商曰玲，夏晶晶，支柳，余曉紅*

鹽城工學(xué)院海洋與生物工程學(xué)院（鹽城 224051）

食用果蔬酵素是一種以多種新鮮水果與蔬菜為原料，利用其自身含有的有益微生物自然發(fā)酵而產(chǎn)生的、含有多種營養(yǎng)物質(zhì)的酵素產(chǎn)品[1-2]。食用果蔬酵素中含有豐富的有機(jī)酸、多酚類物質(zhì)、多糖、維生素、生物活性肽、氨基酸、蛋白質(zhì)等活性成分，具有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫力等多種生理功能[3-4]。有研究表明，廢棄的藍(lán)莓皮渣加入酵母菌和植物乳桿菌混合發(fā)酵，發(fā)酵后還原力提高1.24倍，羥基自由基清除能力提高8.1%，DPPH自由基清除能力提高5.0%[4]。采用紅心火龍果果皮發(fā)酵，可得產(chǎn)物中總酚和總黃酮含量最高，且具有最強(qiáng)的總·OH清除能力、還原性及抗氧化性。此外，果蔬酵素具有抑菌作用，可以起到維持面部潔凈、抑制面部油脂的功效[5]。

食用果蔬酵素因其健康性和天然性，成為越來越受消費者歡迎的一類功能食品，主要用于營養(yǎng)保健、臨床醫(yī)學(xué)、養(yǎng)顏美容和亞健康調(diào)理等領(lǐng)域，而酵素在降脂性能方面的相關(guān)研究較少[6]。相關(guān)報道有采用糙米酵素提取物灌喂大鼠，其肝臟粗脂肪質(zhì)量顯著低于高脂對照組，從側(cè)面表明糙米酵素提取物有預(yù)防脂肪肝的作用[5]。另有研究采用蘋果、香蕉、胡蘿卜、卷心菜、香菇、昆布及藍(lán)莓等60余種新鮮水果、蔬菜、菇類、藻類及長白山特色野生植物等為原料，恒溫發(fā)酵300 d以上，制得果蔬精華液，含有功能性低聚糖、氨基酸、有機(jī)酸等豐富的營養(yǎng)成分，具有改善人體內(nèi)微生態(tài)環(huán)境、提高機(jī)體免疫力、延緩衰老及降低血清膽固醇等功效[7]。

試驗通過多種蔬菜與水果制備食用果蔬酵素，測定酵素中的蛋白酶活性、還原性和抗氧化性，分析影響食用果蔬酵素物質(zhì)活性的主要因素，通過測定脂肪酶活性、膽固醇酯酶活性抑制率和膽固醇膠束溶解度抑制率等指標(biāo)研究酵素的體外降脂性能。通過對食用酵素活性成分等指標(biāo)的分析評價及其降脂性能研究，對進(jìn)一步闡明果蔬酵素的保健機(jī)理、高效定向開發(fā)食用酵素保健食品等具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 果蔬酵素的制備

試驗制作的酵素采用泰國樂素昆博士制作酵素的方法，按蜂蜜、果蔬、水為1∶3∶10的比例，置于陰涼通風(fēng)處自然發(fā)酵6個月。不同配方的酵素按原料種類和消化性果蔬數(shù)目分類如下。

酵素A的原料為10種蔬菜，以產(chǎn)品器官為分類標(biāo)準(zhǔn)：（1）根菜類：胡蘿卜、白蘿卜；（2）莖菜類：蓮藕、洋蔥；（3）葉菜類：白菜、芹菜；（4）花菜類：西藍(lán)花、花菜；（5）果菜類：西紅柿、黃瓜。其中，包含胡蘿卜、白菜、芹菜、西紅柿、黃瓜5種助消化蔬菜。

酵素B的原料為10種水果，以水果特性為分類標(biāo)準(zhǔn)：（1）瓜類：西瓜、甜瓜；（2）柑橘類：檸檬、甜橙；（3）漿果類：葡萄、香蕉；（4）仁果類：蘋果、梨；（5）核果類：桃子、黑布林。

酵素C的原料為5種蔬菜和5種水果，分別為胡蘿卜、洋蔥、白菜、西藍(lán)花、西紅柿、西瓜、甜橙、葡萄、蘋果、桃子。

酵素D的原料為10種蔬菜和10種水果，分別為胡蘿卜、白蘿卜、蓮藕、洋蔥、白菜、芹菜、西藍(lán)花、花菜、西紅柿、黃瓜、西瓜、甜瓜、檸檬、甜橙、葡萄、香蕉、蘋果、梨、桃子、黑布林。

酵素E的原料為20種助消化性的蔬菜和水果，分別為胡蘿卜、白蘿卜、芹菜、韭菜、黃瓜、西紅柿、冬瓜、綠豆芽、青椒、南瓜、蘋果、梨、甜橙、香蕉、黑布林、楊梅、火龍果、獼猴桃、芒果、西柚。

1.2 主要試劑

三氯乙酸、碳酸鈉、鹽酸、無水乙醇、氯化鈉、膽固醇、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、鉬酸銨磷酸、氫氧化鈉、油酸、乙腈（均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；硫酸、磷酸鈉、磷酸氫二鈉（均為分析純，江蘇彤晟化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)）；三氯化鐵、橄欖油（均為化學(xué)純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；酪蛋白（化學(xué)純，江蘇彤晟化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)）；福林試劑、L-酪氨酸（均為生化試劑，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；酚酞（生化試劑，上海山浦化工有限公司）；對硝基苯基丁酸酯（生化試劑，上海創(chuàng)賽科技有限公司）；膽固醇酯酶（生化試劑，南京都萊生物技術(shù)有限公司）；總膽固醇試劑盒（廈門海菲生物技術(shù)有限公司）。

1.3 儀器與設(shè)備

202-1A型電熱恒溫干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；UV752N型紫外可見分光光度計（上海佑科儀器儀表有限公司）；FA1104型電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；80-1型臺式離心機(jī)（金壇市杰瑞爾電器有限公司）；PHS-3C型pH計（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；KQ218型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.4 試驗方法

1.4.1 蛋白酶活性的測定

采用福林法測定酵素的蛋白酶活性[8]。配制不同濃度梯度的L-酪氨酸溶液，加入碳酸鈉溶液（42.4 g/L）5 mL，福林溶液1 mL，搖勻，于40 ℃水浴20 min，在波長680 nm處測得吸光度。以L-酪氨酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品的測定：取酵素1 mL，加入1 mL酪蛋白溶液（1%），于40 ℃水浴反應(yīng)10 min后，立即加入2 mL三氯乙酸（65.4 g/L），搖勻，靜置10 min后過濾，取濾液1 mL按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定方法進(jìn)行檢測。對照試驗測定方法同上，不同是將酪蛋白溶液與三氯乙酸的加入次序調(diào)換，使酶失活，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算酵素中蛋白酶的活性。

1.4.2 總抗氧化能力的測定

采用鉬氨酸還原法測定酵素的總抗氧化能力[9]。制備20 mg/mL的維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取30，50，80和100 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液定容至10 mL，將稀釋過的溶液加入到反應(yīng)體系中（0.6 mol/L硫酸，28 mmol/L磷酸鈉，4 mmol/L鉬酸銨），95 ℃水浴90 min。冷卻至室溫，以試劑空白做參比，于695 nm處測吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品的測定：將1 mL酵素加入到反應(yīng)體系中，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線測定方法，計算總抗氧化能力。

1.4.3 還原性的測定

采用鐵氰化鉀還原法測定酵素的還原性[10]。在試管中加入2 mL酵素、2 mL磷酸緩沖液（0.2 mol/L，pH 6.6）及2 mL鐵氰化鉀（10 g/L），于50 ℃反應(yīng)20 min，加入2 mL三氯乙酸（0.1 g/mL），在3 000 r/min下離心10 min，立即取2 mL上清液，加入2 mL蒸餾水和0.4 mL三氯化鐵（1 g/L），在700 nm處測吸光度。吸光度越高，還原性越強(qiáng)。

1.4.4 脂肪酶活性的測定

采用滴定法測定酵素的脂肪酶活性[11]。取若干個錐形瓶，加入1 mL橄欖油與5 mL磷酸緩沖液（0.025 mol/L，pH 7.5）中，以不含橄欖油為空白，40 ℃水浴5 min。將1 mL稀釋20倍的酵素加入錐形瓶中，5 min后立即加入15 mL 95%的乙醇，酶反應(yīng)終止。在每個錐形瓶中加入3滴酚酞指示劑，用氫氧化鈉（0.05 mol/L）滴定至淡紅色，記錄消耗的NaOH的體積，按式（1）計算。

式中：X為樣品的脂肪酶活性，μmol/mL；V為滴定酵素時消耗NaOH體積，mL；V0為空白試驗消耗NaOH體積，mL；50為0.05 mol/L NaOH溶液1 mL相當(dāng)于脂肪酸50 μmol；n為酵素稀釋倍數(shù)；5為反應(yīng)時間5 min，以1 min計。

1.4.5 膽固醇酯酶活性抑制率的測定

膽固醇酯酶與對硝基苯基丁酸酯反應(yīng)，生成黃綠色產(chǎn)物，根據(jù)溶液的吸光度判斷樣品的抑制活性[11]。稱取5.844 g氯化鈉與2.77 g?；悄懰徕c，用磷酸鈉緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.0）定容至100 mL，分別取1 mL緩沖液加入4支試管中，加入10 μL對硝基苯基丁酸酯（0.2 mmol/L）。在空白管中加入50 μL酶液，空白對照管中既不加酶液，也不加酵素，抑制管中加入50 μL酶液與25 μL酵素，背景對照管加入25 μL酵素，分別在405 nm處測定吸光度，抑制率按式（2）計算。

式中：A為空白管的吸光度；B為空白對照管的吸光度；C為抑制管的吸光度；D為背景對照管的吸光度。

1.4.6 膽固醇膠束溶解度抑制率的測定

制備人體模擬膠束，加入酵素后，利用膽固醇試劑盒進(jìn)行測定[11]。分別稱取0.537 g牛磺膽酸鈉、0.077 g膽固醇、0.141 g油酸及0.771 g氯化鈉，用磷酸緩沖液（pH 7.4）定容至100 mL，利用超聲波均質(zhì)，37 ℃靜置12 h。將空白對照，100 μL酵素分別加入到4 mL膠束溶液中，37 ℃培養(yǎng)2 h，并在16 000 r/min下離心20 min，收集上清液用總膽固醇試劑盒測定膠束中膽固醇含量（mmol/L）。膽固醇的溶解度按式（3）計算，相應(yīng)的抑制率按式（4）計算。

式中：A為空白溶液的膽固醇溶解度，mmol/L；B為樣品溶液的膽固醇溶解度，mmol/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同配方食用果蔬酵素中蛋白酶活性的對比分析

采用L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)液繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.012x-0.000 2，R2=0.983，其中，y為吸光度，x為L-酪氨酸溶液質(zhì)量濃度（mg/L）。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，測得的不同配方食用酵素的蛋白酶活性見圖1。

圖1 不同配方食用果蔬酵素的蛋白酶活性

結(jié)果表明，由5種蔬菜和5種水果制備的酵素C的蛋白酶活性明顯高于其余配方的酵素，而由10種蔬菜制備的酵素A具有最低的蛋白酶活性。采用水果為原料，相較于以蔬菜為原料的酵素含有較多的糖類物質(zhì)與礦物質(zhì)，促進(jìn)酵素發(fā)酵過程中活性成分的產(chǎn)生。由20種果蔬制備的酵素D與E，果蔬種類較多，發(fā)酵較快，使酵素總酸提前下降，pH升高，蛋白酶活性降低[12]。酵素C果蔬種類適中，表現(xiàn)出較高的蛋白酶活性。

2.2 不同配方的食用果蔬酵素抗氧化性的對比分析

人類的衰老及心腦血管等疾病與各種活性氧和自由基有關(guān)[13]，因為人體內(nèi)過量的自由基可以造成DNA損傷、蛋白質(zhì)變性甚至是身體器官的病變[14]。

試驗采用鉬氨酸還原法，測定酵素的抗氧化活性。采用維生素C標(biāo)準(zhǔn)液繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.002 5x+0.167，R2=0.992，y為吸光度，x為維生素C溶液的質(zhì)量濃度（mg/mL）。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，測得的不同配方食用酵素的抗氧化活性見圖2。

圖2 不同配方食用果蔬酵素中的抗氧化性

結(jié)果表明，由5種蔬菜和5種水果制備的酵素C和10種水果制備的酵素B具有較高的抗氧化活性，且顯著高于其他配方酵素。果蔬中具有抗氧化作用的物質(zhì)主要有維生素C、維生素E、類胡蘿卜素及多酚類物質(zhì)等。在常見的幾十種蔬菜中，蓮藕表現(xiàn)最強(qiáng)的抗氧化性能，主要是其含有的多酚類物質(zhì)起作用[15-16]，胡蘿卜中含有較多的類胡蘿卜素。水果中甜橙含有較多的維生素C，葡萄的葡萄皮色素也具有優(yōu)良的抗氧化性，其抗氧化能力相當(dāng)于維生素C的98%以上，具有抗氧化性的主要成分可能是花青素與花色苷[17]。酵素C中含有具有較強(qiáng)抗氧化性能的果蔬，并且為混合發(fā)酵，相比于單一蔬菜與水果發(fā)酵的酵素A與B，多種類的抗氧化活性物質(zhì)共同作用使得酵素C表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗氧化性。酵素D雖然在酵素C原料的種類上多加10種蔬果，在發(fā)酵初期可能表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗氧化性，但因為種類過多，發(fā)酵速度過快，酚類物質(zhì)消耗也較快[18]，因此按照正常的6個月發(fā)酵時間后，其抗氧化能力不斷下降。酵素E的抗氧化性略低于酵素D，可能是因為酵素D中不含有抗氧化性最高的蔬菜蓮藕。

2.3 不同配方的食用果蔬酵素還原性的對比分析

試驗采用鐵氰化鉀還原法測定酵素的還原活性，在700 nm處測定不同配方酵素的吸光度，測量結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同配方的食用果蔬酵素中的還原性

結(jié)果表明，由純蔬菜制備的酵素A具有最低的還原活性，其他4種果蔬酵素還原活性沒有明顯差異。因水果中含有的還原性物質(zhì)較蔬菜中多[19]，酵素B、D、E均含有10種不同的水果，而酵素C中只含有5種不同水果，酵素A中不含水果，因此酵素B、D、E表現(xiàn)出更高的還原性。

2.4 不同配方的食用果蔬酵素降脂性能的對比分析

體外降脂性能主要由脂肪酶活性、膽固醇酯酶抑制率和膽固醇膠束溶解度抑制率進(jìn)行體現(xiàn)。膽固醇酯酶是催化膽固醇酯水解成膽固醇和脂肪酸的一種酶，抑制膽固醇酯酶的活性能夠減少部分膽固醇的生成，降低其生物利用度。進(jìn)入人體腸道內(nèi)的膽固醇需要溶解于膽固醇膠束內(nèi)才能被吸收，抑制膽固醇膠束溶解度就能有效抑制膽固醇的吸收，降低血液中膽固醇含量。不同配方食用果蔬酵素的降脂性能指標(biāo)結(jié)果見圖4～圖6。

從圖4可以看出，不同配方的酵素中脂肪酶活性大小依次為C＞D＞B＞E＞A，酵素C的脂肪酶活性最高，為160 μmol/mL，酵素A的脂肪酶活性最低，為40 μmol/mL。原花青素可以提高脂肪酶的活性，葡萄籽中的原花青素含量最高[20]，因此相比于酵素A、E，原料中均有葡萄籽的酵素B、C、D的脂肪酶活性較高。相比于只含有水果的酵素B，酵素C和酵素D的原料同時含有蔬菜與水果，天然有益微生物種類多，因此脂肪酶活性較高。酵素E的脂肪酶活性僅高于酵素A，表明消化性蔬果并不能提高酵素的脂肪酶活性。

圖4 不同配方的食用果蔬酵素的脂肪酶活性

圖5可見，不同配方的酵素的膽固醇酯酶活性抑制率大小依次為D＞C＞E＞B＞A。槲皮素對膽固醇酯酶具有較強(qiáng)的抑制作用[11]，含有槲皮素較高的水果有橙子、橘子、葡萄和香蕉等。蔬菜中蓮藕含有的槲皮素最高，并且百合科蔥屬及十字花科蔬菜也含有較高的槲皮素[21]，其中，洋蔥所含有的槲皮素僅次于蓮藕。酵素D的果蔬種類多，且原料中含有具有較高槲皮素的多種果蔬，因此酵素D的膽固醇酯酶活性抑制率最高。酵素E中不含有蓮藕、洋蔥和葡萄等，因此相對于酵素C，其膽固醇酯酶活性抑制率較低。酵素A與酵素B均屬于單一種類果蔬發(fā)酵，膽固醇酯酶活性抑制率較低。

圖5 不同配方的食用果蔬酵素的膽固醇酯酶活性抑制率

圖6為不同配方酵素的膽固醇膠束溶解度抑制率結(jié)果，不同配方的酵素的膽固醇膠束溶解度抑制率大小依次為D＞E＞C＞B＞A。5種酵素的膽固醇膠束溶解度抑制率與膽固醇酯酶活性抑制率大小比較相似。可能是因為槲皮素也可以降低膽固醇膠束溶解度。此外，植物甾醇對膽固醇膠束溶解度也有一定的抑制作用[11]，酵素E中含有梨、芒果、香蕉、獼猴桃、綠豆芽、韭菜、芹菜等含有較高植物甾醇的果蔬[22]，因此酵素E的膽固醇膠束溶解度抑制率較高于酵素C。

圖6 不同配方的食用果蔬酵素的膽固醇膠束溶解度抑制率

通過分析不同配方食用果蔬酵素的降脂性能，發(fā)現(xiàn)蔬菜和水果為原料的食用酵素（C和D）具有較高的脂肪酶活性，較好的膽固醇酯酶活性抑制作用與膽固醇膠束溶解度抑制作用。較高的脂肪酶活性，可將食物中的油脂分解成甘油與脂肪酸；通過抑制膽固醇酯酶活性，抑制體內(nèi)膽固醇的生成；通過降低膽固醇膠束溶解度，降低人體對膽固醇的吸收，在源頭與過程中減少血液中膽固醇含量，達(dá)到降血脂的效果。因此，食用果蔬酵素是潛力巨大的降脂飲品，可用于降脂性能產(chǎn)品的開發(fā)應(yīng)用。

3 結(jié)論

試驗發(fā)現(xiàn)酵素活性受發(fā)酵原料種類的多樣性及成分的影響，如多酚類物質(zhì)影響抗氧化性、原花青素影響脂肪酶活性、槲皮素和植物甾醇影響膽固醇酶活性及膽固醇膠束溶解度的抑制率。食用果蔬酵素具有降脂性能較，酵素產(chǎn)品在降血脂、降血糖等方面具有較大的研究前景與廣闊的市場。