李悅，張?jiān)凭辏w葉，章金龍，宋志姣*

1.保山學(xué)院資源環(huán)境學(xué)院（保山 678000）；2.云南省高校怒江河谷生物質(zhì)資源高值轉(zhuǎn)化與利用重點(diǎn)試驗(yàn)室（保山 678000）

獼猴桃（Actinidia chinensis Planch）含有豐富的維生素C、果糖、果酸和酚類物質(zhì)，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值[1]。經(jīng)常食用獼猴桃，可以降低血液中膽固醇，防治心血管疾病。其所含有的SOD酶，具有出眾的抗氧化性能，可以消除皺紋和細(xì)紋。此外，獼猴桃中的維生素C和維生素E還能夠促進(jìn)人體對(duì)糖分的吸收，提高抵抗力[2]。葡萄（Vitis vinifera L）含有較多葡萄糖、B族維生素、維生素C、礦物質(zhì)以及多種人體所需的氨基酸。鮮葡萄中的多種果酸有助于消化，黃酮類物質(zhì)能防止形成膽固醇斑塊。此外，葡萄籽中富含的原青花素能清除人體內(nèi)有毒的自由基，保護(hù)人體細(xì)胞組織免受自由基的氧化損傷，具有輔助降低心腦血管疾病發(fā)生、防輻射、美白祛斑等功效[3]。獼猴桃及葡萄均是進(jìn)行果蔬深加工的良好原料。

酵素是用一種或多種新鮮水果、蔬菜等為原料，經(jīng)多種有益微生物發(fā)酵的一種含有酶、礦物質(zhì)和次生代謝產(chǎn)物等多種生物活性物質(zhì)的功能性微生物發(fā)酵液體或固體[4]，因其具有抗氧化、美容養(yǎng)顏、減肥瘦身、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等多種保健功效，加之水果蔬菜氣味芬芳，香氣宜人，果蔬類酵素在年輕消費(fèi)人群中備受青睞，并有添加酵素的保健食品和面膜等副產(chǎn)品問世，現(xiàn)階段酵素產(chǎn)品已實(shí)現(xiàn)商業(yè)化，在國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)的發(fā)展空間廣闊[5-7]。

研究以獼猴桃和葡萄為原料發(fā)酵水果酵素，通過測(cè)定酵素自然發(fā)酵過程中pH、總酸、總酚、維生素C含量變化來分析發(fā)酵過程中活性成分的變化；以DPPH自由基清除率、羥基自由基清除率和還原力為抗氧化性指標(biāo)，評(píng)價(jià)獼猴桃葡萄酵素的抗氧化活性，為水果酵素的綜合開發(fā)利用提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄、獼猴桃、白砂糖、檸檬，購(gòu)于保山市紅葉超市；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼/DPPH（上海阿拉丁生化科技有限公司）；氫氧化鈉、鐵氰化鉀、3,5-二硝基水楊酸（廣州化學(xué)試劑廠）；抗壞血酸、硫酸亞鐵、碳酸氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、碳酸鈉（北京化學(xué)試劑公司）；三氯化鐵（合肥巴斯夫生物科技有限公司）；2,6-二氯靛酚（上海展云化工有限公司）；鄰苯二甲酸氫鉀、三氯乙酸、無水乙醇、沒食子酸（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）。

1.2 設(shè)備與儀器

UV-2600紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；HH-4恒溫水浴鍋（常州國(guó)華電器有限公司）；PHS-3C pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器有限公公司）；1DL 5A離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；SW CJ 1D單人雙面無菌操作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 獼猴桃葡萄酵素的制備

純凈水對(duì)新鮮獼猴桃、葡萄及檸檬簡(jiǎn)單沖洗以除去表面灰塵，在無菌操作臺(tái)中晾干表皮水分，獼猴桃去皮切片、葡萄保留完整，檸檬切片，白砂糖用紫外燈殺菌30 min后備用。獼猴桃、葡萄與白砂糖按質(zhì)量比1∶1∶1的比例加入到已消毒的玻璃發(fā)酵罐中，按照一層獼猴桃、一層葡萄、一層糖的順序鋪到罐子八分滿，底層和最后一層鋪上檸檬。在25±2 ℃恒溫箱中發(fā)酵49 d，pH穩(wěn)定于3～3.5之間判斷發(fā)酵結(jié)束。

1.3.2 樣品液的制備

在整個(gè)發(fā)酵過程中，每隔7 d取樣一次進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測(cè)定。樣品的制備：取20 mL酵素原液，按3 500 r/min離心10 min，取上清液得到樣品。

1.3.3 理化指標(biāo)的測(cè)定

pH的測(cè)定：按參考文獻(xiàn)[8]GB/T 10468規(guī)定的方法測(cè)定；總酸的測(cè)定：參照參考文獻(xiàn)[9]GB 12456食品中總酸的測(cè)定。

1.3.4 功效成分的測(cè)定

1.3.4.1 總酚含量的測(cè)定

參考李飛等[10]方法，取1 mL酵素樣品，用超純水稀釋至10 mL得到待測(cè)液，取0.5 mL待測(cè)液加入到0.5 mL 50%的福林酚試劑中，充分混勻后靜置2 min，再加入1.5 mL 20%的碳酸鈉溶液，混勻，常溫避光靜置1 h后在760 nm處測(cè)定其吸光度，平行測(cè)定3次。用超純水做空白對(duì)照，以沒食子酸等價(jià)物來表示。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程y=0.082 0 x+0.003 5（R2=0.999 3）。

1.3.4.2 維生素C含量的測(cè)定

參照參考文獻(xiàn)[11]《GB 5009.86食品中抗壞血酸的測(cè)定》2,6-二氯靛酚滴定法。

1.3.5 抗氧化活性分析

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力[12]

取1 mL酵素樣品液，用超純水稀釋至10 mL得待測(cè)液。取2 mL待測(cè)液，加入2 mL的2×10-4mol/L的DPPH乙醇溶液，用超純水稀釋到20 mL，混勻避光放置30 min，在波長(zhǎng)517 nm條件下，測(cè)定其吸光度。以0.01 mg/mL的維生素C作對(duì)比。DPPH清除率按式（1）計(jì)算。

式中：A1為待測(cè)液吸光度；A2為乙醇溶液替代DPPH溶液的吸光度；A3為乙醇溶液替代待測(cè)液的吸光度。

1.3.5.2 羥基自由基清除率[13]

取1 mL酵素樣品，用超純水稀釋至10 mL得到待測(cè)液。取2 mL待測(cè)液，加入2 mL 6 mmol/L的硫酸亞鐵溶液和2 mL 6 mmol/L過氧化氫溶液，用超純水稀釋到20 mL，混勻后靜置10 min，再加入2 mL的6 mmol/L的水楊酸溶液，混勻置于37 ℃恒溫水浴鍋中恒溫30 min后，在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定其吸光度。以0.01 mg/mL的維生素C作對(duì)比。羥基自由基清除率按式（2）計(jì)算。

式中：A1為樣品液吸光度；A2為蒸餾水代替水楊酸的吸光度（對(duì)照）；A3為蒸餾水替換待測(cè)液的吸光度（空白）。

1.3.5.3 還原力的測(cè)定

采用鐵氰化鉀還原法[14]，取1 mL酵素樣品，用超純水稀釋至10 mL得到待測(cè)液。取0.5 mL待測(cè)液，加入2.5 mL pH 6.6的磷酸緩沖液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的鐵氰化鉀溶液2.5 mL，充分混勻后在50 ℃水浴鍋中反應(yīng)30 min，冷卻，再加入2.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的三氯乙酸，充分混勻，加入0.5 mL三氯化鐵，用超純水在試管中稀釋到20 mL，靜置5 min后在波長(zhǎng)700 nm處測(cè)定吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵素發(fā)酵過程中理化指標(biāo)的測(cè)定

2.1.1 酵素發(fā)酵過程中pH的變化

pH的動(dòng)態(tài)變化在一定程度上能反映發(fā)酵過程是否正常。由圖1可知：發(fā)酵液pH在7 d內(nèi)從起始pH 4.71降到3.40，表明酵素前期發(fā)酵非常迅速，主要是乳酸菌發(fā)酵導(dǎo)致發(fā)酵液中有機(jī)酸急劇增加所致；7 d后pH在3.4上下小范圍波動(dòng)，這可能是發(fā)酵進(jìn)入穩(wěn)定期，其次菌體在生長(zhǎng)和代謝過程中產(chǎn)生大量CO2，CO2在水溶液中溶解度不穩(wěn)定，產(chǎn)生的HCO3-可從有機(jī)酸結(jié)合H+，從而防止氫離子濃度進(jìn)一步升高，使發(fā)酵液具有一定緩沖能力[15]。

圖1 酵素發(fā)酵過程中pH的變化

2.1.2 酵素發(fā)酵過程中總酸含量的變化

酸度是衡量酵素發(fā)酵成熟度和發(fā)酵液品質(zhì)的重要理化指標(biāo)[16]。由圖2可知，總酸含量從0.07 g/L上升至0.13 g/L，前三周增長(zhǎng)較快，這可能是因?yàn)樵诖似陂g環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，有利于一些產(chǎn)酸微生物大量繁殖，從而產(chǎn)生大量的乳酸、醋酸等次生代謝產(chǎn)物[12]。過后增長(zhǎng)有小幅波動(dòng)后趨于平穩(wěn)，可能是因?yàn)榘l(fā)酵液中糖類物質(zhì)的消耗，部分微生物開始利用有機(jī)酸作為碳源，從而使得總酸含量下降，發(fā)酵后期乳酸菌繼續(xù)進(jìn)行發(fā)酵，將多元酸轉(zhuǎn)變成一元酸，抑制總酸上升的趨勢(shì)[17]。

圖2 發(fā)酵過程中總酸含量的變化

2.2 酵素發(fā)酵過程中功效成分的測(cè)定

2.2.1 酵素發(fā)酵過程中總酚含量的變化

酵素發(fā)酵過程中總酚含量變化如圖3所示?？偡邮侵笜右褐兴械姆宇愇镔|(zhì)，是絕大多數(shù)具有抗氧化活性物質(zhì)的總稱。通過測(cè)定總酚含量，可判斷出抗氧化性的變化趨勢(shì)[18]。酵素在發(fā)酵過程中總酚含量總體呈上升趨勢(shì)，第4周和第5周有小幅下降，發(fā)酵后期總酚含量達(dá)24.96 mg/mL，相較發(fā)酵前提高19.7%。猜測(cè)總酚含量的增加原因有二：一是總酚含量增加的原因是微生物把龐雜的酚類物質(zhì)變換成了簡(jiǎn)單的酚類物質(zhì)[19]；二是發(fā)酵過程中部分酚類物質(zhì)的持續(xù)溶出，使總酚含量逐步增加[20]。21～35 d出現(xiàn)總酚含量下降，可能是酚類物質(zhì)被微生物分解成小分子物質(zhì)，發(fā)生降解反應(yīng)引起的[5]，這可能與微生物對(duì)多種構(gòu)型多酚的轉(zhuǎn)化有關(guān)，多酚組分含量的變化會(huì)影響酵素的抗氧化酚類物質(zhì)含量的變化，會(huì)相應(yīng)增強(qiáng)酵素的抗氧化活性[21]。

圖3 酵素發(fā)酵過程中總酚含量變化

2.2.2 酵素發(fā)酵過程中維生素C含量的變化

由圖4可知，由于新鮮的獼猴桃和葡萄含有大量維生素C，故發(fā)酵第一天維生素C含量高達(dá)82.8 mg/100 mL。隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，維生素C含量一直呈下降趨勢(shì)，發(fā)酵第2周和第3周下降幅度較大，分析原因可能是由于微生物的相關(guān)活動(dòng)和利用，另外，雖然酵素的酸性環(huán)境能保護(hù)其穩(wěn)定性，但維生素C作為強(qiáng)還原性物質(zhì)會(huì)有不同程度的流失[22]。發(fā)酵至49 d時(shí)維生素C含量?jī)H有33.2 mg/100 mL，發(fā)酵前后下降61.1%。

圖4 發(fā)酵過程中維生素C含量的變化

2.3 抗氧化活性測(cè)定

2.3.1 酵素發(fā)酵過程中DPPH自由基清除能力的變化

DPPH自由基被廣泛運(yùn)用于評(píng)價(jià)短時(shí)間內(nèi)的抗氧化活性[23]。由圖5可知，酵素對(duì)DPPH自由基清除率變化趨勢(shì)為波動(dòng)中逐漸增大，發(fā)酵至49 d時(shí)清除率為77.55%，但相較于0.01 mg/mL維生素C對(duì)DPPH自由基清除率（92.71%）仍有一定差距。分析原因可能是發(fā)酵初期酚類物質(zhì)少，而維生素C含量較高。維生素C能顯著清除自由基，但在發(fā)酵過程中維生素C含量不斷減少，DPPH自由基清除率出現(xiàn)了短時(shí)間的下降，發(fā)酵后期總酚含量增加，而維生素C含量不斷下降，此時(shí)DPPH自由基清除率主要受總酚含量影響。研究表明酚類物質(zhì)能給出一個(gè)氫離子并通過共振雜化而穩(wěn)定，具有高自由基清除能力[24]，這也基本符合試驗(yàn)DPPH自由基清除率在一定程度上隨著總酚含量變化而產(chǎn)生相應(yīng)波動(dòng)的規(guī)律。

圖5 發(fā)酵過程中DPPH自由基清除率的變化

2.3.2 酵素發(fā)酵過程中羥基自由基清除能力的變化

羥基自由基屬活性氧中的一種，在體內(nèi)可與金屬離子發(fā)生氧化，使金屬離子形成高氧化態(tài)，可損害機(jī)體細(xì)胞，進(jìn)而引發(fā)慢性病以及衰老等疾病[25]。由圖6可知，酵素對(duì)羥基自由基的清除率總體呈平穩(wěn)上升的趨勢(shì)。發(fā)酵至49 d時(shí)清除率為63.65%，接近0.01 mg/mL維生素C對(duì)羥基自由基清除率（65.69%）。發(fā)酵中期清除率增幅較大，可能是發(fā)酵過程中產(chǎn)生SOD、多酚、皂苷和多糖等具抗氧化活性物質(zhì)[26]。

圖6 酵素發(fā)酵過程中羥基自由基清除率的變化

2.3.3 酵素發(fā)酵過程中還原力的變化

一種物質(zhì)還原能力的大小直接反應(yīng)其抗氧化活性的大小。由圖7可知，獼猴桃葡萄酵素的還原力總體呈上升趨勢(shì)，之后緩慢下降。第35天時(shí)達(dá)到0.246，發(fā)酵第49天時(shí)，由最初的0.206上升到0.239，接近0.01 mg/mL維生素C的還原力（0.253），說明隨著發(fā)酵的進(jìn)行發(fā)酵液中抗氧化成分逐漸增加。

圖7 酵素發(fā)酵過程中還原力的變化

2.4 總酚含量、與抗氧化能力參數(shù)相關(guān)性分析

利用SPSS 17軟件，對(duì)發(fā)酵過程中總酚含量與其抗氧化能力參數(shù)的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果見表1。

表1 總酚含量與抗氧化活性的相關(guān)性

從表1可知，總酚含量與DPPH清除率、羥基自由基清除率、還原力的相關(guān)系數(shù)分別為0.875，0.923和0.804，且一般認(rèn)為相關(guān)系數(shù)（r）在0.8～1.0之間是極強(qiáng)相關(guān)，r在0.6～0.8之間是強(qiáng)相關(guān)，0.4～0.6之間是中等程度相關(guān)，r在0.2～0.4之間是弱相關(guān)。說明總酚含量與DPPH清除率、羥基自由基清除率、還原力之間存在極強(qiáng)的正相關(guān)性（P＜0.01）。

3 結(jié)論

文章以獼猴桃和葡萄為原料，通過自然發(fā)酵制備酵素，監(jiān)測(cè)發(fā)酵過程中各理化指標(biāo)及體外抗氧化能力的變化，并進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果表明，發(fā)酵過程中pH和維生素C持續(xù)降低，總酸、總酚呈波動(dòng)式上升趨勢(shì)；抗氧化活性（DPPH自由基清除率、羥自由基清除率和還原力）總體呈現(xiàn)持續(xù)增長(zhǎng)趨勢(shì)并于發(fā)酵后期達(dá)穩(wěn)定狀態(tài)，其中羥自由基清除率和還原力與0.01 mg/mL維生素C表現(xiàn)接近，DPPH自由基清除率與對(duì)照仍有一定差距。功能成分與抗氧化能力參數(shù)相關(guān)性表明，總酚含量與DPPH清除率、羥基自由基清除率、還原力之間均存在極顯著正相關(guān)性（P＜0.01）。綜上所述，發(fā)酵能促進(jìn)體系中物質(zhì)轉(zhuǎn)換和活性物質(zhì)生成，從而提升酵素的品質(zhì)，研究結(jié)果可為獼猴桃葡萄酵素的發(fā)酵機(jī)理以及產(chǎn)品的綜合開發(fā)利用提供一定的理論參考。