杜雙秋，王 蕓，孫林林，裴文俊，高家林,2，章 堯

(1.皖南醫(yī)學(xué)院 a.安徽省活性生物大分子研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室；c.藥學(xué)院，安徽 蕪湖 241002；2.皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 內(nèi)分泌科，安徽 蕪湖 241001)

原發(fā)性肝癌目前是世界上第三大致命癌癥[1]。作為原發(fā)性肝癌的主要病理分型，肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的五年生存率為18%，僅次于胰腺癌[2]。手術(shù)治療是目前最具潛力的根治性療法[3]。但由于HCC惡性程度高、病情進(jìn)展迅速以及易轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，有機(jī)會進(jìn)行手術(shù)的HCC患者比例較低。因此，HCC早期標(biāo)志物和精準(zhǔn)治療靶點(diǎn)的探尋十分重要。

多聚(rC)結(jié)合蛋白4[Poly(rC) binding protein 4，PCBP4]是PCBP家族的成員之一，是一種RNA結(jié)合蛋白。PCBP4在轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控過程中起關(guān)鍵作用，如mRNA的穩(wěn)定性、選擇性剪接和蛋白翻譯過程[3-4]。PCBP家族亦被證明與癌癥進(jìn)展密切相關(guān)，主要集中于甲狀腺癌和前列腺癌[5-7]?？鼓[瘤藥物在發(fā)揮抑制腫瘤的過程中參與調(diào)控PCBP4的表達(dá)[8]。研究指出在低分化和高度增殖的肺腺癌和鱗狀細(xì)胞癌中PCBP4的表達(dá)水平明顯下調(diào)[9]。PCBP4也被證明是一種新的p53靶基因[10]。p53是一種腫瘤抑制因子，其可通過誘導(dǎo)細(xì)胞基因參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)來抑制細(xì)胞增殖。在HCC中，PCBP4的影響作用尚未報道。本研究旨在探討PCBP4的表達(dá)對HCC增殖的影響及其可能機(jī)制，為肝癌的發(fā)生發(fā)展提供潛在的診斷標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫分析 使用癌癥基因組圖譜(TCGA：http://tcgadata.nci.nih.go-v/tcga/)數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)采用Wilcox檢驗(yàn)方法分析肝癌配對樣本(癌旁組織50例，癌組織50例)與非配對樣本(癌旁組織50例，癌組織374例)中PCBP4基因的差異性表達(dá)；采用Kaplan-Meier Plotter在線分析PCBP4高表達(dá)組與PCBP4低表達(dá)組中肝癌患者的預(yù)后情況。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞HepG2和Hep3B細(xì)胞購于上海中科院細(xì)胞庫。細(xì)胞在含有10%胎牛血清的DMEM(Gibco,USA)培養(yǎng)基中于37℃和5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與細(xì)胞模型構(gòu)建 PCBP4-siRNA購于廣州瑞博生物科技有限公司。siRNA靶序列：GCGAGACTGTAAAGCGAAT。根據(jù)LipofectamineTM3000(賽默飛-L3000015)轉(zhuǎn)染試劑的操作說明，細(xì)胞密度在70%～80%匯合度時轉(zhuǎn)染。成功構(gòu)建HepG2-NC對照組、HepG2-siPCBP4干擾組，Hep3B-NC對照組、Hep3B-siPCBP4干擾組細(xì)胞模型。

1.4 實(shí)時熒光定量PCR 用TRIzol提取RNA的方法得到總RNA，然后使用cDNA合成試劑盒(10071325，賽默飛，美國)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。q-PCR采用染料法，使用Luna?Universal q-PCR Master Mix試劑在美國應(yīng)用生物7500儀器上進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)參數(shù)：95℃ 1 min(預(yù)熱)，95℃ 15 s，60℃ 30 s(40個循環(huán))溶解曲線(95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s)。引物在上海生工生物技術(shù)有限公司合成。引物序列，正向：GGGCGAGACTGTAAAGCGAATCC;反向：CGGTGATGGTGGTGATGCGTTC。以β-actin為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計算基因相對表達(dá)量。

1.5 Western blot 細(xì)胞使用RIPA裂解液和PMSF的混合物充分溶解，在超聲破碎儀中破碎細(xì)胞。使用Nano 2000微量分光光度計測定細(xì)胞蛋白的濃度。細(xì)胞蛋白(40 μg)在12%的SDS-PAGE中進(jìn)行分離，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜中，在室溫下使用5%脫脂牛奶進(jìn)行封閉，4℃孵育一抗過夜，室溫孵育相應(yīng)的二抗2 h，使用化學(xué)發(fā)光試劑ECL在凝膠成像儀上進(jìn)行成像。本研究使用的抗體：PCBP4(美國，Thermo Fisher Scientific，PA5-50704)、CDK1(中國，碧云天，AF1516)、CDK2(中國，碧云天，AF1063)、cyclinB1(中國，abclonal，A16038)和β-actin(美國，Sigma，A1978)。

1.6 CCK-8實(shí)驗(yàn) 根據(jù)CCK-8檢測試劑盒的說明對細(xì)胞活力進(jìn)行檢測。將轉(zhuǎn)染好的細(xì)胞以5×103的密度接種于96孔板中，在細(xì)胞生長12、24、48、72 h后，以1∶10的比例加入CCK-8試劑混合液，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h。然后使用檢測微板閱讀器(美國BioTeK)在450 nm處的OD吸光度進(jìn)行檢測。

1.7 Edu增殖實(shí)驗(yàn) 使用Edu增殖試劑盒檢測細(xì)胞的增殖能力。細(xì)胞接種到24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞與Edu溶液孵育2 h。PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定細(xì)胞，甘氨酸溶液進(jìn)行中和，與Apollo?熒光染料反應(yīng)。最后用Hoechst33342反應(yīng)液對細(xì)胞核進(jìn)行染色。結(jié)果用熒光倒置顯微鏡(Olympus，日本)進(jìn)行觀察和采集。使用ImageJ軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.8 本研究每組實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行3次重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1PCBP4基因在HCC中表達(dá)及其預(yù)后

2.1.1PCBP4基因在HCC癌組織中的表達(dá) 非配對樣本中，PCBP4基因在癌組織中的表達(dá)水平高于癌旁組織(圖1A，t=16.906，P<0.001)；配對樣本分析結(jié)果與非配對樣本一致，癌組織中PCBP4基因的表達(dá)水平高于癌旁組織(圖1B，t=10.336，P<0.001)。

2.1.2PCBP4基因在HCC癌組織中的表達(dá)與其預(yù)后的相關(guān)性分析 如圖2所示，PCBP4基因高表達(dá)組患者相較于低表達(dá)組患者的總體生存期和無病生存期較差(P<0.05)。

2.2 干擾PCBP4基因表達(dá)的肝癌細(xì)胞模型的驗(yàn)證 在HepG2和Hep3B肝癌細(xì)胞中，干擾組(si-PCBP4)中的mRNA的表達(dá)水平低于對照組(NC)(圖3A，t=41.930,P<0.001；圖3B，t=34.130，P<0.001)，且干擾組中的蛋白表達(dá)水平仍低于對照組(圖3C，t=4.844，P<0.01；圖3D，t=4.862，P<0.01)。

***P<0.001。

*P<0.05。

**P<0.01，***P<0.001。

2.3 干擾PCBP4基因表達(dá)對肝癌細(xì)胞增殖活力的影響 與對照組相比，PCBP4基因的下調(diào)抑制了肝癌細(xì)胞的增殖活力(圖4A，24 h，t=2.815，P=0.048；48 h，t=3.726，P=0.024；72 h，t=5.815，P=0.004；圖4B，24 h，t=4.625，P=0.009；48 h，t=8.478，P=0.001；72 h，t=6.148，P=0.004)。Edu細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述實(shí)驗(yàn)一致，PCBP4基因的下調(diào)抑制了肝癌細(xì)胞的增殖(圖4C，t=5.351，P=0.006；圖4D，t=4.304，P=0.013)。

2.4PCBP4基因表達(dá)下調(diào)對肝癌細(xì)胞的細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的影響 相較于對照組，PCBP4基因表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致CDK1、CDK2和cyclinB1表達(dá)水平均下降(圖5A，CDK1：t=3.209，P=0.033，CDK2：t=16.650，P<0.001；cyclinB1：t=2.961，P=0.042；圖5B，CDK1：t=3.554，P=0.024；CDK2：t=4.827，P=0.009；cyclinB1：t=6.131，P=0.004)。

scale bar:100 μm。*P<0.05，**P<0.01。

*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

3 討論

PCBP蛋白家族成員已被證明可參與HCC的進(jìn)展過程。研究顯示，PCBP1具有結(jié)合氧化RNA的能力，因此參與細(xì)胞對氧化條件的反應(yīng)，有助于誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]；PCBP1也可通過調(diào)節(jié)CD44基因的選擇性剪接來抑制人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞的侵襲[12]。PCBP2通過與單鏈多聚(rC)基序的直接結(jié)合，在各種信號分子的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)中起重要作用[13]。PCBP2基因的過表達(dá)導(dǎo)致HCC預(yù)后不良并促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖[13-14]。由此可見，PCBP蛋白家族的不同成員在HCC的進(jìn)展過程中可能存在完全不同的作用。相較于其他成員，PCBP4在HCC中的研究鮮有報道。PCBP4也稱為MCG10和p53腫瘤抑制因子的靶標(biāo)，PCBP4的異位表達(dá)可誘導(dǎo)G2/M細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡[10,15]。研究發(fā)現(xiàn)，PCBP4基因缺陷的小鼠容易患肺腺癌、淋巴瘤和腎腫瘤[15]。而PCBP4基因的表達(dá)與HCC發(fā)生發(fā)展的機(jī)制尚不清楚。本研究通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，PCBP4基因在人HCC中明顯高表達(dá)，且高表達(dá)組患者的總體生存期和無病生存期明顯低于低表達(dá)組，提示不良預(yù)后。因此，本課題組推測PCBP4可能與HCC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其具備作為肝癌預(yù)后標(biāo)志物的潛力。

過度增殖是腫瘤細(xì)胞持續(xù)發(fā)展的典型特征。本研究結(jié)果顯示，抑制PCBP4基因的表達(dá)可有效抑制肝癌細(xì)胞的增殖活力。確認(rèn)的是，細(xì)胞增殖受到細(xì)胞周期進(jìn)程的調(diào)控。因此，細(xì)胞周期進(jìn)程的失調(diào)往往導(dǎo)致惡性腫瘤不可控的過度增殖[16]。腫瘤相關(guān)細(xì)胞周期的調(diào)控通常是由細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶(CDK)家族介導(dǎo)[17]，比如CDK1和CDK2，兩者也是重要的細(xì)胞增殖蛋白[18]。本課題組發(fā)現(xiàn)PCBP4基因表達(dá)水平的抑制可明顯下調(diào)CDK1和CDK2的表達(dá)進(jìn)而抑制細(xì)胞周期進(jìn)程，這與抑制PCBP4基因表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞增殖活力下降的結(jié)果一致。先前的一項研究表明，PCBP4基因的表達(dá)可導(dǎo)致結(jié)腸癌和肺癌細(xì)胞的G2/M期轉(zhuǎn)化停滯和細(xì)胞凋亡[19]。細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclinB1表達(dá)水平的下調(diào)可有效阻滯G2/M期的轉(zhuǎn)化，這一機(jī)制被利用于抗腫瘤藥物的研發(fā)[20-21]。在本研究中，抑制PCBP4基因的表達(dá)則促使人肝癌細(xì)胞中cyclinB1的表達(dá)下調(diào)。

總之，本研究表明PCBP4基因的過度表達(dá)與HCC的不良預(yù)后相關(guān)且促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖。當(dāng)PCBP4基因的表達(dá)受抑制后，肝癌細(xì)胞增殖活力明顯下降且cyclinB1的表達(dá)水平明顯下調(diào)，這些結(jié)果表明PCBP4可能通過調(diào)控G2/M期的轉(zhuǎn)化來影響肝癌細(xì)胞的進(jìn)展。需要注意的是，PCBP4在不同組織來源的腫瘤細(xì)胞中對G2/M期的影響有所不同，且PCBP蛋白家族的不同成員在腫瘤進(jìn)展中的作用也存在差異[15,22]。因此，PCBP4乃至PCBP蛋白家族成員在不同腫瘤疾病中的作用機(jī)制以及是否能夠作為防治靶點(diǎn)仍需進(jìn)一步探究。