李佳寅，潘海華，姚 琪

(嘉興市第一醫(yī)院心血管內(nèi)科·浙江 嘉興 314001)

冠狀動(dòng)脈急性閉塞引起心肌梗死通常具有高死亡率的特點(diǎn)，而急性心梗緊急開通又會(huì)致使心肌細(xì)胞進(jìn)一步損傷，該過程稱為缺血再灌注損傷[1]。臨床上一直探索使用多種治療方法及手段，但是對(duì)于缺血再灌注損傷的依然未能得到有效解決。目前相關(guān)研究報(bào)道在多種疾病引起的細(xì)胞死亡和損傷過程中都伴隨DNA損傷，DNA損傷在缺血再灌注過程中表現(xiàn)較為明顯[2-3]。DNA輕度損傷會(huì)引起多聚ADP核糖聚合酶-1(PARP-1)進(jìn)行修復(fù)；DNA較重度損傷會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，DNA大量嚴(yán)重?fù)p傷會(huì)誘發(fā)特有的細(xì)胞死亡即PARP-1依賴性細(xì)胞死亡(Parthanatos)。中藥葛根為野葛[Pueraria lobata(wild) Ohwi]的干燥根，味甘、辛，性涼，具有生津止渴、升陽的功效，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)葛根具有降壓、舒張血管、抗缺血等作用，因此用于心血管疾病的治療[4]。葛根素作為其主要的生物活性成分，能減少心肌細(xì)胞凋亡，抗氧化應(yīng)激，改善內(nèi)皮細(xì)胞功能[5]。本研究重點(diǎn)探索了葛根素對(duì)于心肌缺氧復(fù)氧損傷的保護(hù)作用及其與miR-195表達(dá)及與PARP-1依賴性細(xì)胞死亡(Parthanatos)的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 葛根素注射液：山東方明藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司。大鼠心肌細(xì)胞H9C2：上海中喬新舟生物科技。低糖DMEM培養(yǎng)基：美國 Hyclone 公司；CCK8試劑盒：美國Abmole公司；LDH試劑盒：Roche公司；Lipofectamine?RNAiMAX和Lipo3000：ThermoFisher公司；miR-195 siRNA：蘇州GenePharma公司。三氣培養(yǎng)箱：美國Thermo公司；酶標(biāo)儀：美國 Thermo公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 10%FBS+DMEM低糖培養(yǎng)基用于培養(yǎng)H9C2心肌細(xì)胞，培養(yǎng)箱設(shè)定為37℃、含5%CO2。將對(duì)數(shù)期生長期H9C2細(xì)胞消化傳代于培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為4組，分別為：①正常對(duì)照組(Control)：正常培養(yǎng)，不添加任何藥物；②缺氧復(fù)氧組(Hypoxia Reoxygenation,HR)：將細(xì)胞置于37℃、含95%氮?dú)馀c5%CO2的三氣培養(yǎng)箱中3 h，然后再于正常培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 h，形成缺氧/復(fù)氧模型； ③轉(zhuǎn)染組(Transfection group，TG)：將sh-miR-195基因序列克隆至pLKO載體中，構(gòu)建穩(wěn)定的miR-195基因敲除H9C2細(xì)胞株，sh-miR-195的引物見表1。轉(zhuǎn)染成功24 h后構(gòu)建缺氧復(fù)氧(H/R)模型。④葛根素組(Puerarin Group，PG)：于細(xì)胞缺氧復(fù)氧(H/R)前1 h添加葛根素，濃度為50 μmol/L。

表1 miR-195、PARP-1、AIF、GAPDH引物序列

1.3 細(xì)胞活力與LDH含量測(cè)定 將各組H9C2心肌細(xì)胞分別接種于4塊96孔板中，細(xì)胞密度調(diào)整為8 000/孔。予以不同處理后，分別按照說明書的操作步驟使用LDH試劑盒與CCK8試劑盒，分別檢測(cè)細(xì)胞上清液中LDH的含量及細(xì)胞活力，通過酶標(biāo)儀讀取相應(yīng)的數(shù)值。

1.4 QPCR檢測(cè)miR-195與Parthanatos相關(guān)基因的表達(dá)水平 細(xì)胞分組處理后搜集細(xì)胞，按照Trizol試劑盒的操作說明提取RNA,使用逆轉(zhuǎn)錄盒逆轉(zhuǎn)錄成CDNA，以此為模板行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件設(shè)定：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火 2 min，共40個(gè)循環(huán)。GAPDH作為內(nèi)參，使用2△△Ct法計(jì)算miR-195、PARP-1mRNA 和凋亡誘導(dǎo)因子(apop-tosis Inducing Factor，AIF) mRNA的變化量,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 各組H9C2心肌細(xì)胞活力和LDH含量比較 與正常組相比，缺氧復(fù)氧組H9C2心肌細(xì)胞活力明顯降低(P<0.05)，LDH含量明顯提升(P<0.05)；葛根素預(yù)處理組、轉(zhuǎn)染組H9C2心肌細(xì)胞的細(xì)胞活力明顯提升(均P<0.05)，LDH的含量明顯下降(均P<0.05)。見表2。

表2 各組H9C2心肌細(xì)胞活力與LDH含量比較

2.2 各組H9C2心肌細(xì)胞miR-195、PARP-1mRNA和AIF mRNA表達(dá)比較 與正常對(duì)照組相比，缺氧復(fù)氧組與葛根素組miR-195的表達(dá)水平均升高(均P<0.05)，轉(zhuǎn)染組miR-195的表達(dá)水平無改變(P>0.05)；與缺氧復(fù)氧組相比，轉(zhuǎn)染組與葛根素組miR-195、PARP-1 mRNA、AIF mRNA的表達(dá)水平均明顯降低(均P<0.05)，與轉(zhuǎn)染組相比，葛根素組miR-195、PARP-1 mRNA、AIF mRNA的表達(dá)均升高(均P<0.05)。見表3。

表3 各組H9C2心肌細(xì)胞miR-195、PARP-1mRNA和AIF mRNA表達(dá)的比較

3 討論

葛根素為從中藥葛根中提取的異黃酮類化合物，有“植物雌激素”的美譽(yù)，具有抗炎、抗氧化及擴(kuò)張血管等作用[6-7],在糖尿病、心血管疾病及帕金森病治療上具有較好的療效[8]。有研究證明葛根素對(duì)氯仿誘導(dǎo)的小鼠心房纖維性顫動(dòng)具有保護(hù)作用[9]，對(duì)烏頭堿誘導(dǎo)的大鼠及哇巴因誘導(dǎo)的豚鼠室性心動(dòng)過速、心室顫動(dòng)、室性期前收縮方面均有保護(hù)作用[10]，說明葛根素對(duì)于心律失常具有治療作用。此外，葛根素還具有抑制心肌細(xì)胞鈣離子內(nèi)流的作用，從而對(duì)心肌細(xì)胞發(fā)揮相關(guān)保護(hù)作用[11]。本研究重點(diǎn)探索了葛根素對(duì)于心肌細(xì)胞H/R損傷的保護(hù)作用及其與miR表達(dá)的相關(guān)性。

MicroRNAs屬于小分子單鏈RNA,缺乏蛋白質(zhì)編碼的作用，進(jìn)化學(xué)方面較為保守，一般由17～25個(gè)堿基組成，通過堿基配對(duì)互補(bǔ)的方式與靶基因mRNA的3’區(qū)結(jié)合并誘導(dǎo)目標(biāo)基因的降解切割或抑制后續(xù)的翻譯，通過此機(jī)制來影響靶基因的表達(dá)，主要表現(xiàn)于轉(zhuǎn)錄后水平影響蛋白質(zhì)編碼[12]。miRNA與心肌凋亡、心肌重構(gòu)、心力衰竭、心肌肥厚、心肌梗死均緊密相關(guān)[13]。miRNA-195最早于肥厚心肌中被確定發(fā)現(xiàn)，在心力衰竭及心肌肥厚小鼠的心肌細(xì)胞中均出現(xiàn)顯著上升[14]，此外，相關(guān)研究證實(shí)循環(huán)血中的miR-195-3p是一種潛在的心力衰竭標(biāo)記物[15],Xie等[16]將Pre-miR-195注入轉(zhuǎn)基因鼠中可誘導(dǎo)心肌肥厚最終導(dǎo)致心力衰竭，而miR-195沉默可以減輕糖尿病心肌病中的心肌肥厚與冠狀動(dòng)脈內(nèi)膜損傷[17],以上研究揭示了miR-195在心肌肥厚方面的相關(guān)作用，但其在缺血再灌注過程中的相關(guān)作用及相關(guān)機(jī)制尚無報(bào)道。

本研究構(gòu)建miR-195基因沉默的H9C2心肌細(xì)胞模型及葛根素預(yù)處理的缺氧復(fù)氧H9C2心肌細(xì)胞，證實(shí)葛根素及miR-195沉默可以保護(hù)心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷。缺氧復(fù)氧組miR-195的表達(dá)明顯增高，葛根素預(yù)處理可有效抑制miR-195表達(dá)，同時(shí)抑制AIF與PARP-1的表達(dá)。綜合上述，H9C2心肌細(xì)胞 H/R損傷過程中主要發(fā)生了Parthanatos死亡，而葛根素可能通過抑制miR-195的表達(dá)降低Parthanatos死亡。