鞏 娟，張 棟

(1.漢中市人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，陜西 漢中 723000；2.漢中市中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科，陜西 漢中 723000)

重癥肺炎是進(jìn)入重癥監(jiān)護(hù)病房的主要原因，并導(dǎo)致極高的病死率[1]。世界衛(wèi)生組織按照臨床表現(xiàn)將肺炎嚴(yán)重程度分為肺炎和重癥肺炎，重癥肺炎病死率可達(dá)17%～55%。肺炎主要癥狀表現(xiàn)為咳嗽、發(fā)燒、胸痛、呼吸急促，甚至呼吸衰竭[2]。目前藥物治療是肺炎治療的主要策略，雖然目前已有部分新藥應(yīng)用于臨床，但由于存在各種副作用，如急性肺損傷、支氣管炎，尚未發(fā)現(xiàn)有效肺炎治療藥物。

長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)是重要的細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)分子，在各種生理過程中具有功能活性[3]。lncRNA 小核仁RNA宿主基因16(Small nucleolar RNA host gene 16，SNHG16)是高度保守的基因簇，與細(xì)胞損傷相關(guān)[4]。研究表明在脂多糖誘導(dǎo)的肺炎細(xì)胞中，lncRNA SNHG16顯著上調(diào)，并抑制細(xì)胞活力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和炎癥損傷[5]。lncRNA作為一種競爭性內(nèi)源RNA，通過與微小RNA(microRNA，miRNA)海綿吸附參與調(diào)節(jié)其他RNA轉(zhuǎn)錄過程。Liu等[6]提出，小鼠腹腔注射脂多糖后與微小RNA-147a(miR-147a)表達(dá)顯著降低，促進(jìn)小鼠肺部炎癥。本研究旨在探討重癥肺炎患者血清中l(wèi)ncRNA SNHG16和miR-147a表達(dá)水平對肺炎預(yù)后及診斷的意義，為預(yù)測肺炎進(jìn)展和預(yù)后提供新的生物標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年1月到2022年1月在我院接受治療的肺炎患者108例，按照肺炎嚴(yán)重程度，將患者分為重癥肺炎組和輕癥肺炎組，并選取同期健康體檢的人群作為對照組。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《實用內(nèi)科學(xué)》對重、輕癥肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)；入院前1周內(nèi)未接受過藥物治療的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：在入院之前接受過抗菌類藥物或糖皮質(zhì)激素的患者；合并存在其他感染性疾病患者；合并其他器官惡性腫瘤患者。本研究入選患者重癥肺炎組59例，男35例，女24例，平均年齡(47.49±6.50)歲，平均病程(7.15±1.27)d。普通肺炎組49例，男28例，女21例，平均年齡(45.21±6.67)歲，平均病程(7.24±1.12)d。對照組68例，男36例，女32例，平均年齡(46.56±7.27)歲。三組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，具有可比性。本研究符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)要求。

1.2 檢測方法

1.2.1 血清中l(wèi)ncRNA SNHG16和miR-147a表達(dá)水平檢測：所有研究對象空腹抽取靜脈血5 ml，利用離心機(jī)以3000 r/min進(jìn)行離心10 min，分離血清，置于-80 ℃保存待用。利用RNA提取試劑盒(Invitrogen)提取總RNA，再按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen)操作說明制備cDNA，以U6為內(nèi)參，RT-PCR分析lncRNA SNHG16和miR-147a表達(dá)水平，引物序列分別為，lncRNA SNHG16正向引物為5’-CCCAAGCT-GGTTC TTTT CGAGGTCGGC-3’和反向引物為5’-CCGGAATTCTGACGGTAGTTTCCCAAGTTTAT-TGTAAGT-3’。 miR-147a正向引物為5’-GCGGGC-GTGTGTGAAATGC-3’;反向引物為5’- ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3’。U6正向引物為5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’，反向引物為5’-CTCG-CTTCGGCAGCACA-3’。

1.2.2 臨床指標(biāo)觀察：根據(jù)醫(yī)院患者數(shù)據(jù)系統(tǒng)，收集重癥肺炎患者年齡、性別、病程，并檢測呼吸、心率、氧合指數(shù)、并發(fā)癥及入院時急性生理和慢性健康狀況評分Ⅱ(Acute Physiological and Chronic Health Evaluation，APACHE Ⅱ)，臨床肺部感染評分量表(Clinical Pulmonary Infection Score，CPIS)，并對重癥肺炎患者進(jìn)行隨訪并記錄28 d內(nèi)存活情況，根據(jù)患者生存狀態(tài)，將患者分為死亡組和存活組。

2 結(jié) 果

2.1 血清lncRNA SNHG16和miR-147a表達(dá)水平 RT-PCR分析研究對象血清中l(wèi)ncRNA SNHG16和miR-147a表達(dá)水平。重癥肺炎組lncRNA SNGH16平均表達(dá)水平為(2.17±0.63)，顯著高于普通肺炎組和對照組(均P<0.05)。重癥肺炎組miR-147a平均表達(dá)水平為(0.21±0.01)，顯著低于普通肺炎組和對照組(均P<0.05)。見表1。

表1 三組血清lncRNA SNHG16和miR-147a表達(dá)水平比較

2.2 影響重癥肺炎患者預(yù)后單因素分析 59例重癥肺炎患者中死亡組入院時APACHE Ⅱ評分、CPIS評分顯著高于存活組(均P<0.05)，血清lncRNA SNHG16表達(dá)水平顯著高于存活組(P<0.05)，miR-147a表達(dá)水平顯著低于存活組(P<0.05)。性別、年齡、病程、呼吸、心率和氧合指數(shù)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表2。

表2 影響重癥肺炎患者預(yù)后單因素分析

2.3 影響重癥肺炎患者預(yù)后多因素Logistic回歸分析 APACHE Ⅱ評分>20分賦值為1，≤20分賦值為0；CPIS評分>6分賦值為1，≤6分賦值為0；lncRNA SNHG16相對表達(dá)量>1.8賦值為1，≤1.8賦值為0；miR-147a相對表達(dá)量<0.5賦值為1，≥0.5賦值為0。Logistic回歸分析結(jié)果表明，APACHE Ⅱ評分、CPIS評分、血清lncRNA SNHG16和miR-147a表達(dá)水平是影響重癥肺炎患者預(yù)后獨立危險因素(均P<0.05)。見表3。

表3 影響重癥肺炎患者預(yù)后多因素Logistic回歸分析

2.4 血清中l(wèi)ncRNA SNHG16和miR-147a表達(dá)水平對重癥肺炎診斷價值分析 ROC曲線分析血清lncRNA SNHG16和miR-147a表達(dá)水平對重癥肺炎診斷價值，經(jīng)院內(nèi)兩位有經(jīng)驗副主任醫(yī)師依照《實用內(nèi)科學(xué)》重癥肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷為重癥肺炎者賦值為1，非重癥肺炎者賦值為0，結(jié)果表明，血清中l(wèi)ncRNA SNHG16單獨診斷AUC為0.781，靈敏度為84.35%，特異度為83.11%；miR-147a單獨診斷AUC為0.706，靈敏度為74.82，特異度為78.46%。二者聯(lián)合診斷AUC為0.846，靈敏度為86.53%，特異度為84.64%。上述結(jié)果表明，血清lncRNA SNHG16和miR-147a表達(dá)水平可用于臨床重癥肺炎診斷。見表4。

表4 血清lncRNA SNHG16和miR-147a單獨檢測和聯(lián)合檢測重癥肺炎ROC曲線下面積

3 討 論

重癥肺炎是患者進(jìn)入重癥監(jiān)護(hù)室主要原因之一，重癥肺炎的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，常伴有免疫底下和炎性因子表達(dá)失衡，嚴(yán)重?fù)p害肺組織功能[7]。重癥肺炎表現(xiàn)常表現(xiàn)為心率增快、呼吸增快、呼吸困難、煩躁不安和肝臟增大，可能威脅患者生存狀態(tài)[8]，而且重癥肺炎患者免疫功能普遍會明顯降低，常用免疫制劑治療抑制病情[9]。對于重癥肺炎診斷和治療需要更靈敏的生物標(biāo)志物，提高診斷精確性，為臨床治療提供參考。 lncRNA和miRNA是近年來最重要的核苷酸。越來越多研究表明，lncRNA和miRNA在不同階段和細(xì)胞生長水平調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。lncRNA可以直接與DNA、RNA、蛋白質(zhì)相互作用，并發(fā)揮多種調(diào)節(jié)功能。重癥肺炎會削弱免疫系統(tǒng)，最終導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)損傷、多器官衰竭，甚至感染[10]。另外，測序技術(shù)分析確定輕度肺炎患者中有99個異常表達(dá)的lncRNA，重癥肺炎患者中有85個異常表達(dá)的lncRNA[11]。研究表明，在小鼠腹腔注射脂多糖可誘導(dǎo)肺部炎癥，通過高通量測序分析差異表達(dá)lncRNA，其中l(wèi)ncRNA SNHG16是差異表達(dá)lncRNA之一[12]。體外肺炎模型研究中發(fā)現(xiàn)過度表達(dá)的SNHG16可抑制脂多糖誘導(dǎo)的肺損傷細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)細(xì)胞活性和炎癥[13]。SNHG16在肺纖維化細(xì)胞中表達(dá)顯著上調(diào)，敲除SNHG16可減弱纖維生成，通過miR-455-3p通路調(diào)控促進(jìn)纖維生成[14]。研究表明敲除lncRNA SNHG16可降低慢性縮窄性損傷大鼠炎性細(xì)胞因子濃度和mRNA表達(dá)[15]。上述研究結(jié)果表明，lncRNA SNHG16表達(dá)上調(diào)可誘導(dǎo)體內(nèi)及體外細(xì)胞炎性因子表達(dá)上調(diào)，敲除該基因可降低炎性因子表達(dá)，這可能與調(diào)控肺炎進(jìn)展相關(guān)。miR-147a參與細(xì)胞炎性抑制，研究發(fā)現(xiàn) miR-147a在炎性疾病中表達(dá)顯著下調(diào)。miR-147a介導(dǎo)三七皂苷在動脈粥樣硬化中的炎癥反應(yīng)，過表達(dá)miR-147a可降低內(nèi)皮細(xì)胞炎性因子表達(dá)[16]。另外，miR-147a在多種癌癥細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，包括肺癌、結(jié)直腸癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤和黑色素瘤，在癌癥惡性進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[17]。上述研究成果表明，lncRNA SNHG16和miR-147a在炎性誘導(dǎo)的疾病進(jìn)展中可能發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。

本研究結(jié)果表明lncRNA SNHG16臨床重癥肺炎患者血清中表達(dá)顯著高于普通肺炎和對照組，重癥肺炎組miR-147a平均表達(dá)水平為(0.21±0.01)，顯著低于普通肺炎組和對照組(均P<0.05)。APACHEⅡ評分、CPIS評分、血清lncRNA SNHG16和miR-147a表達(dá)水平是影響重癥肺炎患者預(yù)后獨立危險因素(均P<0.05)。血清中l(wèi)ncRNA SNHG16和miR-147a聯(lián)合診斷AUC為0.846，靈敏度為86.53%，特異度為84.64%。上述結(jié)果表明，血清lncRNA SNHG16和miR-147a表達(dá)水平可用于臨床重癥肺炎診斷。肺損傷是肺炎最直接的后果，其特征是肺泡毛細(xì)血管膜的炎性損傷和炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生[17]。炎性細(xì)胞因子在肺炎的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[18]。最近研究表明miR-147a與不同組織炎癥有關(guān)，過度表達(dá)可抑制宮頸癌細(xì)胞惡性進(jìn)展，而且會降低白細(xì)胞介素IL-6和IL-1β的表達(dá)[19]。這與本研究結(jié)果相似，本研究從臨床角度發(fā)現(xiàn)重癥肺炎患者血清lncRNA SNHG16和miR-147a表達(dá)異?？赡芘c疾病診斷及預(yù)后緊密相關(guān)，為臨床診療提供潛在生物標(biāo)志物。本研究尚存在不足之處，由于臨床樣本收集存在一定難度，后期研究將在工作中積累樣本，提高嚴(yán)謹(jǐn)性，lncRNA SNHG16和miR-147a在重癥肺炎的發(fā)生發(fā)展中的具體機(jī)制還需要進(jìn)一步深入探討。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA SNHG16和miR-147a在重癥肺炎患者血清中表達(dá)異常，而且在重癥肺炎患者血清中l(wèi)ncRNA SNHG16和miR-147a表達(dá)水平與APACHEⅡ評分、CPIS評分、血清lncRNA SNHG16和miR-147a表達(dá)水平是影響重癥肺炎患者預(yù)后獨立危險因素，二者聯(lián)合診斷靈敏性和特異性更高，對診斷重癥肺炎具有一定臨床參考意義。