陽鳳嬌，李珍艷，吳雪琪，張良，曾沛斌*

(1.四川大學(xué) 華西公共衛(wèi)生學(xué)院/華西第四醫(yī)院，成都 610044；2.西華大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，成都 610039)

郫縣豆瓣醬是中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品,迄今已有300多年的歷史,被列為中國(guó)非物質(zhì)文化遺產(chǎn)。郫縣豆瓣醬不僅生產(chǎn)工藝十分獨(dú)特,也因其紅潤(rùn)油亮、醬香濃厚等特點(diǎn)在我國(guó)醬類調(diào)味品中獨(dú)樹一幟,被譽(yù)為“川菜之魂”,更是我國(guó)著名的地理標(biāo)志性產(chǎn)品[1]。郫縣豆瓣醬的發(fā)酵生產(chǎn)過程包括制瓣、制椒、后熟等流程[2-5],多種真菌(以霉菌為主)在發(fā)酵過程中起到了關(guān)鍵作用,賦予了郫縣豆瓣醬特殊的風(fēng)味,但隨之而來的是潛在真菌毒素污染的問題,特別是多種曲霉產(chǎn)生的黃曲霉毒素和赭曲霉毒素。黃曲霉毒素是一類具有肝毒性、致突變、免疫抑制和致癌性的化合物,國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)將其歸為Ⅰ類致癌物;赭曲霉毒素具有腎毒性、肝毒性、致畸性和免疫抑制等特性,為Ⅱ類致癌物[6-10]。兩類真菌毒素的熱穩(wěn)定性高,且毒性易累積,長(zhǎng)期攝入將一定程度上提高患癌風(fēng)險(xiǎn)[11]。本課題組在前期研究中,利用深度測(cè)序技術(shù),首次深度解析了郫縣豆瓣醬后熟發(fā)酵過程中的微生物演替規(guī)律,發(fā)現(xiàn)郫縣豆瓣醬后熟發(fā)酵核心物種中存在一定豐度的黃曲霉和赭曲霉[12];同時(shí),從不同來源(工廠、作坊、家庭自制)豆瓣醬中發(fā)現(xiàn)了不同程度的黃曲霉毒素B1污染[13]。但是,除黃曲霉毒素B1以外,郫縣豆瓣醬中其他真菌毒素的污染情況還有待調(diào)查。

與此同時(shí),前期豆瓣醬真菌毒素污染的調(diào)查多采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA),但此法易出現(xiàn)假陽性反應(yīng),且定量結(jié)果不穩(wěn)定[14-16]。高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)是國(guó)標(biāo)推薦的用于黃曲霉毒素(aflatoxins, AFs)和赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)檢測(cè)的另一種方法,且有研究表明，相比于ELISA,HPLC對(duì)真菌毒素具有更好的檢測(cè)效能[17]。在HPLC檢測(cè)流程中,樣本的前處理十分重要,目前國(guó)標(biāo)中推薦的樣本前處理方法是固相凈化柱法,成本較高。QuEChERS(Quick,Easy,Cheap,Effective,Rugged,Safe,QuEChERS)是近年來快速發(fā)展起來的一種樣本前處理技術(shù),具有快速、簡(jiǎn)單、成本低、高效、安全等特點(diǎn),已大量應(yīng)用于多種樣本(如飼料、谷物、果蔬、香料等)的前處理和真菌毒素檢測(cè)中[18-24]。但是,尚未有研究報(bào)道利用QuEChERS-HPLC法對(duì)豆瓣醬中的真菌毒素進(jìn)行檢測(cè)。

因此,本研究建立和優(yōu)化了針對(duì)豆瓣醬的QuEChERS-HPLC法,見圖1。對(duì)其中5種真菌毒素即黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1, AFB1)、黃曲霉毒素B2(aflatoxin B2, AFB2)、黃曲霉毒素G1(aflatoxin G1, AFG1)、黃曲霉毒素G2(aflatoxin G2, AFG2)和赭曲霉毒素A(ochratoxin A, OTA)的污染情況進(jìn)行了全面調(diào)查;揭示了郫縣豆瓣醬中除AFB1之外最受關(guān)注的4種真菌毒素的污染狀況,為豆瓣醬真菌毒素低成本定性、定量檢測(cè)提供了方法學(xué)支撐,為后續(xù)發(fā)酵工藝的優(yōu)化和食品質(zhì)量安全控制提供了理論依據(jù)。

圖1 QuEChERS-高效液相色譜法測(cè)定郫縣豆瓣醬中5種真菌毒素含量的流程Fig.1 Process of determination of five mycotoxins' content in Pixian broad bean paste by QuEChERS-HPLC

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

5種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%):黃曲霉毒素B1(2.00 μg/mL)、黃曲霉毒素B2(2.15 μg/mL)、黃曲霉毒素G1(2.00 μg/mL)、黃曲霉毒素G2(1.90 μg/mL)、赭曲霉毒素A(10.00 μg/mL),均購(gòu)自壇墨質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。

甲醇、乙腈、正己烷(均為色譜純)、三氟乙酸(分析純)、氯化鈉(優(yōu)級(jí)純):天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;無水硫酸鎂粉末、檸檬酸鈉、檸檬酸氫二鈉(均為優(yōu)級(jí)純):天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;乙二胺-N-丙基硅烷(PSA,NanoChrom公司)、次氯酸鈉(均為分析純):天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠;冰乙酸(分析純):天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司;超純水(實(shí)驗(yàn)室一級(jí)水):賽默飛世爾科技公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UltiMate?3000 RSLC快速液相色譜儀(配備熒光檢測(cè)器)、ST16R 低溫高速離心機(jī) 賽默飛世爾科技公司;NanoChrom ChromCore C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm) 納譜分析技術(shù)(蘇州)有限公司;NEVAP系列氮吹儀 美國(guó)Organomation公司;生物安全柜、0～4 ℃和-22 ℃冰箱 青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 豆瓣醬樣品前處理

1.3.1.1 試樣提取

將豆瓣醬樣品用組織勻漿機(jī)搗碎,混勻備用,稱取兩份2 g(精確到0.1 g)試樣于50 mL離心管中,分別加入20 mL乙腈-水(84∶16,體積比)和20 mL乙腈-水-冰乙酸(84∶15∶1,體積比)提取液,充分振蕩后超聲提取10～20 min,備用。

1.3.1.2 試樣凈化、濃縮

每份樣品中加入4 g無水硫酸鎂、1 g氯化鈉、1 g檸檬酸鈉、0.5 g檸檬酸氫二鈉,渦旋振蕩1 min后于6 000 r/min下離心5 min。離心結(jié)束后取全部上清液于另一50 mL離心管中,加入3 g無水硫酸鎂、0.5 g PSA粉末,渦旋振蕩1 min后于10 000 r/min下離心2 min。離心結(jié)束后取全部上清液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中,分別得到AFs和OTA 的提取液。將裝有提取液的離心管置于氮吹儀上,50 ℃水浴下氮吹至近干。

1.3.1.3 試樣轉(zhuǎn)移

AFBs提取液:氮吹結(jié)束后,在15 mL離心管中依次加入200 μL三氟乙酸、800 μL乙腈-水(1∶9,體積比),渦旋 30 s 溶解殘留物,室溫黑暗條件下衍生 20 min,衍生結(jié)束后,使用一次性無菌注射器吸取全部液體,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾,于進(jìn)樣瓶中以備進(jìn)樣。

OTA 提取液:氮吹結(jié)束后,在15 mL離心管中加入1 mL 初始流動(dòng)相乙腈-水-乙酸(48∶51∶1,體積比),渦旋30 s溶解殘留物,使用一次性無菌注射器吸取全部液體,經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾，于進(jìn)樣瓶中以備進(jìn)樣。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.3.2.1 AFs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液

AFs混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制:準(zhǔn)確移取AFB1和AFG1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液各 0.25 mL,AFB2和 AFG2標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液各0.15 mL于1 mL 棕色容量瓶中,加入乙腈定容。密封后混勻,標(biāo)記為黃曲霉毒素混合工作液1。取100 μL黃曲霉毒素混合工作液1于另一1 mL棕色容量瓶中,加入乙腈定容,密封混勻,標(biāo)記為黃曲霉毒素混合工作液2。取100 μL黃曲霉毒素混合工作液2于另一1 mL 棕色容量瓶中,加入乙腈定容,密封混勻,標(biāo)記為黃曲霉毒素混合工作液3。3種黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)工作液均于-20 ℃下避光保存,備用。

AFs混合標(biāo)準(zhǔn)工作液配制:分別準(zhǔn)確移取黃曲霉毒素10,50 μL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液3、20,50 μL 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液2和10,20,40 μL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液1于進(jìn)樣瓶中,分別作為標(biāo)準(zhǔn)系列 1，2，3，4，5，6，7,均加入 200 μL 三氟乙酸,再加入乙腈-水(1∶9,體積比)定容至1 mL,混勻后于黑暗中衍生 20 min。各混合標(biāo)準(zhǔn)系列中4種黃曲霉毒素濃度見表 1。

表1 黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)液濃度Table 1 Concentration of aflatoxin mixed standard solution

黃曲霉毒素單型標(biāo)準(zhǔn)溶液配制:配制表1中相應(yīng)濃度的4 種單型黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液,衍生后經(jīng)HPLC確定各自的保留時(shí)間,并以此作為定性依據(jù)。

1.3.2.2 OTA 標(biāo)準(zhǔn)溶液

OTA 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制:準(zhǔn)確移取OTA 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液100 μL于1 mL棕色容量瓶中,加入甲醇-乙腈(50∶50,體積比)定容,密封后混勻,標(biāo)記為OTA 標(biāo)準(zhǔn)工作液1。取100 μL OTA 混合工作液1于另一1 mL棕色容量瓶中,加入甲醇-乙腈(50∶50,體積比)定容,密封混勻,標(biāo)記為 OTA 標(biāo)準(zhǔn)工作液2。兩種 OTA 標(biāo)準(zhǔn)工作液均于-20 ℃下避光保存,備用。

OTA 標(biāo)準(zhǔn)工作液配制:分別準(zhǔn)確移取黃曲霉毒素10,50,100 μL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液2和20,50 μL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液1于進(jìn)樣瓶中,加入流動(dòng)相定容至1 mL,混勻后配制成濃度分別為1,5,10,20,50 ng/mL 的OTA 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

1.3.3 色譜條件

AFs的測(cè)定:色譜柱:NanoChrom ChromCore C18柱(150 mm×4.6 mm, 5.0 μm);柱溫:40 ℃;樣品溫度25 ℃;進(jìn)樣體積50 μL;分析時(shí)間13 min;流速1.0 mL/min;流動(dòng)相A為水,流動(dòng)相B為甲醇-乙腈(50∶50,體積比);梯度洗脫程序:40% B(0～6 min),75% B(8～10 min),100% B(10.2～11.2 min),24% B(11.5～13 min);激發(fā)波長(zhǎng):360 nm,發(fā)射波長(zhǎng):440 nm。

OTA 的測(cè)定:色譜柱:NanoChrom ChromCore C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫:35 ℃;樣品溫度25 ℃,進(jìn)樣體積50 μL,分析時(shí)間15 min;流速1 mL/min;流動(dòng)相為水-乙腈-冰乙酸(51∶48∶1,體積比)的混合溶液;洗脫程序:流動(dòng)相梯度洗脫(0～15 min);激發(fā)波長(zhǎng):333 nm,發(fā)射波長(zhǎng):460 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 確定色譜條件

流動(dòng)相梯度洗脫的程序?qū)τ谕ㄟ^HPLC 實(shí)現(xiàn)對(duì)4種黃曲霉毒素同時(shí)定量來說十分重要。實(shí)驗(yàn)表明,根據(jù)GB 5009.22—2016第二法提供的洗脫程序不能得到4個(gè)單獨(dú)的黃曲霉毒素色譜峰,即無法對(duì)4種黃曲霉毒素同時(shí)定量。之后發(fā)現(xiàn)提高初始流動(dòng)相中有機(jī)相的比例能有效改善這種情況,當(dāng)梯度洗脫程序?yàn)?0% B(0～6 min),75% B(8～10 min),100% B(10.2～11.2 min),24% B(11.5～13 min)時(shí),色譜圖上呈現(xiàn)4個(gè)完全獨(dú)立的色譜峰,意味著利用上述洗脫程序,能用預(yù)先配制的黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液實(shí)現(xiàn)對(duì)4種黃曲霉毒素的單獨(dú)定量,見圖2。赭曲霉毒素A 的洗脫程序?yàn)樗?乙腈-冰乙酸(51∶48∶1,體積比)的混合溶液等度洗脫15 min,標(biāo)準(zhǔn)曲線呈良好的線性關(guān)系,意味著利用上述洗脫程序能實(shí)現(xiàn)對(duì)赭曲霉毒素的準(zhǔn)確定量,色譜圖見圖3。

圖2 經(jīng)高效液相色譜分離的黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)工作液色譜圖Fig.2 Chromatogram of aflatoxin mixed standard working solution separated by HPLC注:濃度為黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)序列7(AFB1、AFG1濃度為20 ng/mL,AFB2、AFG2 濃度為12 ng/mL)。

圖3 經(jīng)高效液相色譜分離的赭曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)工作液色譜圖Fig.3 Chromatogram of ochratoxin standard working solution separated by HPLC注:赭曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度是50 ng/mL。

2.2 確定提取條件

在實(shí)驗(yàn)過程中,樣本提取液的選擇直接影響回收率的高低,選擇提取效率高的提取液能讓實(shí)驗(yàn)獲得較高的回收率,本實(shí)驗(yàn)對(duì)黃曲霉毒素和赭曲霉毒素的提取液進(jìn)行了優(yōu)化。提取液乙腈-水(84∶16,體積比)對(duì)豆瓣醬樣品中黃曲霉毒素的提取率較高,加標(biāo)回收率為74.26%～112.92%,雖然在低濃度時(shí)回收率較低,但是豆瓣醬樣本基質(zhì)復(fù)雜,綜合考慮可接受。該提取液對(duì)赭曲霉毒素的提取率低,加標(biāo)回收率在40%～50%,分析赭曲霉毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)其含有羧基基團(tuán),這會(huì)導(dǎo)致其在堿性和中性環(huán)境中極不穩(wěn)定,易降解損失,提取液中添加適量甲酸或乙酸可有效提高回收率[25]。因此，將赭曲霉毒素提取液更換為乙腈-水-冰乙酸(84∶15∶1,體積比)后,回收率為87.35%～108.79%,達(dá)到要求,同時(shí)該研究還發(fā)現(xiàn),若利用上述提取液作豆瓣醬中黃曲霉毒素的提取液,則黃曲霉毒素的回收率會(huì)降低到60%～70%,因此最后分別選用乙腈-水(84∶16,體積比)和乙腈-水-冰乙酸(84∶15∶1,體積比)作為豆瓣醬樣本中黃曲霉毒素和赭曲霉毒素的提取液。

2.3 確定衍生條件

在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)盡管高濃度的混合黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)工作液的色譜峰完全分離,但存在AFB1與AFG1色譜峰響應(yīng)值極低甚至無響應(yīng)值的問題,導(dǎo)致無法進(jìn)行后續(xù)的定性、定量工作?？紤]到可能是AFB1與AFG1本身的熒光信號(hào)較弱,因此加入一定量三氟乙酸作衍生劑,向AFB1與AFG1結(jié)構(gòu)中嵌入特殊的熒光基團(tuán)以提高檢測(cè)時(shí)的靈敏度。實(shí)驗(yàn)表明,向氮吹后所得產(chǎn)物中加入200 μL三氟乙酸、800 μL乙腈-水(1∶9,體積比),在室溫黑暗條件下衍生20 min后,AFB1和AFG1色譜峰的響應(yīng)值均顯著提高(見圖4),可用于后續(xù)的定性定量工作。

圖4 衍生前后黃曲霉毒素色譜圖對(duì)比Fig.4 Comparison of aflatoxin chromatograms before and after derivatization注:a為衍生前黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)工作液色譜圖,b為衍生后黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)工作液色譜圖;濃度為黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)序列4(AFB1、AFG1 濃度為2.5 ng/mL,AFB2、AFG2 濃度為1.5 ng/mL)。

2.4 去除基質(zhì)效應(yīng)干擾

選取不含真菌毒素的郫縣豆瓣醬樣本(基質(zhì)),加入前述不同濃度的真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)工作液,采用相同的處理方法,計(jì)算各真菌毒素的回收率,發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)測(cè)定的4種黃曲霉毒素的回收率均在50%左右,未能滿足方法學(xué)要求,赭曲霉毒素的回收率為87.35%～108.79%,滿足方法學(xué)要求。同時(shí)用加入空白樣本后的黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率與最初黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值評(píng)價(jià)郫縣豆瓣醬樣本對(duì)黃曲霉毒素的基質(zhì)效應(yīng),比值在0.8～1.2視為基質(zhì)效應(yīng)不明顯,比值大于1.2視為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng),比值小于0.8視為基質(zhì)抑制效應(yīng)。豆瓣醬樣本中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的基質(zhì)效應(yīng)均小于0.8,因此在測(cè)定黃曲霉毒素的含量時(shí),必須去除郫縣豆瓣醬樣本的基質(zhì)干擾。本實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)匹配的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量校準(zhǔn),將4種黃曲霉毒素的回收率水平提高至74.26%～112.92%。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限、定量限結(jié)果

根據(jù)樣本中5種真菌毒素,分別配制不同濃度的黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和赭曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液,選取真菌毒素空白的樣本作為基質(zhì),按照1.3.1中流程進(jìn)行分析,以各組分的峰面積作為縱坐標(biāo),各真菌毒素的濃度作為橫坐標(biāo),分別得到黃曲霉毒素和赭曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。將配制好的最低濃度真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液添加到空白樣品中,按照上述方法進(jìn)行處理進(jìn)樣,信噪比S/N=3為檢出限,S/N=10為定量限。結(jié)果顯示,5種真菌毒素的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線線性關(guān)系良好,決定系數(shù)R2均大于0.99。

表2 真菌毒素的線性關(guān)系、檢出限和定量限Table 2 Linear relationship, limit of detection and limit of quantification of mycotoxins

由表2可知,本研究方法檢出限為0.01～0.16 μg/kg,其中,黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2的檢出限和定量限均低于GB 2761—2017《食品中真菌毒素限量》中的相應(yīng)指標(biāo)。

2.6 方法的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

由于不同豆瓣醬樣本的基質(zhì)效應(yīng)可能存在差別,為探究其對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響,本實(shí)驗(yàn)針對(duì)3個(gè)不同的豆瓣醬空白樣品設(shè)計(jì)了低、中、高3 個(gè)水平進(jìn)行每種真菌毒素的加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn),計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation, RSD)。5種真菌毒素的加標(biāo)回收率和RSD見表3,說明本實(shí)驗(yàn)方法滿足實(shí)驗(yàn)要求。

表3 不同豆瓣醬空白樣品的加標(biāo)回收率及精密度(n=3)Table 3 Spiked recovery rates and precision of different broad bean paste blank samples (n=3)

2.7 郫縣豆瓣醬樣品檢測(cè)結(jié)果

對(duì)從四川省成都市取樣的60份郫縣豆瓣醬樣品進(jìn)行了黃曲霉毒素含量的測(cè)定,檢測(cè)結(jié)果見表4,共在22份樣本中檢出真菌毒素,并且上述陽性樣本中只存在1種真菌毒素的污染,真菌毒素的污染率為36.7%。6份樣品檢出AFB1,濃度范圍為0.12～9.24 μg/kg,參考GB 2761—2017的限量標(biāo)準(zhǔn)(5.0 μg/kg),有3份超過限量值;8份樣品中檢出AFB2,濃度范圍為0.06～0.43 μg/kg;5份樣品中檢出AFG1,濃度范圍為0.12～12.64 μg/kg;3份樣品中檢出AFG2,濃度范圍為0.06～1.93 μg/kg;同時(shí)對(duì)上述60份郫縣豆瓣醬樣品進(jìn)行了赭曲霉毒素A含量的測(cè)定,共有8份樣品檢出OTA,濃度范圍為6.01～15.30 μg/kg,陽性樣本的檢測(cè)結(jié)果見表4。

表4 郫縣豆瓣醬樣本真菌毒素含量的檢測(cè)結(jié)果Table 4 Detection results of mycotoxin content in Pixian broad bean paste samples

3 結(jié)論

本研究建立了QuEChERS-高效液相色譜法測(cè)定豆瓣醬中5種真菌毒素含量的方法。樣品分別經(jīng)乙腈-水(84∶16,體積比)和乙腈-水-冰乙酸(84∶15∶1,體積比)提取黃曲霉毒素和赭曲霉毒素A,加入2008版改良QuEChERS法鹽包振搖離心,取上清液氮吹;黃曲霉毒素提取液氮吹后加入三氟乙酸進(jìn)行衍生,赭曲霉毒素A提取液氮吹后直接用初始流動(dòng)相定容,進(jìn)樣后經(jīng)C18色譜柱分離,色譜峰保留時(shí)間定性,基質(zhì)匹配的真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液用外標(biāo)法定量,5種真菌毒素在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。采用QuEChERS作前處理,成本遠(yuǎn)低于目前普遍采用的免疫親和柱法,操作更加簡(jiǎn)單快捷,同時(shí)也可去除大部分基質(zhì)干擾物,結(jié)合高效液相色譜法可實(shí)現(xiàn)對(duì)郫縣豆瓣醬中黃曲霉毒素和赭曲霉毒素的準(zhǔn)確定性定量。該方法經(jīng)過優(yōu)化后對(duì)5種真菌毒素的檢出限達(dá)到0.01～0.03 μg/kg,靈敏度較高,滿足產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督的要求。

本研究在郫縣豆瓣醬樣品中檢出5種真菌毒素,其中黃曲霉毒素B2和赭曲霉毒素A 的污染率最高,均為13.3%,其次是黃曲霉毒素B110%,黃曲霉毒素G18.3%和黃曲霉毒素G25%?？梢钥闯鯞族黃曲霉毒素的污染率高于G族黃曲霉毒素,越來越多的研究表明這可能與樣本中存在的產(chǎn)毒真菌有關(guān)[26-27],一項(xiàng)針對(duì)辣椒粉中產(chǎn)毒真菌的研究表明,在辣椒粉中分離出的所有產(chǎn)黃曲霉毒素的菌株中,96.9%的菌株只產(chǎn)生B族黃曲霉毒素,僅3.1%的菌株同時(shí)產(chǎn)生B族和G族黃曲霉毒素[28];黃曲霉毒素B1作為Ⅰ類致癌物,各個(gè)國(guó)家都對(duì)黃曲霉毒素B1在食品中的限量做了明確且嚴(yán)格的規(guī)定,包括我國(guó)在內(nèi)的大多數(shù)國(guó)家都規(guī)定了黃曲霉素B1在調(diào)味品中的最大含量為5 μg/kg,除此之外，歐盟還規(guī)定了總黃曲霉毒素(AFs)在調(diào)味品中的最大含量為10 μg/kg,但我國(guó)缺乏調(diào)味品中對(duì)AFs含量的規(guī)定;赭曲霉毒素A 作為Ⅱ類致癌物,歐盟規(guī)定其在調(diào)味品中的限量為15 μg/kg[29],本研究在60份豆瓣醬中檢出8份OTA 為陽性,有6份含量均超過了10 μg/kg,有1份為15.2 μg/kg,超過了歐盟的限量標(biāo)準(zhǔn),與此同時(shí)我國(guó)還沒有豆瓣醬中OTA 限量的規(guī)定,因此為了避免食品安全問題的發(fā)生,有必要建立豆瓣醬或者調(diào)味品中AFs和OTA 的限量標(biāo)準(zhǔn)。