梁 紅，霍紅艷

(西安高新醫(yī)院麻醉科，陜西 西安 710075)

膿毒癥是一種由感染引起的嚴重全身炎癥反應，與高發(fā)病率和病死率有關。膿毒癥臨床表現(xiàn)包括血流動力學不穩(wěn)定、凝血問題和多器官功能障礙等[1-2]。在膿毒癥的進展中，具有內(nèi)皮屏障功能障礙特征的血管滲漏是一個關鍵的病理生理步驟，可導致組織水腫和器官功能障礙，急性肺損傷(Acute lung injury,ALI)是膿毒癥最常見的并發(fā)癥之一，ALI使許多臨床癥狀復雜化，表現(xiàn)為肺功能減退、肺水腫、中性粒細胞浸潤和肺泡毛細血管膜通透性增加[3]。炎癥因子的過度釋放、粘附分子上調、中性粒細胞聚集、血管完整性喪失、肺泡上皮和肺血管內(nèi)皮細胞凋亡是膿毒癥相關肺損傷的主要病理變化[4-5]。右美托咪定(Dexmedetomidine,DEX)是一種α2-腎上腺素受體激動劑，廣泛用于重癥監(jiān)護室危重患者的圍手術期鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛和抗焦慮[6]。越來越多的證據(jù)表明DEX具有抗炎、抗凋亡和抗氧化特性，可減輕動物模型中缺血/再灌注、脂多糖和通氣后的肺損傷[7]。最近發(fā)現(xiàn)DEX具有調節(jié)線粒體融合/裂變以減輕膿毒癥相關肺損傷的作用，已被證明可通過抑制細胞凋亡和促進細胞存活來防止膽紅素誘導的肺損傷[7]。臨床報告的嚴重膿毒癥患者的研究表明，DEX通過其抗炎作用提高了存活率[8]。本研究中探討了DEX對膿毒癥誘導的ALI的保護作用及其與磷酸化JAK激酶2(p-JAK2)/酪氨酸磷酸化(p-STAT3)通路的潛在聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 實驗大鼠 30只健康成年雄性無病原體Wistar大鼠(體重250～300 g)購自陜西省食品藥品檢驗研究院，許可證號SYXK(陜)2018-002。所有動物都飼養(yǎng)在21～ 23 ℃,30%～40% 濕度和12 h明暗循環(huán)中，飼養(yǎng)期間大鼠可隨意獲取食物和水。

1.2 實驗儀器 ELISA試劑盒購自上海碧云天有限公司，批號PT512；TRIzol 試劑、RevertAid 逆轉錄酶均購自賽默飛世科技科技，批號EP0442、15596026；p-JAK2(1∶1000)、p-STAT3(1∶1000)、和 β-肌動蛋白(1∶8000)均購自英國abcam公司，批號分別為ab57602、ab2185和KM9001。

1.3 膿毒癥大鼠模型 對所有大鼠肌肉注射50 mg/kg鹽酸氯胺酮、5 mg/kg甲苯噻嗪和靜脈注射2 g/(kg·h)芬太尼，對所有大鼠進行誘導和維持麻醉，麻醉深度由腳趾捏反應法確定。通過尾靜脈導管提供水合和藥物輸注，以0.5 ml/h的速率注入等滲氯化鈉溶液維持水合。建立盲腸結扎穿孔術(CLP)誘導的膿毒癥大鼠模型，在實驗過程中，讓大鼠自主呼吸，同時監(jiān)測外周血氧飽和度。膿毒癥是通過盲腸結扎和穿刺引起的，通過3 cm中線切口進行剖腹探查、結扎和穿孔盲腸。盲腸用3-0絲結扎，用18 G針打孔2次，輕輕擠壓，擠出少量糞便。將盲腸重新置于腹腔內(nèi)，并關閉剖腹切口。在盲腸結扎和穿刺程序之后，將大鼠放回各自的籠子，自由獲取食物和水。假手術組(對照組)大鼠僅接受剖腹和關腹操作。

1.4 分組和實驗設計 將大鼠隨機分為三組：對照組、模型組和 DEX組。每組10只。模型組和DXE組大鼠均行盲腸結扎穿孔術，對照組僅行剖腹和關腹操作。DEX組大鼠給予5 g/(kg·h) DEX靜脈滴注1 h，模型組和對照組的大鼠接受等體積的鹽水。6 h后大鼠用氯胺酮/甲苯噻嗪組合麻醉每組4只，并抽取血樣用于測量炎癥因子水平分析。CLP術后24 h，其余各組大鼠靜脈注射戊巴比妥200 mg/kg安樂死，采集肺標本進行組織分析、組織學檢查。

1.5 實驗方法

1.5.1 檢測炎癥細胞因水平:收集外周血和肺組織樣本用于分析炎性細胞因子。使用ELISA試劑盒檢測腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-10(IL-10)和單核細胞趨化蛋白1 (MCP-1) 的水平。

1.5.2 分析肺組織學:將肺標本固定在2%戊二醛和2%多聚甲醛在0.1 mol/L甲胂酸鹽緩沖液(pH 7.4)中的混合物中，用分級酒精系列脫水，并在52 ℃下嵌入石蠟中。制備切片并用蘇木精和伊紅 (HE) 染色以進行組織學評估。由病理醫(yī)師對每個肺切片的肺損傷進行評分，觀察并記錄肺泡毛細血管充血、出血、中性粒細胞在血管壁中的浸潤或聚集，以及肺泡壁的厚度。每個項目根據(jù)以下等級進行評分：0：最小損壞；1：輕度損壞；2：中度損壞；3：嚴重損壞；4：最大傷害。

1.5.3 肺組織原位凋亡:通過末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)介導的熒光dUTP標記(TUNEL)方法測定肺組織中的原位DNA片段化。根據(jù)制造商的說明，使用Apop Tag過氧化物酶原位凋亡檢測試劑盒進行TUNEL。過氧化物酶底物3.3-二氨基聯(lián)苯胺用于觀察凋亡細胞。甲基綠(0.5%)用于核染色。在光學顯微鏡下觀察 TUNEL 陽性細胞。對肺中淋巴濾泡形成區(qū)域之外的5個不同的大生長區(qū)域中的TUNEL陽性細胞進行計數(shù)后，計算平均值。

1.5.4 檢測氧化應激:氧化應激指數(shù) (OSI) 計算為總氧化劑狀態(tài) (TOS) 和總抗氧化劑水平 (TAS) 水平之間的比率。血清TOS和TAS濃度按照商業(yè)試劑盒制造商的說明，使用微孔板分光光度計進行測量。TOS測定用過氧化氫 (H2O2)進行校準，結果以μmol H2O2當量/L表示；TAS使用標準抗氧化物(Trolox)進行校準，結果以μmol Trolox 當量/L表示。

1.5.5 檢測肺組織凋亡相關基因mRNA表達:使用TRIzol試劑提取肺組織或NR8383細胞中的總RNA。在以下條件下，使用RevertAid 逆轉錄酶將1 μg總RNA轉化為cDNA：25 ℃ 10 min，42 ℃ 60 min和70 ℃10 min。RT-PCR 分析使用Applied Biosystems 7300實時PCR系統(tǒng)和軟件，使用BCL2-Associated X的蛋白質(Bax)、B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl2)、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)和β-的特異性mRNA引物進行。PCR混合物的預變性在95 ℃下進行5 min，進行40個熱循環(huán)，包括在95 ℃下變性10 s，在60 ℃下退火和延伸30 s。每個轉錄物的拷貝數(shù)計算為歸一化法管家基因β-肌動蛋白的相對拷貝數(shù)。2-ΔΔCt方法用于確定靶基因的相對mRNA表達。

1.5.6 檢測p-JAK2和p-STAT3的蛋白表達:冷凍的肺標本通過冰上的裂解緩沖液勻漿，將細胞裂解物在4 ℃下以9000 g離心10 min，收集上清液。通過二辛可寧酸測定法定量蛋白質濃度，將蛋白質提取物(40 μg)加熱、變性并加載到10% SDS-PAGE上進行電泳，轉移到PVDF膜上。在37 ℃下用Tris緩沖鹽水(TBST)中的5%脫脂牛奶封閉膜1 h，用p-JAK2(1∶1000)、p-STAT3(1∶1000)、和β-肌動蛋白(1∶8000)在4 ℃過夜。用TBST洗滌四次后，將印跡與適當?shù)睦备^氧化物酶偶聯(lián)的二抗在室溫下孵育1 h。上樣對照是組成型表達的蛋白質β-肌動蛋白，印跡通過增強化學發(fā)光系統(tǒng)可視化，并使用Image J進行分析。

1.5.7 檢測膿毒癥大鼠血管通透性:通過大鼠頸靜脈注射9 mg/kg異硫氰酸熒光素牛血清白蛋白(FITC-BSA)，給藥后1 h，打開腹腔，切開腹主動脈，經(jīng)頸靜脈緩慢注入生理鹽水直至肺組織變白。用OCT膠包埋右肺組織，并進行冰凍切片(切片厚度10～15 μm)。用4%多聚甲醛固定組織15 min，用0.1% Triton-X滲透5 min，并在37 ℃下與4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI,1∶50)一起培養(yǎng)30 min。在激光共聚焦顯微鏡下觀察肺組織中的FITC-BSA滲出。沿腹部中部切開2 cm的切口，供其他大鼠選擇腸系膜固定有豐富的微血管。FITC-BSA被注入股靜脈6 min后，通過倒置顯微鏡觀察FITC-BSA滲漏到腸系膜微血管中。

2 結 果

2.1 DEX減輕膿毒癥大鼠體內(nèi)炎癥反應 模型組TNF-α、IL-6和MCP-1水平較對照組升高(均P<0.05)，而IL-10水平較對照組降低(均P<0.05)，DEX組TNF-α、IL-6和MCP-1水平較模型組降低(均P<0.05)，IL-10水平升高(P<0.05)。見表1。

表1 三組大鼠肺組織炎癥因子水平比較(pg/ml)

2.2 DEX對肺組織病理學和細胞凋亡的影響 模型組HE染色和TUNEL染色評分較對照組升高(均P<0.05)，DEX組HE染色和TUNEL染色評分較模型組降低(均P<0.05)，見表2。CLP和假手術后24 h獲得的肺切片的代表性病理表現(xiàn)：對照組結構正常，肺泡清晰。與對照組比較，模型組肺標本的初步觀察表明存在明顯的病理病變，包括嚴重的白細胞浸潤、肺泡壁增厚、肺水腫和出血，經(jīng)DEX預處理后，大鼠病變情況明顯減輕。見圖1。

表2 HE和TUNEL染色分析大鼠肺損傷(分)

圖1 肺切片的代表性病理表現(xiàn)(HE染色，×40)

2.3 三組大鼠氧化應激指標比較 模型組血清TAS水平較對照組降低(P<0.05)，DEX組血清TAS水平較模型組升高(P<0.05)，模型組血清TOS水平和OSI指數(shù)較對照組升高(均P<0.05)，DEX組血清TOS水平和OSI指數(shù)較模型組降低(均P<0.05)。見表3。

表3 三組大鼠氧化應激指標比較

2.4 肺組織凋亡相關蛋白mRNA表達 模型組Bcl-2 mRNA表達較對照組降低(P<0.05)，Bax和Caspase-3 mRNA表達升高(均P<0.05)，DEX組Bcl-2 mRNA表達較模型組升高(P<0.05)，Bax和Caspase-3 mRNA表達降低(均P<0.05)。見表4。

表4 三組大鼠肺組織凋亡相關蛋白mRNA表達比較

2.5 DEX抑制CLP誘導的p-JAK2/p-STAT3通路的激活 模型組p-JAK2和p-STAT3蛋白表達較對照組升高(均P<0.05)，DEX組p-JAK2和p-STAT3蛋白表達較模型組降低(均P<0.05)。見表5。

表5 三組大鼠檢測p-JAK2和p-STAT3的蛋白表達比較

2.6 DEX抑制膿毒癥大鼠的血管通透性檢測 模型組肺血管通透性和腸系膜血管通透性較對照組升高(均P<0.05)，DEX組血管通透性較模型組降低(P<0.05)。與對照組比較，膿毒癥大鼠的肺血管(A)和腸系膜(B)通透性顯著增加(均P<0.05)，與模型組相比，Dex可使肺血管和腸系膜的FITC-BSA的滲漏顯著緩解(均P<0.05)。見表6。

表6 三組大鼠血管通透性比較(μg/g)

3 討 論

肺損傷是膿毒癥的嚴重并發(fā)癥，與高病死率相關。肺泡毛細血管屏障損傷、氧化應激、炎癥級聯(lián)刺激、細胞因子反應增加、及肺泡上皮和內(nèi)皮細胞凋亡是病理性的與肺損傷相關的過程。膿毒癥患者通常需要鎮(zhèn)靜以維持有效的機械通氣，以確?；颊邔@種治療的依從性，并減少焦慮[9-10]。DEX是一種有效的、高選擇性的α2-腎上腺素能受體激動劑，由于其鎮(zhèn)痛和鎮(zhèn)靜作用而無呼吸抑制，因此優(yōu)選用于重癥監(jiān)護病房的鎮(zhèn)靜。除了鎮(zhèn)靜、抗焦慮、鎮(zhèn)痛和交感神經(jīng)阻滯作用外，DEX已被證明具有抗炎和抗凋亡作用。臨床表明，腹腔注射DEX可抑制膿毒癥小鼠肺組織的炎癥反應，并且這種作用部分是由膽堿能抗炎途徑介導的[11-12]。CLP誘導體內(nèi)模型概括了人類全身性膿毒性肺損傷的主要特征，肺組織病理學損傷和肺損傷評分顯著上升，TOS、OSI水平升高，TAS降低。本文研究結果表明：DEX賦予肺保護免受CLP誘導的氧化應激損傷，改善肺、腸系膜血管通透性，降低炎癥因子水平和細胞凋亡。ALI作為敗血癥的標志，是導致死亡的主要原因之一，盡管ICU有顯著改善，但治療選擇極為有限[13-15]。目前在膿毒癥相關肺損傷的發(fā)病機制中廣泛提出了可能由異常激活的ROS引起的線粒體融合和裂變的異常平衡。事實上，氧化應激源于線粒體活性氧(ROS)的過度產(chǎn)生和內(nèi)毒素誘導的mtDNA釋放，導致線粒體功能障礙和超微結構損傷[16]。本研究中應用血清TOS、TAS和OSI水平反映氧化劑/抗氧化劑平衡。體內(nèi)研究表明，CLP誘導后24 h足以引起氧化損傷。本研究闡明了DEX通過減輕血管滲漏從而對膿毒癥誘導的ALI起到保護作用，為膿毒癥的防治提供了新的方向。血管內(nèi)皮細胞位于血管內(nèi)皮表面，形成一道屏障。循環(huán)血液和組織，避免各種有毒物質和炎癥損傷造成的組織損傷。膿毒癥引起的內(nèi)皮損傷導致血管滲漏，從而導致多器官功能障礙綜合征[17]。本研究表明，膿毒癥大鼠的血管通透性顯著增加，DEX給藥減輕了血管滲漏，為膿毒癥引起的血管滲漏和器官功能障礙的防治提供了新的方向。

肺損傷可由內(nèi)毒素和其他細菌毒素引起。膿毒癥是一種急性炎癥，可增加肺上皮細胞的通透性并迅速在肺部積聚液體，導致急性肺水腫伴間質纖維化[18]。博來霉素誘導的纖維化釋放炎癥細胞，包括中性粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞。中性粒細胞的激活與炎癥介質(TNF-α、IL-1β和IL-6)和趨化因子(IL-8和MCP-1)密切相關，它們在ALI中起重要作用。此外，巨噬細胞募集促纖維化細胞因子，如TNF-α或(和)IL-6，為纖維化提供微環(huán)境。TNF-α和IL-6反映了機體的炎癥程度。TNF-α、IL-1β、IL-6和一氧化氮是重要的促炎細胞因子，這些細胞因子之間的相互作用，伴隨著放大級聯(lián)反應，加速了膿毒癥誘導的ALI的進展，從而改變了血管通路通透性，導致肺水腫的形成[19]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)DEX顯著抑制CLP刺激的肺組織中炎性細胞因子(TNF-α、IL-6和MCP-1)的表達，提示DEX可能在肺通過抑制炎癥反應。肺組織中的細胞凋亡與膿毒癥期間肺損傷的發(fā)展和進展有關。全身炎癥級聯(lián)反應的啟動和中性粒細胞在肺組織中的積累可能會促進細胞凋亡，導致肺功能障礙和膿毒癥病死率增加。肺泡凋亡已被證明會破壞上皮屏障功能，引發(fā)ALI。在本研究中，檢測到凋亡細胞以確定DEX對肺損傷的影響。TUNEL結果顯示，與模型組相比，DEX組細胞凋亡率降低，說明外源性DEX能有效抑制膿毒癥ALI大鼠肺上皮細胞凋亡。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族的重要凋亡因子；Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，而Bax是一種促凋亡蛋白。Caspase-3是細胞凋亡下游途徑中的關鍵調節(jié)蛋白，可觸發(fā)細胞凋亡并最終介導細胞凋亡。本研究結果表明，Bax的表達上調，Bcl-2的表達下調，從而刺激Caspase-3誘導肺細胞凋亡。相比之下，DEX逆轉了該過程，表明DEX抑制肺上皮細胞的凋亡以防止肺損傷。JAK2/STAT3通路涉及許多生物過程，JAK2/STAT3通路在炎癥介導的生物學進展中起關鍵作用。許多研究報告稱，JAK2/STAT3通路參與了ALI的發(fā)展。以往研究報告稱，JAK與細胞信號傳導有關，而STAT3激酶與細胞生長、分化和細胞凋亡有關。相關研究發(fā)現(xiàn)STAT可能與ALI的發(fā)展有關，并證明JAK2/STAT3水平在嚴重急性胰腺炎ALI大鼠模型中上調[20]。本研究結果表明，對照組JAK2和STAT3蛋白主要為磷酸化，表達水平較低。CLP誘導后，肺中的JAK2/STAT3信號通路被激活，表現(xiàn)為JAK2和STAT3的磷酸化水平升高，DEX顯著抑制JAK2和STAT3的磷酸化水平，顯著CLP誘導的ALI大鼠模型中JAK2/STAT3信號通路的激活。

綜上所述，DEX通過調控JAK2/STAT3信號通路降低體內(nèi)炎癥反應，減少肺上皮細胞凋亡并改善肺血管通透性，從而可有效抑制與膿毒癥相關的ALI，這些發(fā)現(xiàn)可能為膿毒癥的治療提供新的方向。