劉 偉，支 媛，高 璐，滕 萱，陸 雙

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科，遼寧 錦州 121000)

急性胰腺炎的發(fā)病率及病死率逐年升高，輕型急性胰腺炎預(yù)后較好，而重型急性胰腺炎病情重，病變常進(jìn)展迅速，可合并多器官功能障礙、膿毒癥等危及生命的并發(fā)癥[1-2]。早期診斷及干預(yù)是防止急性胰腺炎病情加重的關(guān)鍵。近年學(xué)者關(guān)注到血清中的相關(guān)因子與病變的形成和進(jìn)展相關(guān)。CXC趨化因子配體13(CXCL-13)、CXC趨化因子配體16(CXCL-16)屬于趨化因子家族，由次級(jí)淋巴器官中的濾泡樹(shù)突細(xì)胞和組織細(xì)胞產(chǎn)生，能與表達(dá)在B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞及濾泡樹(shù)突細(xì)胞表面的CXCR-5相結(jié)合，引起B(yǎng)淋巴細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞在炎性區(qū)域聚集，促進(jìn)淋巴濾泡的形成[3]。近年學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)兩者在炎性疾病的形成中具有一定作用[4-5]。微小RNA(microRNAs,miRNAs)是學(xué)者在研究中發(fā)現(xiàn)的能調(diào)控炎性疾病形成的因子，主要是對(duì)下游靶基因進(jìn)行調(diào)控發(fā)揮生物學(xué)作用[6]。微小RNA-340-3p(miR-340-3p)是一種與炎性反應(yīng)和腫瘤增殖相關(guān)的多功能miRNA，其下游因子較多，也是其功能復(fù)雜的重要因素[7]。在生物信息預(yù)測(cè)時(shí)本課題組發(fā)現(xiàn)miR-340-3p均與CXCL-13、CXCL-16有可結(jié)合的位點(diǎn)。本研究檢測(cè)急性胰腺炎患者血清中miR-340-3p、CXCL-13和CXCL-16的表達(dá)特征，分析其相關(guān)性及在病變進(jìn)展中的價(jià)值，以期為臨床工作提供幫助。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2021年8月至2022年6月于我院明確診斷為急性胰腺炎69例作為觀察對(duì)象。病例納入均符合《中國(guó)急性胰腺炎診治指南(2019)》中的標(biāo)準(zhǔn)，即符合下述3項(xiàng)中2項(xiàng)：①符合急性胰腺炎腹痛特征；②血清淀粉酶和(或)脂肪酶濃度上調(diào)至3倍及以上；③腹部影像學(xué)表現(xiàn)支持?；颊呔鶠槭状伟l(fā)病，24 h內(nèi)入院就診。排除標(biāo)準(zhǔn)：慢性胰腺炎、自身免疫性疾病史、惡性腫瘤史、合并嚴(yán)重的高血壓及肝腎功能不全者。本研究經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，家屬均簽署知情同意書(shū)。依據(jù)2012年亞特蘭大的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)。輕癥：無(wú)壞死及器官功能障礙；中重癥：一過(guò)性器官功能障礙，或伴有局部或全身并發(fā)癥；重型：持續(xù)性(>48 h)器官功能障礙伴感染性胰腺壞死。

1.2 檢測(cè)方法 患者確診后抽取3 ml空腹靜脈血后，離心(3000 r/min)20 min后，將血清分離，并置于-80 ℃冰箱中凍存。樣本集中檢測(cè)，由同一檢驗(yàn)師操作，并均于1個(gè)月內(nèi)完成。

1.2.1 qRT-PCR檢測(cè)miR-340-3p ：應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(qRT-PCR法)檢測(cè)miR-340-3p的表達(dá)。TriZol提取總RNA(TriZol購(gòu)于美國(guó)invitrogen)。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，引物由上海通生工公司合成，miR-340-3p上游：5’-ACTGCTGCTGTGTGGTGAC-GTACG-3’，下游：5’-GCACGTGCGCACGTCGTGTTATT-3’。以U6作為內(nèi)參，引物上游：5’-GGCA-GAAACGTGGAACCG-3’下游：5’-TTGGAACAGT-GGGCAAATTC-3’。擴(kuò)增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 25 s，64 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s；延伸。以2-ΔΔCt法表示結(jié)果。

1.2.2 CXCL-13和CXCL-16的檢測(cè)：應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清中CXCL-13和CXCL-16的表達(dá)。CXCL-13(ab269370)和CXCL-16(ab197744)均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。取出凍存血清，自然融化后，輕輕振蕩混勻，加入100 μl標(biāo)準(zhǔn)品、樣品和對(duì)照品，貼上封板膜，37 ℃孵育90 min后進(jìn)行洗滌，加入100 μl工作液，孵育60 min，洗滌后加入100 μl ABC工作液，37 ℃孵育30 min，PBS洗滌5次，加90 μl TMN顯色劑，37 ℃孵育2 min后，每孔加入準(zhǔn)備好的TMN stop solution，顏色立刻變?yōu)辄S色，應(yīng)用酶標(biāo)儀式檢測(cè)(450/546 nm雙波長(zhǎng))，測(cè)定各孔OD值。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算其余各孔樣本濃度。

2 結(jié) 果

2.1 兩組一般資料比較 收集病例中男35例，女34例，有吸煙史者為19例，無(wú)吸煙史者為50例；年齡30～75歲，平均(50.53±5.37)歲，體重指數(shù)(BMI)范圍17.1～32.2 kg/m2，平均(23.61±2.56)kg/m2。對(duì)照組中男33例，女36例，有吸煙史者為15例，無(wú)吸煙史者為54例；年齡27～60歲，平均(47.09±5.35)歲，BMI范圍18～29 kg/m2，平均(22.21±1.52) kg/m2。兩組在常規(guī)資料比較中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 兩組miR-340-3p、CXCL-13和CXCL-16表達(dá)比較 兩組miR-340-3p、CXCL-13和CXCL-16的表達(dá)差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，即觀察組中miR-340-3p的表達(dá)下調(diào)，CXCL-13和CXCL-16的表達(dá)升高。見(jiàn)表2。

表2 兩組中miR-340-3p、CXCL-13和CXCL-16表達(dá)比較

2.3 觀察組不同臨床特征中miR-340-3p、CXCL-13和CXCL-16表達(dá)的差異 miR-340-3p、CXCL-13和CXCL-16在觀察組不同病變分級(jí)的表達(dá)中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，miR-340-3p、CXCL-13和CXCL-16在不同性別、年齡、BMI及有無(wú)吸煙史的表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 觀察組不同臨床特征中miR-340-3p、CXCL-13和CXCL-16表達(dá)的差異

2.4 觀察組中miR-340-3p、CXCL-13和CXCL-16的相關(guān)性 應(yīng)用Pearson相關(guān)分析顯示，觀察組中miR-340-3p和CXCL-13(r=-0.634,P=0.032)、miR-340-3p和CXCL-16(r=-0.620,P=0.022)均呈負(fù)相關(guān)性，CXCL-13和CXCL-16(r=0.614,P=0.014)呈正相關(guān)性。

2.5 生物信息分析 先利用miRNAs靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站Targetscan Human 7.2(http://www.targetscan.ort/vert_72)進(jìn)行預(yù)測(cè)，篩選出miR-340-3p的全部靶基因。將全部靶基因輸入DAVID 6.8(Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery)的生物信息分析網(wǎng)站(https://david.ncifcrf.gro/home.jsp)，用GO生物學(xué)功能富集分析及KEGG信號(hào)通路分析，篩選相關(guān)的靶基因。將兩組靶基因輸入Venny2.1(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)，找到交集基因。結(jié)果顯示miR-340-3p與CXCL-13、miR-340-3p與CXCL-16有可能結(jié)合的位點(diǎn)。

3 討 論

急性胰腺炎的發(fā)生是多種生物學(xué)因子參與的疾病，多種研究顯示其發(fā)生有炎性調(diào)控機(jī)制、遺傳機(jī)制及免疫性機(jī)制等[7-8]。趨化因子是與炎性調(diào)控相關(guān)的一組細(xì)胞因子，是一類(lèi)對(duì)靶細(xì)胞有趨化作用的細(xì)胞因子，能與表達(dá)靶基因的細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體結(jié)合，促進(jìn)靶細(xì)胞的遷移而表現(xiàn)出特異的生物學(xué)效應(yīng)[9-10]。CXCL-13基因定位于4q21上，其氨基酸序列與小鼠有約2/3的同源性，在人體主要分布在肝、脾、淋巴結(jié)和胃中[11]。CXCL-16在人體主要分布在肺、肝、小腸及腎臟，兩者主要表達(dá)在單核巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞，均包含跨膜區(qū)和黏蛋白樣結(jié)構(gòu)，具有分泌型和結(jié)合型兩種形式。CXCL-13、CXCL-16在人正常胰腺組織中的表達(dá)量極低[12-13]。也有研究認(rèn)為急性胰腺炎病變形成時(shí)細(xì)胞因子的表達(dá)量增加，是炎性反應(yīng)的瀑布效應(yīng)結(jié)果，其中有關(guān)的信號(hào)因子較多，也包括miRNA的靶向調(diào)控作用調(diào)節(jié)因子[14-15]。miRNA是復(fù)雜的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要部分，其經(jīng)典方式是作為上游因子對(duì)下下游靶基因進(jìn)行調(diào)控而發(fā)揮生物學(xué)特性[16]。miRNA發(fā)生改變時(shí)，下游多種因子也發(fā)生改變這能使mRNA 的翻譯功能發(fā)生改變[17]。本實(shí)驗(yàn)篩選出的miR-340-3p具有調(diào)控炎癥及腫瘤細(xì)胞增殖的多重作用。

本研究結(jié)果顯示miR-340-3p在急性胰腺炎患者血清中的表達(dá)量明顯降低，CXCL-13和CXCL-16的表達(dá)量明顯增高，提示miR-340-3p、CXCL-13和CXCL-16的異常表達(dá)狀態(tài)是急性胰腺炎病變形成過(guò)程中的重要分子事件。結(jié)果顯示miR-340-3p、CXCL-13和CXCL-16在急性胰腺炎的不同病變分級(jí)中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即miR-340-3p在重癥患者的表達(dá)量更低，CXCL-13和CXCL-16在重癥患者表達(dá)更高，提示miR-340-3p、CXCL-13和CXCL-16與病變分級(jí)程度密切相關(guān)，也提示檢測(cè)三者的表達(dá)可能與病變分級(jí)相關(guān)，可能是預(yù)測(cè)病變分級(jí)的客觀指標(biāo)。結(jié)果顯示miR-340-3p與CXCL-13、miR-340-3p與CXCL-16均具有負(fù)相關(guān)性，且經(jīng)生物信息預(yù)測(cè)并發(fā)現(xiàn)有相關(guān)結(jié)合位點(diǎn)，提示其具有負(fù)向協(xié)同作用。活化后的CXCL-13對(duì)胰腺上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞的損傷有明顯的促進(jìn)作用。有研究認(rèn)為CXCL-16表達(dá)升高，能促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)炎性小體的表達(dá)，使其活性增強(qiáng)；也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)CXCL-16的表達(dá)增加常伴隨著氧自由基的產(chǎn)生，使局部組織和細(xì)胞發(fā)生損傷[18]。有學(xué)者探究手術(shù)后腦膜炎患者腦脊液中CXCL-13的水平，發(fā)現(xiàn)CXCL-13在術(shù)后并發(fā)腦膜炎患者腦脊液中水平明顯升高，認(rèn)為其不僅影響腦膜炎的進(jìn)程，還對(duì)于篩查術(shù)后并發(fā)腦膜炎患者有一定價(jià)值[19]。miR-340-3p下降在機(jī)體中的作用途徑可能更多，如調(diào)節(jié)白細(xì)胞的“胞吞”作用、減弱巨噬細(xì)胞的活化等，使損傷因子的清除能力增強(qiáng)[20]。也有研究認(rèn)為miR-340-3p的效應(yīng)因子是長(zhǎng)非編碼RNA 反義RNA，因此基于miR-340-3p在炎癥中進(jìn)行深入研究對(duì)探討炎癥形成的分子機(jī)制可能有重要價(jià)值。急性胰腺炎在疾病發(fā)展時(shí)細(xì)胞和組織形成多種炎性細(xì)胞因子[21]，部分因子如IL-18等能通過(guò)NO依賴(lài)途徑加速表面上皮的損傷，并引起纖維細(xì)胞等間質(zhì)細(xì)胞成分的改變。但是miR-340-3p與CXCL-13、miR-340-3p與CXCL-16的具體靶向調(diào)控作用尚需要體外行雙熒光素酶等基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

總之，急性胰腺炎患者血清中miR-340-3p低表達(dá)、CXCL-13和CXCL-16高表達(dá)，miR-340-3p與CXCL-13、miR-340-3p與CXCL-16具有負(fù)向協(xié)同作用，參與病變的形成和進(jìn)展。