負離子模式下的基峰離子流圖Fig.1 Base peak intensity chromatograms of Dioscorea opposita Thunb. cv. Tiegun peel in positive and negative modes

表1 鐵棍山藥皮提取物中化學成分的鑒定Table 1 Identification of chemical composition of Dioscorea opposita Thunb. cv. Tiegun peel

2.2 活性成分篩選

將鐵棍山藥皮中鑒別所獲得的化合物成分，根據(jù)TCMSP數(shù)據(jù)庫分析平臺篩選標準OB≥20%和DL≥0.1篩選出潛在活性成分10個，見表2。

表2 鐵棍山藥皮中通過OB和DL預測的10個活性成分Table 2 Ten active ingredients predicted by OB and DL in Dioscorea opposita Thunb. cv. Tiegun peel

2.3 潛在作用靶標預測和網(wǎng)絡構建

進一步通過SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫對獲得的10個化合物靶點進行預測，去掉重復基因名稱，共獲得348個潛在作用靶點。利用Cytoscape 3.8.2軟件構建出鐵棍山藥皮-化合物-靶點網(wǎng)絡，見圖2。

圖2 鐵棍山藥皮-化合物-靶點網(wǎng)絡Fig.2 Network of Dioscorea opposita Thumb peel-compound-target network

網(wǎng)絡中連接度值表明此化合物或靶點的重要程度，化合物的連接度分析發(fā)現(xiàn)，10個化合物中芹菜素、金合歡素、甘草素、山藥素I、原花青素B1、腺苷、雙去甲基姜黃素和丁香酸葡萄糖苷這8個化合物的連接度值均在60以上，其中芹菜素、金合歡素和甘草素的連接度值均大于100（圖3A），上述化合物可能為鐵棍山藥皮中潛在發(fā)揮功效的重要化合物；碳酸酐酶2（CA2）、絲/蘇氨酸蛋白激酶Pim-1（PIM1）、二肽基肽酶4（DPP4）、環(huán)加氧酶1（PTGS1）、碳酸酐酶9（CA9）、碳酸酐酶1（CA1）、雌激素受體α（ESR1）、環(huán)加氧酶 2（PTGS2）、糖原合成酶激酶3β（GSK3B）和蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸1（PTPN1）為連接度排名前10的作用靶點（圖3B），其可能為鐵棍山藥皮作用的主要靶點。

圖3 網(wǎng)絡中重要化合物靶點數(shù)和作用的主要靶點Fig.3 Top ten important compounds and primary targets of the network

續(xù)表 1

2.4 潛在作用靶點KEGG功能富集分析

將獲得的潛在作用靶基因通過R軟件中的ClusterProfiler軟件包進行KEGG功能富集分析，其中富集程度最高且排名前10條重要代謝通路分別為：PI3K-Akt信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化通路（Lipid and atherosclerosis）、癌癥蛋白多糖信號通路（Proteoglycans in cancer）、HIF-1信號通路（HIF-1 signaling pathway）、前列腺癌（Prostate cancer）、內(nèi)分泌抵抗（Endocrine resistance）、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥性（EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance）、AGE-RAGE信號通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用信號通路（AGERAGE signaling pathway in diabetic complications）、非小細胞肺癌通路（Non-small cell lung cancer）和胰腺癌通路（Pancreatic cancer），見圖4。

圖4 化合物靶點的KEGG通路分析（Top10）Fig.4 KEGG pathway analysis of compound targets （Top10）

KEGG通路富集分析顯示，鐵棍山藥皮活性成分對應的通路主要集中在細胞信號通路、癌癥和代謝類疾病治療等方面。其中，在細胞信號通路上，分別有48和34個基因富集在PI3K-Akt信號通路和HIF-1信號通路；抗癌癥方面，分別有38、32、25、24和23個基因富集在癌癥蛋白多糖信號通路、前列腺癌通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥通路、非小細胞肺癌通路和胰腺癌通路等通路上面；調(diào)節(jié)代謝系統(tǒng)方面，分別41、25和29個基因富集在脂質(zhì)和動脈粥樣硬化通路、AGE-RAGE信號通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用信號通路和內(nèi)分泌抵抗通路。圖5展示了這些KEGG通路與靶基因之間的相互關系。

圖5 KEGG通路與靶基因相互關系網(wǎng)絡Fig.5 KEGG pathway and target gene correlation network

3 討論與結(jié)論

針對鐵棍山藥中化合物成分及其藥理活性的研究較多，相對而言，鐵棍山藥皮的相關研究報道較少[4-6]。本文利用UPLC-Q/TOF-MS/MS平臺，分析并鑒別出了鐵棍山藥皮中的33種化合物，為其成分的識別和潛在價值奠定了前期基礎；通過生物信息學分析方法，找出鐵棍山藥皮中發(fā)揮功效的關鍵化學成分，其中芹菜素、金合歡素、甘草素、去二甲氧基姜黃素、山藥素I等物質(zhì)具有良好的生物活性。如芹菜素具有抗炎、抗腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移、保護肝功能、抗動脈硬化和腦血栓、降壓和鎮(zhèn)靜抗焦慮等功效[29]，金

合歡素具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、保護心臟和神經(jīng)系統(tǒng)等多種藥理活性[30]，甘草素具有良好的抗癌活性和抗腫瘤作用[31]，去二甲氧基姜黃素具有抗細胞凋亡、抗氧化和抗炎作用[32]，山藥素I具有良好的抗炎作用[33]，由此可見，鐵棍山藥皮可能通過多成分共同發(fā)揮其藥用和營養(yǎng)價值。同時，這些功能成分的鑒別對于鐵棍山藥皮中營養(yǎng)與藥用功能物質(zhì)的開發(fā)和利用也有著重要的參考意義。

鐵棍山藥皮-化合物-靶點網(wǎng)絡研究發(fā)現(xiàn)，鐵棍山藥皮具有多個作用靶點，其中重要潛在靶點包括癌癥腫瘤相關基因（PIM1）、治療糖尿病代謝相關基因（GSK3B、PTPN1、DPP4）、雌激素受體（ESR1）、環(huán)加氧酶（PTGS1、PTGS2）和多種碳酸酐酶（CA2、CA9、CA1）等，這些基因與癌癥腫瘤、糖尿病、細胞內(nèi)信號傳導、細胞生長和增殖調(diào)控及代謝等密切相關，體現(xiàn)了鐵棍山藥皮多成分-多靶點系統(tǒng)調(diào)節(jié)的作用機制。研究將成分對應的靶基因進行KEGG富集分析，明確了鐵棍山藥皮成分靶點對應的疾病主要集中在腫瘤癌癥、細胞信號傳導、糖尿病及代謝類等相關途徑，這一發(fā)現(xiàn)也為藥物的進一步研發(fā)提供了科學依據(jù)。

本研究采用UPLC-Q/TOF-MS/MS分析技術進行了鐵棍山藥皮中化學成分的鑒別，通過生物信息學預測了潛在活性化合物具有的多種藥理活性，初步明確了鐵棍山藥皮具有的藥用和營養(yǎng)價值，但鐵棍山藥皮尚需進一步深入挖掘和研究。首先，對鐵棍山藥皮中化合物成分的提取工藝、定性和定量分析研究十分必要；其次，本文通過生物信息學技術建立的山藥皮-化合物-靶點網(wǎng)絡中，所涉及的重要化合物和重要靶點需深入研究；最后，鐵棍山藥皮的再利用過程，需要建立規(guī)范化流程，進而可以形成產(chǎn)品，有望作為保健品或者中醫(yī)藥產(chǎn)品應用于人類疾病的預防和治療。由此可見，本研究為鐵棍山藥皮資源的有效利用提供了物質(zhì)基礎和開發(fā)依據(jù)，也為進一步延長鐵棍山藥的產(chǎn)業(yè)鏈、提高其附加值提供了理論數(shù)據(jù)。