王慧慧，方惟希，王 鐸，劉 藝，李詠琪，李幸蓉，陳子健，葉長(zhǎng)江，孫恩濤

(皖南醫(yī)學(xué)院 1.臨床醫(yī)學(xué)院;2.檢驗(yàn)學(xué)院，安徽 蕪湖 241002)

粉塵螨(Dermatophagoidesfarinae)屬無(wú)氣門(mén)股、麥?zhǔn)瞅?，生境廣泛，常孳生于房舍灰塵、空調(diào)隔塵網(wǎng)、面粉、飼料和中藥材等房舍和儲(chǔ)藏物。粉塵螨是引起過(guò)敏性疾病最主要的吸入性過(guò)敏原之一[1-2]。有效控制環(huán)境中的塵螨數(shù)量，對(duì)預(yù)防和治療過(guò)敏性疾病有積極作用[1-4]。研究粉塵螨種群遺傳變異，可為有效制定粉塵螨防控策略提供數(shù)據(jù)支持。

微衛(wèi)星標(biāo)記是以重復(fù)單位(1～6 bp)的核苷酸序列首尾相連為核心序列，由于基本核心序列的重復(fù)次數(shù)不同，因而存在多態(tài)性。微衛(wèi)星標(biāo)記兩端的序列保守，可用于設(shè)計(jì)特異性引物。微衛(wèi)星標(biāo)記具有數(shù)量豐富，在基因組中分布廣，多態(tài)性豐富，呈孟德?tīng)柟诧@性，檢測(cè)快速方便等優(yōu)點(diǎn)，常用于評(píng)估物種的遺傳多樣性和遺傳分化、構(gòu)建基因組連鎖圖譜等。目前，微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)廣泛應(yīng)用于螨類研究，但關(guān)于螨類微衛(wèi)星的報(bào)道多集中于農(nóng)業(yè)螨類，塵螨微衛(wèi)星相關(guān)報(bào)道較少。本研究應(yīng)用二代測(cè)序技術(shù)開(kāi)發(fā)粉塵螨多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)并設(shè)計(jì)引物，以期為粉塵螨種群遺傳變異研究提供更多的分子標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 樣本采集與鑒定 樣本采自安徽省蕪湖市某校宿舍內(nèi)，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定為粉塵螨后，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)。同時(shí)，收集不同生境種群的單個(gè)粉塵螨，75%乙醇固定，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 提取DNA 挑選1 000只粉塵螨，使用酚氯仿法提取基因組DNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性，紫外分光光度計(jì)(NanoDrop 2000)檢測(cè)DNA的純度和濃度。粉塵螨基因組DNA檢測(cè)合格后，送上海美吉生物公司進(jìn)行高通量測(cè)序。同時(shí)，經(jīng)STE法提取單只粉塵螨DNA。

1.3 高通量測(cè)序 采用Illumina HiSeqTM平臺(tái)對(duì)本研究提取的粉塵螨基因組DNA進(jìn)行測(cè)序，以NCBI現(xiàn)有的粉塵螨全基因組序列https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/9138為參考基因，用BWA軟件將測(cè)序所得數(shù)據(jù)比對(duì)到參考基因上，最后經(jīng)GATK的BestPractices流程校正[5]，獲得完整粉塵螨全基因組序列。

1.4 微衛(wèi)星位點(diǎn)篩選與引物設(shè)計(jì) 采用MISA(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html)篩選出重復(fù)次數(shù)12次以上的單核苷酸、重復(fù)6次以上的二核苷酸、重復(fù)5次以上的三或四核苷酸微衛(wèi)星標(biāo)記，建立粉塵螨基因組的微衛(wèi)星文庫(kù)。根據(jù)多樣本基因組高通量測(cè)序數(shù)據(jù)，從微衛(wèi)星文庫(kù)中篩選出等位基因大于3的微衛(wèi)星位點(diǎn)。最后，針對(duì)篩選出的粉塵螨微衛(wèi)星位點(diǎn)，通過(guò)Primer5設(shè)計(jì)微衛(wèi)星引物。

1.5 粉塵螨微衛(wèi)星標(biāo)記引物的篩選 將上述引物溶解稀釋至0.1 μm，進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證。PCR循環(huán)設(shè)置條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，使用溫度梯度(51℃、54℃、57℃、60℃)測(cè)試最佳退火溫度，72℃延伸1 min 30 s，循環(huán)34次，72℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠篩選出PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度符合預(yù)期，條帶單一的引物同時(shí)依據(jù)條帶質(zhì)量確定退火溫度。對(duì)通過(guò)篩選的引物進(jìn)行熒光引物設(shè)計(jì)，每對(duì)引物上游5′端用熒光染料進(jìn)行標(biāo)記，隨后對(duì)從房舍和儲(chǔ)藏環(huán)境中獲取的3個(gè)種群共15只粉塵螨樣本DNA進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)由1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后,送至安徽通用生物系統(tǒng)有限公司進(jìn)行毛細(xì)管電泳分型。

1.6 種群遺傳學(xué)分析 以15只粉塵螨個(gè)體的基因組DNA為模板，對(duì)1篩選的微衛(wèi)星標(biāo)記的種群遺傳學(xué)特征進(jìn)行評(píng)價(jià)。通過(guò)GeneMarker 2.2軟件讀取分析每個(gè)個(gè)體每個(gè)位點(diǎn)的等位基因長(zhǎng)度,使用Excel對(duì)熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳結(jié)果進(jìn)行匯總。使用GenAlEx 6.502計(jì)算粉塵螨的等位基因數(shù)Na、有效等位基因數(shù)Ne、觀測(cè)雜合度Ho、期望雜合度He、香農(nóng)指數(shù)I。利用Cervus 3.0程序分析多態(tài)性信息含量PIC。

2 結(jié)果

2.1 粉塵螨微衛(wèi)星序列組成及相關(guān)特征 Illumina測(cè)序平臺(tái)共返還6 635 622條高質(zhì)量的Reads。通過(guò)MISA軟件的篩選，共篩選出266個(gè)候選微衛(wèi)星標(biāo)記。其中，三核苷酸最多，共計(jì)118條，占總數(shù)量的44.36%，其次是單核苷酸，共計(jì)98條，占總數(shù)量的36.84%，二核苷酸重復(fù)共計(jì)43條，占16.17%，四核苷酸重復(fù)共計(jì)7條，占2.64%。

微衛(wèi)星標(biāo)記重復(fù)單元類型顯示，單核苷酸僅有A/T重復(fù)單元，共98個(gè)。二核苷酸一共有TC/GA、AT/AT、AC/GT 3種類型，其中AC/GT占二核苷酸重復(fù)總數(shù)的74.42%，是出現(xiàn)頻率最高的二核苷酸序列，其次是AT/AT(13.95%)。三核苷酸的種類最多，ATG/CAT重復(fù)的數(shù)量最多，占三核苷酸重復(fù)總數(shù)的50%，GTT/AAC的重復(fù)數(shù)量次之(33.86%)，AAT/ATT占11.86%，CTG/CAG占3.39%，TCG/CGA與TGG/CAA均只有1個(gè)，各占0.85%。在四核苷酸重復(fù)中，TTCA/TGAA數(shù)量最多，但僅有3個(gè)，占四核苷酸總重復(fù)數(shù)量的28.57%。其次，ATTG/CAAT為2個(gè)，占28.57%，TTTG/CAAA和TTTC/GAAA均只有1個(gè)，各占14.29%。在粉塵螨微衛(wèi)星位點(diǎn)中，A/T重復(fù)出現(xiàn)次數(shù)最多，其次是ATG/CAT。

2.2 微衛(wèi)星引物的篩選 共有22對(duì)引物在退火溫度為60℃時(shí)，擴(kuò)增出單一目的片段。用上述22對(duì)微衛(wèi)星引物對(duì)15個(gè)單只粉塵螨DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物通過(guò)毛細(xì)管電泳檢測(cè)。用GeneMarker 2.2對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，由于檢測(cè)數(shù)據(jù)和結(jié)果較多，在此選取Df 01位點(diǎn)的2個(gè)樣本的系列圖峰作為示例描述(圖1)。2個(gè)粉塵螨樣本在Df 01處有3個(gè)等位基因，其中，一個(gè)樣本為雜合子，另一個(gè)為純合子。使用Excel對(duì)熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳結(jié)果進(jìn)行匯總，用GenAlEx 6.502、Cervus 3.0分析發(fā)現(xiàn)，22對(duì)微衛(wèi)星引物中有12個(gè)顯示出較高的多態(tài)性，可進(jìn)一步用于粉塵螨遺傳多樣性分析(表1)。

圖1 粉塵螨不同個(gè)體在微衛(wèi)星位點(diǎn)Df 01的毛細(xì)管電泳

表1 粉塵螨12個(gè)微衛(wèi)星引物序列及位點(diǎn)信息

2.3 微衛(wèi)星標(biāo)記的種群遺傳學(xué)評(píng)價(jià) 用篩選出的12對(duì)引物對(duì)3個(gè)種群15只粉塵螨樣本進(jìn)行擴(kuò)增，共檢測(cè)到66個(gè)等位基因，微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳多樣性參數(shù)分析顯示，12個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)Na為3～9，平均為5.5±1.893。各位點(diǎn)有效等位基因數(shù)Ne為1.411～4.840，平均為3.150±1.204。觀測(cè)雜合度Ho為0.133～0.800，平均為0.495±0.213，期望雜合度He為0.291～0.793，平均為0.618±0.176。各位點(diǎn)的香農(nóng)指數(shù)I為0.563～1.807，平均為1.267±0.428。Df 08香農(nóng)信息指數(shù)最大，為1.807；Df 10香農(nóng)信息指數(shù)最小，為0.563。本研究中所篩選的微衛(wèi)星位點(diǎn)多態(tài)信息含量為0.271～0.765，平均為0.581±0.176，多態(tài)信息含量最高的是Df 08，最低的是Df 10(表2)。

表2 12個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的種群遺傳學(xué)參數(shù)

3 討論

微衛(wèi)星標(biāo)記是目前被廣泛認(rèn)可和使用的遺傳標(biāo)記之一，應(yīng)用于分子遺傳學(xué)與進(jìn)化生物學(xué)等方面[6-7]。微衛(wèi)星標(biāo)記的獲取主要基于二代測(cè)序技術(shù)的全基因組篩選法、基因組富集文庫(kù)法、近緣雜交擴(kuò)增法、AFLP、ISSR、RAPD等方法[8-10]。傳統(tǒng)的開(kāi)發(fā)引物方法大多費(fèi)時(shí)費(fèi)力，基于二代測(cè)序及毛細(xì)管電泳技術(shù)的微衛(wèi)星引物開(kāi)發(fā)方法具有效率高、速度快、成本低等特點(diǎn)[11]。賈浩源等[12]基于二代測(cè)序技術(shù)獲取腐食酪螨轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，提高了微衛(wèi)星標(biāo)記的開(kāi)發(fā)效率。本研究基于NCBI上的粉塵螨全基因組序列，用Illumina HiSeqTM平臺(tái)高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行重新測(cè)序，比對(duì)原有序列后用MISA軟件查找和篩選出位點(diǎn)。其次，根據(jù)多個(gè)樣本基因組高通量測(cè)序數(shù)據(jù)，篩選多態(tài)性高的位點(diǎn)，顯著提升了微衛(wèi)星標(biāo)記的開(kāi)發(fā)效率。最后，利用高效毛細(xì)管電泳技術(shù)對(duì)位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行驗(yàn)證。

本研究中的粉塵螨完整型微衛(wèi)星中，三堿基微衛(wèi)星分布數(shù)目最多，這與已報(bào)道的柑橘全爪螨和Phytoseiulusmacropilis的優(yōu)勢(shì)堿基類型不同，且Phytoseiulusmacropilis微衛(wèi)星標(biāo)記中二核苷酸重復(fù)的占比最多，其次為四、三、五核苷酸重復(fù)[13-14]。由于不同物種的優(yōu)勢(shì)微衛(wèi)星類型各不相同，因此，不同物種的微衛(wèi)星既存在基因組間的進(jìn)化現(xiàn)象，也可能存在一定的保守現(xiàn)象[15]。

本研究篩選出266個(gè)SSR位點(diǎn)，再對(duì)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，經(jīng)PCR驗(yàn)證與熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳，最終獲取了12對(duì)具有多態(tài)性、擴(kuò)增穩(wěn)定、條帶清晰單一的粉塵螨微衛(wèi)星引物。12對(duì)多態(tài)性引物大小為20～25 bp，退火溫度為60℃時(shí)，均可擴(kuò)增出目的片段，片段長(zhǎng)度約為166～276 bp，符合微衛(wèi)星引物的設(shè)計(jì)原則[16]。

本研究中微衛(wèi)星標(biāo)記多態(tài)信息含量為0.271～0.765，這與Sun等[17]開(kāi)發(fā)的15對(duì)柑橘全爪螨多態(tài)性微衛(wèi)星引物的多態(tài)性信息含量相近。根據(jù)Botsetin等[18]對(duì)多態(tài)信息含量的量度規(guī)定，12個(gè)具多態(tài)性的微衛(wèi)星位點(diǎn)中有8個(gè)屬于高度多態(tài)性位點(diǎn)，4個(gè)屬于中度多態(tài)性位點(diǎn)。因此，本研究的12對(duì)粉塵螨微衛(wèi)星引物位點(diǎn)均具有良好的多態(tài)性，可為粉塵螨的遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)分析提供高效的微衛(wèi)星標(biāo)記。