秦劭晨，王愛梅，萬曉波

(1山西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院·山西 太原 030024；2太原市中醫(yī)醫(yī)院·山西 太原 030009)

腦梗死在臨床上有較高的致死率、致殘率。腦梗死發(fā)生后盡早建立側支循環(huán)，促進血管新生，增加腦血流灌注，可有效減輕神經功能缺損，改善預后。血管內皮細胞對維持血管正常功能、血管新生有著至關重要作用，而血管內皮細胞增殖是血管新生發(fā)生的關鍵環(huán)節(jié)[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，血管內皮生長因子(VEGF)能調節(jié)內皮細胞的連接完整性，VEGF與其受體VEGFR結合，激活下游效應分子誘發(fā)侵襲性運動行為，促進血管新生[2]。堿性成纖維生長因子(bFGF)是一種強效血管擴張劑，能特異性擴張梗死灶周圍血管，增加局部供血加速成纖維細胞增殖，最終促進血管內皮細胞存活和增殖[3]。

中藥黃芪性甘溫,歸脾、肺兩經，具有有補氣固表、托毒排膿、利尿生肌功效，其主要成分黃芪多糖具有提高免疫力、抗炎、抗氧化、抗衰老等作用[4]，但是其在神經系統(tǒng)中的具體作用機制尚未明確。本研究通過觀察黃芪多糖對LPS誘導HUVECs細胞損傷的保護作用并通過檢測對白細胞介素6(IL-6)、白細胞介素1β(IL-1β)、VEGF和bFGF的影響探討其作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗藥物、細胞、試劑 黃芪多糖(Astragalus polysaccharide，APS)：上海吉至生化科技有限公司。地塞米松(DEX)：上海吉至生化科技有限公司。人血管內皮細胞(human vascular endothelial cells，HUVECs)細胞：武漢大學細胞庫。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清：美國Gibco公司；脂多糖(LPS)：美國CST公司；Annexin V-FITC/PI apoptosis kit：中國聯(lián)科生物公司；一氧化氮(NO)、乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒：南京建成生物工程研究公司。TRIZOL：碧云天生物公司；引物：英濰捷基生物工程有限公司設計合成；PrimeScriptTM RT reagent kit、TB Green?Premix Ex TaqTMII：Takara生物公司；IL-6、IL-1β、VEGF、bFGF ELISA試劑盒：美國Signalway Antibody公司。

1.2 實驗儀器 New Classic ME精密分析天平：瑞士梅特勒-托利多公司；細胞培養(yǎng)箱：美國Eppendorf公司；ABI PrismTM 7500熒光定量PCR儀：美國Thermo life公司；TGL-16E高速冷凍離心機：中國博科公司；ProFlex PCR擴增儀、Varioskan LUX多功能酶標儀：美國Thermo Fisher公司；倒置顯微鏡：日本奧林巴斯公司；Attune CytPix成像型流式細胞儀：美國Thermo Fisher公司。

2 方法

2.1 實驗分組及給藥 HUVECs用含10%FBS DMEM培養(yǎng)基于5%CO237 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的HUVECs細胞，分為正常組(NC)，模型組(LPS 1 mg/L)，給藥組加入各濃度的APS，陽性藥對照組加入地塞米松(DEX，3.92 mg/L)。

2.2 CCK8檢測HUVECs增殖活力 HUVECs以5 000個/孔種于96孔板中，12 h后去除上清加入終濃度為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0 mg/L的APS培養(yǎng)24 h加入CCK8孵育30 min，450 nm波長酶標儀檢測各孔光密度(OD)值。全部實驗重復至少3次，取平均值。

2.3 分光光度法檢測細胞上清液NO含量和LDH、SOD活性 將HUVECs細胞按照2×105個/孔密度種于6孔板中，在條件為37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，正常組加入基礎培養(yǎng)基，除正常組外，各組均加入LPS(1 mg/L)刺激24 h，APS組加入APS(8 mg/L)作用24 h，陽性藥對照組加入DEX(3.92 mg/L)作用24 h，收集細胞上清液，根據試劑盒說明書操作。全部實驗重復至少3次，取平均值。

2.4 RT-PCR檢測細胞上清液IL-6、IL-1β、VEGF和bFGF mRNA表達 取2.3 培養(yǎng)各組HUVECs，根據試劑盒說明書提取RNA。逆轉錄cDNA根據TAKARA逆轉錄試劑盒說明書操作。Gene Bank數(shù)據庫中檢索引物,交由英濰捷基生物工程有限公司設計合成。引物序列見表1。PCR擴增按照試劑盒說明書操作。計算結果用GAPDH標準化目的基因的相對表達，通過 2-ΔΔCt定量目的基因。

2.5 ELISA檢測細胞上清液IL-6、IL-1β、VEGF和bFGF的水平 將HUVECs細胞按照5×104個/孔密度種于12孔板中，在條件為37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，細胞造模給藥方法參照2.1，收集細胞，加入PBS超聲裂解，通過4 ℃ 3 500 r/min離心10 min，收集細胞上清液，根據試劑盒說明書操作細胞上清液IL-6、IL-1β、VEGF和bFGF的水平。

2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡 將HUVECs細胞按照1×105個/孔密度種于6孔板中，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，各組細胞按2.3給藥培養(yǎng)。給藥結束后收集細胞，HUVECs用預冷PBS離心洗滌，收集10×105個細胞，用PBS稀釋 5×Binding Buffer至1×工作液，取1×Binding Buffer 500μL重懸細胞，每管加入5μL Annexin V-FITC 和10μL PI，輕柔混勻后室溫避光孵育5 min后，流式細胞儀檢測凋亡率。

表1 PCR引物序列

3 結果

3.1 APS對HUVECs細胞增殖活力的影響 不同濃度的APS作用于HUVECs細胞，從2.0 mg/L濃度開始對HUVECs細胞有不同的促增殖作用，增殖率呈現(xiàn)出劑量依賴關系，其中8.0 mg/L的APS對HUVECs細胞增殖作用最明顯(P<0.01)。結果見表1。

表2 不同濃度APS處理后HUVECs細胞活力比較

3.2 APS對LPS誘導HUVECs損傷模型細胞活力的影響 與正常組比較，LPS(1 mg/L)單獨作用HUVECs細胞時可抑制APS活力，LPS(1 mg/L)聯(lián)合各濃度的APS作用于HUVECs細胞后，APS濃度在4～32 mg/L對HUVECs細胞具有明顯促進增殖作用(P<0.05)，其中8.0 mg/L的APS對HUVECs細胞增殖作用影響明顯；因此，后續(xù)采用8 mg/L的APS作為給藥濃度。結果見表3。

表3 不同濃度APS對LPS誘導HUVECs細胞活力的影響

3.3 APS對LPS誘導HUVECs模型氧化應激指標的影響 結果見表4。

表4 各組HUVECs細胞培養(yǎng)上清液NO含量和LDH、SOD活性比較

3.4 APS對LPS誘導HUVECs模型IL-6、IL-1β、VEGF、bFGF mRNA表達的影響 結果見表5。

表5 各組HUVECs IL-6、IL-1β、VEGF、bFGF mRNA表達的比較

3.5 APS對LPS誘導HUVECs模型IL-6、IL-1β、VEGF、bFGF 含量的影響 結果見表6。

表6 各組HUVECs培養(yǎng)上清液IL-6、IL-1β、VEGF、bFGF含量比較

3.6 APS對LPS誘導HUVECs凋亡的影響 結果見表7。

表7 各組HUVECs凋亡率的比較

4 討論

腦梗死又稱為缺血性卒中，中醫(yī)又名卒中或中風，是由于局部腦組織血液供應障礙，致腦組織缺血缺氧性壞死[5]。腦組織局部缺血，腦血管循環(huán)障礙，引起炎癥反應，最終導致血管內皮受損[7]。本研究采用LPS誘導血管內皮細胞損傷的的體外模型，探討黃芪多糖對血管內皮細胞的抗炎及促進新生血管生成的機制。

IL-6、IL-1β的產生可以反映炎癥程度，也可加劇炎癥反應[7-8]。有研究表明，腦卒中的病人血清及實驗動物的血管內皮細胞中IL-6、IL-1β明顯上調[9]。本研究結果提示LPS刺激使血管內皮細胞IL-6、IL-1β明顯上調，而經黃芪多糖作用后IL-6、IL-1β明顯下調。

體內氧化應激是指氧化與抗氧化作用失衡，最后會導致中性粒細胞炎性浸潤，蛋白酶分泌增加，產生大量氧化中間產物，導致炎癥反應的加劇[10]。在炎癥環(huán)境下，NO、LDH可持續(xù)上升，形成細胞毒性，直至底物耗竭或細胞死亡[11]。SOD作為一種抗氧化酶在動物體內普遍存在，可以清除細胞生命活動中產生的超氧陰離子，修復氧化引起的損傷，對細胞起保護作用[12]。本研究表明，在LPS誘導的體外血管內皮細損傷模型中，氧化應激指標NO、LDH表達明顯上調，SOD表達則明顯下調。APS組氧化應激指標NO、LDH出現(xiàn)一定程度下調，SOD表達則呈現(xiàn)上調趨勢。提示黃芪多糖可能通過調節(jié)氧化應激指標NO、LDH、SOD表達而起到減輕細胞氧化作用。

血管內皮生長因子VEGF家族包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和胎盤生長因子(PGF)[3]。在內皮細胞表面VEGF與其受體VEGFR結合后啟動信號轉導，激活下游信號分子參與內皮細胞增殖、生存，而內皮細胞的生長、遷移在血管新生、血管脈絡形成中起著關鍵的作用，對組織修復具有重要作用[13]。bFGF與細胞膜上的成纖維細胞生長因子受體(FGFRs)結合后具有生物學效應。作為一種氨酸激酶受體，F(xiàn)GFRs的亞基包括FGFRl、FGFR2、FGFR3和FGFR4[14-15]。在中樞神經系統(tǒng)病變中，bFGF可激活其亞基，起到促進神經細胞增殖和保護血腦屏障等作用[16]。在本研究中，LPS誘導的體外血管內皮細胞損傷模型，LPS組中VEGF、bFGF表達明顯下調，APS組VEGF、bFGF表達則呈現(xiàn)上調趨勢。

流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)LPS組細胞凋亡率明顯上調，APS組細胞凋亡率明顯回落。提示APS可能通過調節(jié)VEGF、bFGF而達到促進血管內皮新生、修復神經功能的作用。

綜上所述，APS可減少LPS誘導HUVECs炎癥因子的過度分泌，同時在一定程度上調節(jié)氧化應激反應，抑制細胞凋亡；APS通過抑制炎癥反應、促進血管新生，從而達到修復神經損傷的作用，但其具體作用機制還需進一步深入研究。