賈立敏，蔡擴(kuò)軍，2＊

1 烏魯木齊市動(dòng)物疾病控制與診斷中心，新疆烏魯木齊 830063

2 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052

0 引言

奶牛乳房炎是奶牛場最常發(fā)、最難治，也是危害最大的疾病之一，不僅使產(chǎn)奶量下降，而且影響牛奶質(zhì)量，帶來了食品安全和公共衛(wèi)生安全隱患，每年給全球奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)百億美元[1]。引起奶牛乳房炎的病原菌包括金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、無乳鏈球菌、肺炎克雷伯菌等，其中大腸桿菌屬于人畜共患的條件性致病菌，不但分離率高，而且耐藥性強(qiáng)，給奶牛乳房炎的防治帶來了困難[2，3]。隨著新疆奶牛養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，奶牛養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，截至2021年現(xiàn)存奶牛數(shù)超過220萬頭，已經(jīng)成為我國重要的奶業(yè)基地之一[4]，奶牛乳房炎的防治成為必須要解決的重要問題[5]。為此，本研究采集了新疆5 個(gè)地州（市）5 個(gè)規(guī)?；膛龌加腥榉垦椎娜橐簶悠罚⒃趯?shí)驗(yàn)室開展大腸桿菌的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)，為大腸桿菌引起的奶牛乳房炎的防治及奶牛產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展提供技術(shù)支撐。

1 材料

1.1 樣品來源

分別在新疆烏魯木齊、伊犁、喀什、阿克蘇、巴州5 個(gè)地區(qū)的5 個(gè)規(guī)模化奶牛養(yǎng)殖場采集200 份患有臨床型和隱性乳房炎的奶牛乳液樣品。

1.2 主要試劑及儀器

Mueller-Hinton瓊脂（MHA）、伊紅美藍(lán)瓊脂（EMB）、EC肉湯，青島海博生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌藥敏紙片，杭州濱和微生物試劑有限公司；大腸桿菌通用型熒光PCR檢測試劑，深圳澳東檢驗(yàn)檢測科技公司；大腸桿菌顯色培養(yǎng)基，法國科瑪嘉公司，革蘭氏染液，珠海貝索生物技術(shù)公司；熒光PCR儀、顯微鏡，賽默飛世爾科技公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 樣品采集

以奶牛養(yǎng)殖場已經(jīng)篩查出來的患有隱性乳房炎和臨床型乳房炎的奶牛為采樣對象。首先用消毒液對奶牛的乳房和乳頭進(jìn)行清洗及消毒，然后棄去每個(gè)乳頭的前3 把奶，最后無菌操作將奶樣擠入采樣瓶中，做好標(biāo)記，低溫運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。

2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)

2.2.1 增菌

在生物安全柜中取25 mL奶樣放入三角瓶中，再加入225 mL EC肉湯，放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。

2.2.2 分離

將增菌后的EC肉湯用接種環(huán)在伊紅美藍(lán)瓊脂（EMB）平板上劃線，隨后放入37 ℃培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)18～24 h，觀察平板上生長的菌落形態(tài)。

2.2.3 顯色鑒定

將伊紅美藍(lán)瓊脂（EMB）平板上疑似大腸桿菌的菌落，再次在大腸桿菌顯色培養(yǎng)基上劃線，放入37 ℃培養(yǎng)箱中再次培養(yǎng)18～24 h。

2.3 革蘭氏染色鏡檢

在無菌載玻片上滴入1～2 滴滅菌水，將大腸桿菌顯色培養(yǎng)基上疑似陽性的單個(gè)菌落挑取至載玻片上混勻，火焰固定，按照革蘭氏染色液試劑盒說明書中初染、媒染、脫色、復(fù)染四個(gè)步驟進(jìn)行革蘭氏染色，最后將載玻片放入顯微鏡下鏡檢。

2.4 熒光PCR鑒定

2.4.1 DNA模板的制備

從符合大腸桿菌鏡檢特征的平板中，挑取其中的目標(biāo)菌落放入盛有EC肉湯的試管中，放入37 ℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)18～24 h。利用水煮法制備DNA。吸取菌液1～2 mL于1.5 mL EP管，10 000 r/min離心2 min，棄去上清液，加入200 μL DEPC水混勻，在水中煮沸10 min，冰浴5 min，12 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液于新的EP管中，即為DNA模板。

2.4.2 反應(yīng)組分配制

取2 μL樣品DNA和23 μL反應(yīng)體系加至反應(yīng)管，反應(yīng)總體積為25 μL，并且設(shè)置陰性和陽性對照。

2.4.3 PCR擴(kuò)增

在熒光PCR儀上設(shè)置反應(yīng)程序，預(yù)變性3 min 95 ℃、95 ℃變性5 s、65 ℃退火40 s，40 個(gè)循環(huán)。

2.5 藥敏試驗(yàn)

用麥?zhǔn)媳葷醿x將每一個(gè)菌株的濃度調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠞岫?，然后用滅菌棉簽充分蘸取菌液，緊密的涂在MHA平板上，一般不同方向涂4 次即可，再將14 種藥敏片貼在涂布好的MHA平板培養(yǎng)基上，隨后將貼好藥敏片的平板培養(yǎng)基放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18 h，然后用直尺測量抑菌圈的直經(jīng)，記錄結(jié)果，并按說明書及CLSI M100-2020第30版進(jìn)行耐藥、敏感的判定。

3 結(jié)果

3.1 培養(yǎng)分離顯色結(jié)果

大腸桿菌在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上呈現(xiàn)黑色中心有金屬光澤或無光澤的菌落，見圖1。在大腸桿菌顯色培養(yǎng)基上呈現(xiàn)藍(lán)綠色圓形凸起菌落，見圖2。

圖1 大腸桿菌在伊紅美藍(lán)瓊脂上分離培養(yǎng)結(jié)果

圖2 大腸桿菌在顯色培養(yǎng)基上顯色結(jié)果

3.2 鏡檢結(jié)果

將染色干燥后的載玻片滴入一滴香柏油后放置顯微鏡下觀察，可以觀察到紅色的革蘭氏陰性桿菌，見圖3。

圖3 大腸桿菌的鏡檢結(jié)果

3.3 熒光PCR鑒定及結(jié)果

根據(jù)大腸桿菌通用型熒光PCR檢測試劑盒說明書進(jìn)行判定，陽性樣品呈現(xiàn)“S”型擴(kuò)增曲線。結(jié)果顯示，本次一共檢測樣品200 份，其中63 份陽性，137 份陰性，陽性率31.5%，陰陽性對照成立，結(jié)果見圖4。

圖4 大腸桿菌的熒光PCR部分檢測結(jié)果

3.4 藥敏結(jié)果

14 種藥敏片周圍出現(xiàn)了不同大小的抑菌圈，根據(jù)藥敏片說明書及CLSI的折點(diǎn)，判斷耐藥、中介和敏感，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離的大腸桿菌對青霉素的耐藥率最高，對美羅培南的耐藥率最低，見圖5。耐藥性統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。

表1 大腸桿菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

圖5 大腸桿菌部分藥敏結(jié)果

4 討論

細(xì)菌的分離培養(yǎng)、革蘭氏染色鏡檢，并結(jié)合熒光PCR檢測是對細(xì)菌進(jìn)行鑒定有效、可靠的技術(shù)方法。直接從牛乳中提取核酸，然后進(jìn)行大腸桿菌的熒光PCR檢測，雖然可以節(jié)約分離培養(yǎng)的時(shí)間，但由于牛乳中不管死的細(xì)菌還是活的細(xì)菌都能提取出來細(xì)菌核酸，所以用這種辦法，大腸桿菌熒光PCR陽性并不確定牛乳中的大腸桿菌是否還有致病性，有可能已經(jīng)失去了活性。本研究先將大腸桿菌從牛乳中培養(yǎng)分離出來，進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，并開展熒光PCR檢測，這樣能保證熒光PCR陽性就是代表牛乳中存在有活性的大腸桿菌，能真實(shí)的反映奶牛乳房炎中大腸桿菌分離率和危害性。本研究奶牛乳房炎中大腸桿菌分離率為31.5%，與買爾哈巴·吾斯曼等[2]、常軍帥等[6]、劉肖利等[7]報(bào)道的分離率較為相符。

養(yǎng)殖環(huán)節(jié)獸用抗菌藥不科學(xué)、不合理使用導(dǎo)致動(dòng)物源大腸桿菌的耐藥性不斷增加，不但造成治療效果不佳，增加養(yǎng)殖成本，而且給公共衛(wèi)生安全帶來了嚴(yán)重威脅，已經(jīng)引起政府相關(guān)部門及專家學(xué)者的廣泛關(guān)注，并制定了一系列強(qiáng)有力的舉措[8]。2016年我國發(fā)布了《遏制細(xì)菌耐藥國家行動(dòng)計(jì)劃》，2017年原農(nóng)業(yè)部印發(fā)了《全國遏制動(dòng)物源細(xì)菌耐藥行動(dòng)計(jì)劃（2017—2020年），2021年4月施行了《中華人民共和國生物安全法》，將應(yīng)對微生物耐藥性提高到維護(hù)國家安全的戰(zhàn)略高度。這些重大措施充分體現(xiàn)了國家對遏制細(xì)菌耐藥性、保障人民健康的決心。本研究中，從奶牛乳房炎分離的大腸桿菌對青霉素、氨芐西林、鏈霉素、多西環(huán)素、慶大霉素、復(fù)方新諾明的耐藥率分別為93.65%、73.01%、53.96%、39.68%、31.74%、31.74%，對其他8 種抗菌藥的耐藥率均低于30%，其中對美羅培南的耐藥率最低為1.58%。同一地區(qū)分離的大腸桿菌對不同抗生素的耐藥率不同，不同地區(qū)分離的大腸桿菌對同種抗生素的耐藥性也不同，這與平時(shí)治療、預(yù)防奶牛疾病用藥直接相關(guān)，應(yīng)通過藥敏試驗(yàn)科學(xué)規(guī)范合理選用抗菌藥物，避免盲目用藥。值得注意的是，在全國“減抗、替抗”的大背景下，中草藥等產(chǎn)品已經(jīng)逐漸成為防治奶牛乳房炎，尤其是隱性乳房炎的主流。

5 小結(jié)

本研究對新疆部分地區(qū)奶牛乳房炎大腸桿菌開展了分離培養(yǎng)鑒定及藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示奶牛乳房炎中大腸桿菌廣泛流行，具有較高的耐藥性，提醒養(yǎng)殖者應(yīng)采取積極措施預(yù)防大腸桿菌性奶牛乳房炎，并科學(xué)、合理使用抗菌藥物。