譚蓮英，夏忠悅，錢(qián)成林，董成虎，宋艷梅，范光彩

1 新希望乳業(yè)股份有限公司，四川成都 610011

2 乳品營(yíng)養(yǎng)與功能四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 611730

3 夏忠悅勞模和工匠人才創(chuàng)新工作室，四川成都 611730

0 引言

在世界上已知的各種食物里，牛奶是大自然賜予人類最接近完美的食物，被譽(yù)為“白色血液”。牛奶中存在的蛋白質(zhì)主要有酪蛋白和乳清蛋白兩大類，酪蛋白主要分αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白；乳清蛋白主要分為β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、血清白蛋白和免疫球蛋白及其他微量蛋白[1]。奶牛存在不同酪蛋白遺傳變異體，根據(jù)牛奶中酪蛋白的特定氨基酸位置來(lái)確定每一種亞型，不同酪蛋白在消化過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生不同的生物活性產(chǎn)物，對(duì)人體具有不同的生理功能。本文研究了不同酪蛋白亞型的比例及其功效、基因分型鑒定方法和實(shí)際應(yīng)用，以區(qū)分不同牧場(chǎng)牛群的遺傳變異體類型和比例，指導(dǎo)牧場(chǎng)快速分群飼養(yǎng)奶牛，分別生產(chǎn)不同類型的生乳，加工高品質(zhì)乳制品。

1 牛奶中主要酪蛋白遺傳變異體基因分型及其功效

牛奶酪蛋白主要分αs酪蛋白（包含αs1-酪蛋白和αs2-酪蛋白）、β-酪蛋白、κ-酪蛋白，四者的比例約為40∶10∶35∶12，該比例會(huì)影響酪蛋白膠束的穩(wěn)定性。

αs1-酪蛋白是牛奶中最常見(jiàn)的酪蛋白形式，已被報(bào)道具有抗氧化和自由基清除作用，還與酪蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。

αs2-酪蛋白的蛋白水解片段已被證明具有抗菌活性。特別是39氨基酸殺細(xì)胞粒體-1（Casocidin-1）肽段已被證明能夠抑制大腸桿菌（E. coli）和葡萄球菌（Staph.carnosis）的生長(zhǎng)。

在牛奶凝結(jié)過(guò)程中，κ-酪蛋白被凝乳酶水解可釋放水溶性片段，副κ-酪蛋白和疏水性酪蛋白巨肽。其中的酪新素A、B和C具有阿片拮抗活性，酪新素C可結(jié)合補(bǔ)體C3a受體[1]。

1.1 牛奶中β-酪蛋白遺傳變異體基因分型及其功效

β-酪蛋白及其片段已被證明具有多種功效，已被報(bào)道能夠激活巨噬細(xì)胞的吞噬作用和過(guò)氧化物釋放。β-酪蛋白也是一種酪啡肽來(lái)源，酪啡肽可能是二肽基肽酶IV的水解產(chǎn)物，具有阿片樣活性，可結(jié)合阿片受體[2]。

β-酪蛋白在酪蛋白中含量第二，占總酪蛋白的35%。因?yàn)榫幋a這些蛋白的基因在不同的牛里面是不一樣的，所以β-酪蛋白有7 種不同的形式，最常見(jiàn)的兩種是A1β-酪蛋白和A2β-酪蛋白。只含有A2 β-酪蛋白而不含有A1β-酪蛋白的牛奶為A2牛奶。含純A2β-酪蛋白的A2牛奶可幫助改善人類攝入某些乳制品后的消化道不適癥狀。一項(xiàng)隨機(jī)、雙盲、交叉試驗(yàn)中，45 名自述有乳糖不耐受癥狀的受試者分別攝入僅含A2β-酪蛋白和含有A1、A2兩種類型β-酪蛋白的牛奶，經(jīng)過(guò)14 天治療期及14 天基線期和治療期之間的洗脫期，再通過(guò)膠囊內(nèi)鏡檢測(cè)胃腸功能、進(jìn)行精細(xì)認(rèn)知障礙測(cè)試（SCIT）等，結(jié)果顯示，與僅含A2 β-酪蛋白的牛奶相比，攝入同時(shí)含2 種類型β-酪蛋白的牛奶可以導(dǎo)致炎癥相關(guān)生化指標(biāo)和β酪啡肽水平升高、胃腸道通過(guò)時(shí)間延長(zhǎng)、短鏈脂肪酸水平降低、SCIT反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)及錯(cuò)誤率增加[3]。相反，攝入僅含A2β-酪蛋白牛奶者癥狀則未加重。通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)比較了A1β-酪蛋白和A2β-酪蛋白對(duì)腸胃產(chǎn)生的作用。與含A2β-酪蛋白的牛奶相比，給嚙齒類動(dòng)物喂飼含A1β-酪蛋白的牛奶可明顯延遲胃腸傳輸時(shí)間[4]，使消化道產(chǎn)生不適癥狀。此外，給小鼠的無(wú)奶基礎(chǔ)飲食中添加A1β-酪蛋白后，小鼠腸道炎癥標(biāo)志物明顯增多，而添加A2β-酪蛋白的基礎(chǔ)飲食對(duì)小鼠則未產(chǎn)生作用[5]。

1.2 牛奶中κ-酪蛋白遺傳變異體基因分型及其功效

κ-酪蛋白是牛乳中酪蛋白的組成之一，在牛脫脂乳中約占總酪蛋白的13%。κ-酪蛋白是使牛奶保持穩(wěn)定的乳濁液態(tài)的重要因子，不僅在酪蛋白微團(tuán)的穩(wěn)定性方面起到至關(guān)重要的作用，且對(duì)奶牛泌乳性能及乳成分組成和奶酪品質(zhì)均有一定程度的影響[6]。

與αs-酪蛋白和β-酪蛋白不同，κ-酪蛋白在N-和C-末端有兩個(gè)帶電區(qū)段，這一結(jié)構(gòu)差別決定其功能特點(diǎn)。

κ-酪蛋白具有A、B兩種不同的變異體（A型和B型），κ-酪蛋白中κ-CN A和κ-CN B的結(jié)構(gòu)差異是第148位和136位氨基酸類型不一致。κ-CN A第148位為Asp（天冬氨酸），第136位為T(mén)hr（蘇氨酸），κ-CN B第148位為Ala（丙氨酸），第136位為Ile（異亮氨酸）。

用攜帶κ-酪蛋白B型基因的奶牛產(chǎn)的牛乳比κ-酪蛋白A型生產(chǎn)的奶酪產(chǎn)量更高、凝乳更快、硬度更適中[6]。

κ-酪蛋白的水解產(chǎn)物具有抗凝血酶原肽、免疫刺激肽、酪蛋白阿片肽等物質(zhì)，均具有生理活性功能[6]。

由于不同β-酪蛋白、κ-酪蛋白遺傳變異體基因構(gòu)型牛奶有不同的生理活性，且目前的鑒定方法較復(fù)雜，有必要研究簡(jiǎn)單易行可推廣應(yīng)用的鑒定方法。

2 牛奶中不同遺傳變異體酪蛋白分型檢測(cè)鑒定方法

2.1 基因鑒定

目前常用的基因鑒定方法有：等位基因特異PCR法（AS-PCR）、創(chuàng)造酶切位點(diǎn)PCR法（ACRSPCR）、單鏈構(gòu)象多態(tài)性PCR法（SSCP-PCR）、Taq Man等方法，可通過(guò)奶牛族譜、基因DNA測(cè)序等基因檢測(cè)技術(shù)來(lái)鑒定不同酪蛋白遺傳變異體奶牛基因。

通過(guò)基因鑒定篩選區(qū)分?jǐn)y帶不同遺傳變異體基因型β-酪蛋白和κ-酪蛋白奶牛，準(zhǔn)確度能達(dá)到99%以上，適宜直接鑒定奶?；蛐?，但基因鑒定無(wú)法直接鑒定乳及其制品的蛋白質(zhì)類型。

2.2 毛細(xì)管電泳儀分離檢測(cè)

毛細(xì)管電泳儀和SDS-MW Protein Analysis kit分離檢測(cè)乳及其制品中乳清蛋白及酪蛋白類型，利用動(dòng)態(tài)涂層毛細(xì)管將乳清蛋白和不同遺傳變異體構(gòu)型的蛋白質(zhì)分離，紫外或二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)A1-β酪蛋白、A2-β酪蛋白。確定牛奶是否為某一純的β-酪蛋白或是混合型[7，8]。

2.3 高效液相色譜儀分離檢測(cè)

高效液相色譜法分離檢測(cè)乳及其制品中酪蛋白類型，利用反相高效液相色譜梯度洗脫，根據(jù)不同遺傳變異體酪蛋白保留時(shí)間和峰面積確定樣品中酪蛋白的類型和含量。

2.3.1 試驗(yàn)過(guò)程

常用設(shè)備：高效液相色譜儀（帶自動(dòng)進(jìn)樣器，UV或二極管陣列檢測(cè)器）、離心機(jī)（離心力大于1 0000 r/min）、色譜柱（型號(hào)：ZORBAX 300ABond 300SBC8；規(guī)格：250 mm×4.6 mm，3.5 μm）、渦旋儀等。

主要試劑：TFA、鹽酸胍、雙（2-羥乙基）氨基-三（羥甲基）甲烷和、磷酸氫二鈉、β-巰基乙醇、乙腈。

檢測(cè)條件：波長(zhǎng)：214 nm；流動(dòng)相A：0.1% TFA水溶液；流動(dòng)相B：0.1% TFA乙腈溶液；進(jìn)樣量：50 μL；色譜柱溫度：40 ℃。

表1 梯度洗脫程序

生乳或乳制品樣品預(yù)冷至2～4 ℃，再經(jīng)10 000 r/min離心力冷凍離心大于10 min，棄去上面脂肪層；取中間清液1 mL于10 mL離心管中，加入5 mL緩沖溶液（5 mol/L鹽酸胍、0.08 mol/L雙（2-羥乙基）氨基-三（羥甲基）甲烷、5 mmol/L磷酸氫二鈉的混合水溶液），混勻，室溫下靜置反應(yīng)2 h；將樣品渦旋混勻，在 1 2000 r/min離心力作用下離心10 min；取下層液體1 mL，加入990μL 5 mol/L鹽酸胍水溶液，10 μL 10%β-巰基乙醇水溶液，混勻，離心，將離心后液體用0.22 μm水系微孔濾膜過(guò)濾于樣品瓶中，待測(cè)樣品用于高效液相色譜儀檢測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)品用相同的方式處理后上機(jī)測(cè)定（圖1）。

圖1 高效液相色譜儀分離A1、A2β-酪蛋白圖譜

2.3.2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

標(biāo)準(zhǔn)品在0.2～3 mg/mL濃度范圍內(nèi)，A2-β-酪蛋白濃度與峰面積呈正相關(guān)，線性回歸方程為y=4.14e-5x-0.00024，其中y為A2-β-酪蛋白濃度，x為峰面積；線性相關(guān)系數(shù)為r=0.9956，符合GB/T 27417—2017中對(duì)于準(zhǔn)確定量方法，線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)不低于0.99的要求[9]。

選取不同生乳、滅菌乳、巴氏殺菌乳樣品前處理后，平行測(cè)定6 次，得到生乳相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.81%～2.40%，巴氏殺菌乳相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.78%～1.33%，滅菌乳相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.19%～1.09%（表2），符合GB/T 27417—2017中當(dāng)被測(cè)組分含量在1%時(shí)，試驗(yàn)室內(nèi)變異系數(shù)小于2.7%的要求[9]。

表2 方法精密度試驗(yàn)結(jié)果

分別選取生乳、巴氏殺菌乳和滅菌乳基質(zhì)添加不同濃度的A2-β-酪蛋白進(jìn)行三水平六平行加標(biāo)回收試驗(yàn)。生乳分別添加2.60 mg/mL、5.44 mg/mL、10.80 mg/mL，每個(gè)濃度分別測(cè)定6 次，得到回收率范圍為92.5%～105.2%；滅菌乳分別添加2.40 mg/mL、4.80 mg/mL、9.60 mg/mL三個(gè)濃度水平，分別測(cè)定6 次，得到回收率范圍為94.2%～104.0%；巴氏殺菌乳分別添加2.40 mg/mL、4.80 mg/mL、9.60 mg/mL，每個(gè)濃度分別測(cè)定6 次，得到回收率范圍為94.6%～102.8%（表3）。

表3 不同基質(zhì)加標(biāo)回收率

采用高效液相色譜法分離檢測(cè)100 份不同牧場(chǎng)單個(gè)牛體生乳樣本，通過(guò)試驗(yàn)分離發(fā)現(xiàn)不同牛體所含有的酪蛋白類型不同，其中部分牛體只含有單一的κ-酪蛋白、β-酪蛋白，混合型牛體占比較高，其中混合型κ-酪蛋白（同時(shí)含κ-CN A和κ-CN B）占比為50%～60%，混合型β-酪蛋白（同時(shí)含β-CN A1和β-CN A2）占比為60%～70%（圖2）。

圖2 不同牛乳樣本中酪蛋白類型占比

3 結(jié)論

不同β-酪蛋白、κ-酪蛋白變異體基因構(gòu)型牛奶有不同的生理活性功能，有必要對(duì)其進(jìn)行分型鑒定。

β-酪蛋白、κ-酪蛋白遺傳變異體基因亞型牛奶的鑒定方法多樣，本文對(duì)比了不同的鑒定方法，重點(diǎn)通過(guò)試驗(yàn)對(duì)高效液相色譜分離鑒定方法進(jìn)行驗(yàn)證，方法精密度和回收率均滿足要求，且能有效分離不同κ-酪蛋白和β-酪蛋白。通過(guò)對(duì)牧場(chǎng)不同牛乳樣本進(jìn)行分型鑒定發(fā)現(xiàn)，同時(shí)具有κ-酪蛋白A型和B型基因型的牛乳占比在50%以上，單一κ-酪蛋白A型牛乳、κ-酪蛋白B型牛乳占比分別在30%～40%、10%～15%。其中A2β-酪蛋白牛奶占比為25%～35%。研究發(fā)現(xiàn)高效液相色譜分離鑒定方法既可用于奶牛的分型鑒定，又可用于生牛乳及其生產(chǎn)的乳制品的酪蛋白類型鑒定，可以幫助生產(chǎn)企業(yè)開(kāi)發(fā)不同類型的乳制品。