何非，盧浩成，程彬皓，蘭義賓，段長青

（中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院葡萄與葡萄酒研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部葡萄酒加工重點試驗室，北京 100083）

香氣是葡萄酒感官品質(zhì)最為重要的指標之一，對消費者的選購和飲用有著重要的影響[1]。隨著檢測技術的進步，目前葡萄酒中檢測到1,300 余種香氣物質(zhì)[2]。一般而言，葡萄酒的香氣物質(zhì)按其來源主要分為三類：一是來源于葡萄果實原料的香氣，可以稱之為品種香或一類香氣；二是來源于發(fā)酵過程中由微生物作用產(chǎn)生的香氣，可以稱之為發(fā)酵香或二類香氣；三是與陳釀過程相關的陳釀香氣，可以稱之為陳釀香或三類香氣[3]。在優(yōu)質(zhì)的葡萄酒中，這三類香氣應具有平衡、圓融、和諧的狀態(tài)[1]。

橡木桶陳釀是葡萄酒釀造中較為常用的釀造技術。在陳釀過程中，一方面存在著葡萄酒與橡木桶之間的物質(zhì)交換，一方面也伴隨著葡萄酒自身物質(zhì)之間的相互作用與轉(zhuǎn)變[4-6]。就橡木桶本身而言，其對葡萄酒的貢獻也受自身產(chǎn)地、樹種、紋理、烘烤度等諸多因素的影響[6]。目前較為常用橡木樹種包括美國的白橡（Q.alba）和法國的夏櫟（Q.robur）和巖生櫟（Q.petraea）。隨著葡萄酒行業(yè)的發(fā)展，對橡木資源的需求量不斷增加，而美國和法國橡木由于資源有限，價格日益昂貴，其使用受到了越來越多的限制。近幾年來自于東歐，特別是匈牙利和斯洛伐克等地的橡木得到了更多的使用和研究，來自于南歐西班牙的橡木桶和橡木制品也備受關注。

在橡木桶陳釀過程中，葡萄酒中含有的香氣物質(zhì)的組成不斷發(fā)生變化。這些變化主要包括兩個方面，一是原本存在與葡萄酒中的葡萄酒自身香氣物質(zhì)隨著陳釀時間的延長發(fā)生分解或者轉(zhuǎn)化，二是在陳釀過程中橡木桶中存在的香氣物質(zhì)進入葡萄酒中并發(fā)生轉(zhuǎn)化。氣味活性值（Odor Active Value，OAV），也稱香氣值，是用來衡量葡萄酒中揮發(fā)性香氣物質(zhì)對葡萄酒潛在香氣貢獻的一個指標，其基本概念在于葡萄酒中某一香氣物質(zhì)的含量與其香氣閾值的比值，OAV 大于1則表明該香氣物質(zhì)會對葡萄酒的香氣構(gòu)成有著直接的貢獻，而一些OAV 小于1 的香氣物質(zhì)，也可能通過香氣物質(zhì)的協(xié)同作用對葡萄酒香氣的整體表現(xiàn)有所影響[7]。已有研究將葡萄酒中的香氣物質(zhì)按其具有的香氣特征分為13 組[8]，通過計算每組物質(zhì)的OAV 總和，可以模擬葡萄酒的香氣輪廓并分析不同類型香氣物質(zhì)對葡萄酒品質(zhì)的影響。

本研究以2013 年產(chǎn)自北京延慶的“美樂”（Vitis viniferaL.cv.‘Merlot’）干紅葡萄酒為試驗材料，分別在2 種不同烘烤度（輕度烘烤和中度烘烤）和3 種不同產(chǎn)地（美國、法國和斯洛伐克）共6 種橡木桶中進行為總計為期12 個月的陳釀，旨在探究不同類型的橡木桶為葡萄酒帶來的特定香氣特征，進而為不同類型橡木桶的選擇和使用，以及橡木陳釀的辨別提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒葡萄“美樂”，2013 年10 月采自北京市延慶區(qū)張山營鎮(zhèn)，葡萄果實采收時可溶性固形物24～25 °Brix，總酸為6～7 g/L（以酒石酸計），衛(wèi)生狀況良好。

葡萄除梗破碎后，入2 000 L 不銹鋼罐，裝載量為罐容的75%～80%，原料入罐的同時添加60 mg/L SO2，添加酵母啟動發(fā)酵，采用傳統(tǒng)干紅發(fā)酵工藝釀造，共計3 個平行。商業(yè)酵母Red Fruit（Enartis，意大利）的接種量0.2 g/L，發(fā)酵溫度24～26 ℃。酒精發(fā)酵結(jié)束后，人工接種乳酸菌LALVIN31（Lallemand，法國）啟動蘋果酸乳酸發(fā)酵，發(fā)酵溫度18～20 ℃。蘋果酸乳酸發(fā)酵結(jié)束后入橡木桶或不銹鋼桶陳釀。進入陳釀的“美樂”干紅葡萄酒酒精含量為14%V/V，殘?zhí)呛繛?.2 g/L（以葡萄糖計），總酸為5.30 g/L（以酒石酸計），揮發(fā)酸為0.35 g/L（以醋酸計）。

本研究使用的橡木桶共6 種類型。制作木桶的板材來自3 個產(chǎn)地：美國，法國和斯洛伐克。板材在各自原產(chǎn)地經(jīng)過24 個月自然風干后，運至中國山東省蓬萊市沃林橡木桶有限公司進行烘烤和制桶，桶型為波爾多式，桶容積均為225 L。每個產(chǎn)地的木料具有兩種烘烤度（輕度烘烤與中度烘烤），輕度烘烤以起始溫度為180 ℃持續(xù)10 min，上升至200 ℃持續(xù)20 min。中度烘烤以起始溫度為180 ℃持續(xù)10 min，上升至220 ℃持續(xù)35 min。來自3 個不銹鋼發(fā)酵罐的原酒經(jīng)充分混勻后，分別轉(zhuǎn)移到6 種225 L 橡木桶和1 種225 L 不銹鋼桶（對照）中進行滿桶陳釀。每種橡木桶及不銹鋼桶設2 個平行，共計14 桶。橡木陳釀溫度為16～18 ℃，相對濕度為75%。

取樣點為入桶前（陳釀0 個月）、陳釀3、9 和12個月，每個取樣點單個樣品取樣350 mL，并各設3 個平行，樣品置于-20 ℃冰箱儲存以備后續(xù)實驗所用。

4-甲基-2-戊醇、鄰-香草醛、3,4-二甲基苯酚、γ-己內(nèi)酯等香氣標準品均購自美國Sigma-Aldrich 公司，二氯甲烷、硫酸銨、無水硫酸鈉等分析純試劑和藥品均購自北京化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

JY10002 電子分析天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；TDL-5-A 低溫離心機，上海飛鴿儀器有限公司；SG3200HBT 超聲波清洗機，上海冠特超聲儀器有限公司；Agilent 6890 GC 氣相色譜、Agilent 5975 MS質(zhì)譜儀、HP-INNOWAX（60 m×0.25 mm×0.25 μm）毛細管柱，美國Agilent 公司；頂空固相微萃取裝置，美國Supelco 公司。

1.3 實驗方法

分別采用頂空固相微萃取（HS-SPME）和液液萃?。↙LE）兩種方法萃取樣品葡萄酒中的香氣物質(zhì)。

1.3.1 HS-SPME-GC-MS 分析

準確稱（量）取1 g 氯化鈉、5 mL 酒樣、10 μL 4-甲基-2-戊醇內(nèi)標物（4M2P，1.038 8 g/L）加入20 mL帶有磁力轉(zhuǎn)子（1 cm）的樣品瓶中。將樣品瓶置于有磁力攪拌功能溫度設定約為40 ℃的加熱臺上保溫30 min。然后將已經(jīng)過熱解析或活化的萃取頭（萃取頭由二乙烯苯、聚二甲基硅氧烷、碳篩構(gòu)成）插入樣品瓶中，萃取頭到液面的距離約為1 cm，40 ℃下加熱并攪拌30 min?？焖侔纬鲚腿☆^并插入250 ℃的氣相色譜（GC）進樣口進行8 min 熱解析。每個樣品均經(jīng)過兩次獨立的萃取重復與上機分析。

實驗使用的氣相色譜型號為Agilent 6890 GC，質(zhì)譜型號為Agilent 5975B MS；毛細管柱是型號為60 m×0.25 mm×0.25 μm 的HP-INNOWAX。載氣為純度99.99%以上的高純氦氣，流速1 mL/min。不分流，自動進樣，進樣口溫度250 ℃。柱溫箱的升溫程序：初始溫度50 ℃，保溫1 min；3 ℃/min 升溫至220 ℃，保溫5 min。質(zhì)譜接口280 ℃恒溫，離子源230 ℃恒溫，EI 方式電離，離子能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍涵蓋35～350m/z。

定性分析過程利用質(zhì)譜全離子掃描（Scan）圖譜。對實驗室中存在的標樣物質(zhì)，根據(jù)在相同色譜條件下建立的該物質(zhì)質(zhì)譜信息和保留指數(shù)進行直接定性分析。對于實驗室中不存在的（無法購得的）標樣物質(zhì)，依據(jù)研究文獻中相似色譜條件下該物質(zhì)的保留指數(shù)與NIST 11 標準譜庫進行比對，或者直接將其與NIST 11標準譜庫進行比對，來實現(xiàn)間接定性分析。

定量分析中，對于已有標樣的物質(zhì)，利用其在模擬酒溶液中的標準曲線定量。對沒有標樣的物質(zhì)利用化學結(jié)構(gòu)、官能團相似、碳原子數(shù)相近的標樣香氣物質(zhì)的標準曲線進行半定量。標準曲線及樣品均采用相同濃度的4-甲基-2-戊醇為內(nèi)標對儀器的響應狀態(tài)做矯正。

1.3.2 LLE-GC-MS 分析

將25 mL樣品、40 μL內(nèi)標物（鄰-香草醛，2.002 mg/L；3,4-二甲基苯酚，1.027 mg/L；γ-己內(nèi)酯，2.043 mg/L）和5 g 硫酸銨置于50 mL 離心管中，漩渦震蕩至硫酸銨完全溶解后加入5 mL 二氯甲烷，隨即震蕩混勻，離心15 min（8 000 r/min），將下層有機溶劑吸出并轉(zhuǎn)移至10 mL 離心管中。再次向酒樣中加入5 mL 二氯甲烷，震蕩搖勻，離心15 min（8 000 r/min），將下層有機溶液吸出并加入同一10 mL 離心管中。向離心管中加入1.5 g 無水硫酸鈉，靜置，將上清液轉(zhuǎn)移至另一10 mL離心管中，使用高純氮氣氮吹濃縮至1 mL，使用0.22 μm有機濾膜過濾至2 mL 進樣小瓶，-20 ℃冰箱儲存?zhèn)溆?。每個樣品均經(jīng)過兩次獨立的萃取重復與上機分析。

GC-MS 檢測條件、香氣物質(zhì)的定性、定量方法，與1.3.1 相比有兩點差異：一是液液萃取法使用液體進樣，二是柱溫箱的升溫程序變?yōu)椋撼跏紲囟?0 ℃，7 ℃/min的速率升溫至120 ℃保持5 min，再以2 ℃/min的速率上升到200 ℃，最后以10 ℃/min 的速率上升至240 ℃，保持20 min。

利用LLE-GC-MS 分析測定出的橡木類香氣與HS-SPME-GC-MS 重疊的物質(zhì)均以LLE-GC-MS 測定的結(jié)果為準。

1.4 香氣值（OAV）和香氣輪廓的模擬計算

含香氣值（OAV）是指某種香氣物質(zhì)在葡萄酒中的含量與其閾值的比值，是評價葡萄酒揮發(fā)性組分對實際香氣貢獻大小所普遍采用的一個指標[9]。OAV 大于1，表示該物質(zhì)對葡萄酒香氣有潛在的香氣貢獻；OAV 小于1 但大于0.1，這些物質(zhì)可以通過疊加作用或協(xié)同作用對香氣產(chǎn)生影響。OAV 小于0.1，即便可以通過儀器檢測到，但其對于香氣的影響可以忽略不計。

為了模擬葡萄酒的香氣特征，需要計算每一種香氣類別OAV 總和，從而構(gòu)建葡萄酒的整體香氣輪廓。參照相關研究[9,10]，葡萄酒中所有的香氣物質(zhì)根據(jù)各自的香氣特征以及相關文獻和香氣輪盤被分為十三類：（1）果香、（2）花香、（3）草本、（4）堅果、（5）焦糖、（6）泥土、（7）化學、（8）脂肪、（9）烘烤、（10）橡木、（11）香料、（12）煙熏、（13）皮革。由于物質(zhì)的復雜性，部分物質(zhì)分屬于兩種或兩種以上香氣類別。

1.5 統(tǒng)計分析

利用 SPSS 19.0 進行主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）、判別分析（Discriminant Analysis，DA）等數(shù)據(jù)處理。利用Origin 8.0 進行繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 “美樂”干紅葡萄酒中揮發(fā)性香氣物質(zhì)基本構(gòu)成

本研究共定性、定量了114 種香氣物質(zhì)（表1），其中主要是一類（品種香）、二類（發(fā)酵香）香氣物質(zhì)，包括高級醇類、酯類、有機酸類、羰基化合物、萜烯和降異戊二烯類等；還有少數(shù)的在陳釀過程中大量形成的香氣物質(zhì)，比如乳酸乙酯、乳酸異戊酯、2-羥基-4-甲基戊酸乙酯、丁二酸二乙酯等。為了描述方便，本研究將這部分物質(zhì)簡稱為葡萄酒自身香氣物質(zhì)。另外還有30 種香氣物質(zhì)通過液-液萃取的方法提取，這30 種香氣物質(zhì)中有一部分也可以利用頂空固相微萃取法進行提取和定性，但是定量分析的結(jié)果遠低于葡萄酒中含有的實際值，因此采用液-液萃取的方法。這部分物質(zhì)主要包括揮發(fā)性酚類物質(zhì)、酚醛類物質(zhì)、呋喃類物質(zhì)和橡木內(nèi)酯等來自于橡木桶陳釀過程的香氣物質(zhì)，本研究將這30 種香氣物質(zhì)簡稱為橡木香氣物質(zhì)。

2.2 橡木桶陳釀對美樂葡萄酒橡木香氣物質(zhì)的影響

對揮發(fā)性酚類物質(zhì)、酚醛類物質(zhì)、呋喃類物質(zhì)和內(nèi)酯類物質(zhì)四類香氣物質(zhì)的總量進行計算，結(jié)果如圖1所示。

圖1 “美樂”干紅葡萄酒橡木桶陳釀過程中幾類橡木相關香氣物質(zhì)總量Fig.1 Total concentration of volatile compounds associated with oak in 'Merlot' dry red wines during aging in oak barrels

2.2.1 揮發(fā)性酚

揮發(fā)性酚類物質(zhì)主要來源于橡木在烘烤過程中木質(zhì)素的熱降解產(chǎn)生，因此中度烘烤的橡木桶陳釀的酒中揮發(fā)性酚類的濃度要相對較高。但一些揮發(fā)性酚類物質(zhì)，例如鄰-甲基苯酚，苯酚，4-乙基愈創(chuàng)木酚，對-甲基苯酚，間-甲基苯酚，4-丙基愈創(chuàng)木酚，丁香酚，4-乙基苯酚的濃度在輕度烘烤橡木陳釀的酒中要高于中度烘烤的酒。揮發(fā)性酚的總量在整個陳釀過程中都有增加，但是顯著性的增加發(fā)生在陳釀的3～9 個月，可增加至少500 μg/L 以上；0～3 個月和9～12 個月基本維持穩(wěn)定或略有增加，這個規(guī)律與烘烤度和產(chǎn)地無關。丁香酚類物質(zhì)具有丁香和香料香氣，這類物質(zhì)不僅由木質(zhì)素降解產(chǎn)生，木材本身中也含有這類物質(zhì)[11]。并且此類物質(zhì)不需要過高的烘烤溫度就可以形成，所以輕度烘烤的美國桶和斯洛伐克桶中丁香酚和順式-異丁香酚的濃度要高于對應的中度烘烤的桶。另外，丁香酚和順式-異丁香酚的變化規(guī)律是完全一致的，目前未見文獻報道過這一現(xiàn)象。乙基苯酚具有皮革味、馬廄味、醫(yī)藥味等不良風味，如果濃度超過閾值，會對葡萄酒香氣帶來負面影響。乙烯基酚自身具有感官特征，但也是乙基酚的前體物質(zhì)。它們由葡萄果實中的羥基肉桂酸類物質(zhì)經(jīng)過羥基肉桂酸脫羧酶的作用生成乙烯基酚，乙烯基酚又在不良酵母產(chǎn)生的乙烯基酚還原酶的作用下，生成乙基酚類物質(zhì)。在本次研究中，乙烯基酚類物質(zhì)的濃度在陳釀過程中持續(xù)上升，證明肉桂酸脫羧酶一直保持活性，同時也間接證明乙基酚類物質(zhì)的轉(zhuǎn)化并不顯著。4-乙基苯酚在陳釀結(jié)束時的濃度與原始酒樣相比較，基本保持不變，4-乙基愈創(chuàng)木酚雖然在陳釀前期中度烘烤的橡木桶中有不同程度的上升，但是陳釀6～9 個月又有了不同程度的下降?？傮w來說，這兩種物質(zhì)在整個陳釀過程中濃度都沒有超過閾值，證明陳釀過程中葡萄酒微生物穩(wěn)定性良好。

2.2.2 酚醛

酚醛類物質(zhì)同樣是由于烘烤過程中木質(zhì)素的降解產(chǎn)生的，中度烘烤的桶中該類物質(zhì)的濃度要高于對應的輕度烘烤的桶。并且除去輕度烘烤的斯洛伐克桶之外，該類物質(zhì)的總量在整個陳釀階段是持續(xù)上升的，從而帶來了香草味和香料味的一個持續(xù)上升[12]。另外，輕度烘烤的斯洛伐克桶的香草醛、香草酸乙酯和乙酰香草酮從陳釀9 個月到陳釀12 個月的過程中，出現(xiàn)了濃度下降的現(xiàn)象，分別由304.72、510.24 和164.04 μg/L下降至232.83、406.97 和124.35 μg/L。而在其他類型橡木桶中，這三種物質(zhì)的濃度在這一階段呈現(xiàn)相反的趨勢，這可以作為輕度烘烤斯洛伐克桶的一個特征。

2.2.3 呋喃

糠醇在呋喃類物質(zhì)的總量中占據(jù)了非常高的比例，并且在陳釀后期中度烘烤美國桶和斯洛伐克桶中糠醇的濃度超過了閾值，并且烘烤度和橡木原產(chǎn)地對于糠醇濃度的影響是很明顯的。研究認為糠醇是由對應的糠醛經(jīng)過微生物酶的作用轉(zhuǎn)化而來的，在木材本身中并不存在。在陳釀前期由于糠醛從橡木桶中的提取率高于其轉(zhuǎn)化率，因此糠醇的濃度增加主要出現(xiàn)在陳釀后期[13]，本研究中在0～3 個月糠醇的濃度增加最為明顯，增幅可達4 000 μg/L 以上；在3～12 個月，反而維持在平穩(wěn)狀態(tài)。此外，二氧化硫濃度，微生物殘余活性都會影響糠醇的生成[13]。從糠醇以外的其他呋喃類物質(zhì)來看，輕度烘烤的橡木桶呋喃總量要低于對應中度烘烤的桶。在陳釀結(jié)束時，對于中度烘烤的桶來說，美國桶中含有的呋喃類物質(zhì)濃度最高（20 047.95 μg/L），斯洛伐克桶次之（17 724.31 μg/L），法國桶最低（15 193 μg/L）。對于輕度烘烤的桶來說，美國桶（10 030.96 μg/L）和斯洛伐克桶（9 064.58 μg/L）總量差距不大，但是都要高于法國桶（4 528.12 μg/L）。雖然這幾種呋喃類物質(zhì)的濃度都未超過閾值，但是已有研究表明呋喃類物質(zhì)的濃度即使遠遠低于閾值，也會對橡木內(nèi)酯椰子味和橡木味的釋放起到促進作用。并且這幾種物質(zhì)之間也具有協(xié)同和疊加的作用[14]。這幾種物質(zhì)對于烘烤度的體現(xiàn)是很明顯的，尤其是乙酰呋喃和麥芽酚?？啡┑臐舛仍?～6 個月基本維持穩(wěn)定或略有上升，在6～9 個月迅速上升。與糠醇的研究結(jié)論相吻合，基本可以證明糠醇向糠醛的轉(zhuǎn)化或者參與其他的反應過程，都主要發(fā)生在陳釀的初期。麥芽酚具有焦糖、蜂蜜的香氣[14]，它在陳釀過程中濃度是持續(xù)上升的。

2.2.4 橡木內(nèi)酯

橡木內(nèi)酯是橡木桶能夠提供給葡萄酒的最重要的物質(zhì)之一，很多研究認為，橡木內(nèi)酯的存在可以作為葡萄酒經(jīng)過橡木陳釀的一個標志性物質(zhì)。雖然有研究認為橡木內(nèi)酯不僅來源于橡木本身，還來源于烘烤過程中脂質(zhì)的氧化。但是從橡木內(nèi)酯總量上來看，并不能證明烘烤度提高了橡木內(nèi)酯的濃度。但是不同的橡木產(chǎn)地是會明顯影響橡木內(nèi)酯濃度的，其中美國桶的橡木內(nèi)酯總量最高，主要是由于其順式-橡木內(nèi)酯的濃度最高。順式-橡木內(nèi)酯由于具有較低的閾值，對于香氣貢獻很大，主要具有椰子和木材的香氣，這也成為感官品評過程中美國桶橡木味重的一個主要來源。法國桶和斯洛伐克桶的濃度相似，由于其樹種一致。這樣的規(guī)律對于橡木內(nèi)酯順反比同樣適用。

2.3 橡木桶陳釀對美樂葡萄酒品種香和發(fā)酵香的影響

對美樂葡萄酒品種香和發(fā)酵香的香氣物質(zhì)的總量進行計算，結(jié)果如圖2 所示。其中具體定量物質(zhì)的濃度見表3。C6 醇來自于葡萄果實本身，具草本植物的香氣。本次研究中只有己醇的濃度超過了閾值，其余C6 醇的濃度均較低，從圖2 可以看出，與對照組相比，橡木桶陳釀并未給C6醇類物質(zhì)的總量帶來顯著性的差異，并且橡木桶烘烤度對于總量的影響也不具有一致性的規(guī)律。但是從原產(chǎn)地來看，斯洛伐克桶和法國桶的變化規(guī)律一致，在0～3 個月上升，3～9 個月下降，9～12個月再次上升。出現(xiàn)這種波動變化的原因目前未見文獻報道，推測是由于水解酯化平衡造成的，但是這一假設還需要進一步驗證。

圖2 “美樂”干紅葡萄酒橡木桶陳釀過程中品種香和發(fā)酵香香氣物質(zhì)總量Fig.2 Total concertation of aroma compounds associated with variety and fermentation progress in 'Merlot' dry red wines during aging in oak barrels

高級醇是酵母發(fā)酵過程中的次級代謝產(chǎn)物，主要是由葡萄糖或者氨基酸代謝而來，是葡萄酒中濃度最高的揮發(fā)性物質(zhì)，在濃度低時能夠為葡萄酒貢獻積極的香氣，在總量超過400 mg/L 時還會對葡萄酒香氣產(chǎn)生負面的影響[15]。本次研究中高級醇總量在除去具有果香味2,3-丁二醇和和具有花香香氣的2-苯乙醇后遠低于臨界值。陳釀過程中，高級醇總量的顯著性上升來自于9～12個月，而0～3 個月卻出現(xiàn)了下降。因為陳釀初期，酯類物質(zhì)大量水解產(chǎn)生的高級醇類物質(zhì)濃度很少，并且高級醇在陳釀初期還參與了其他反應，比如生成對應的醛類物質(zhì)[16]。由于在蘋乳發(fā)酵階段產(chǎn)生了大量的乳酸，因此在進入陳釀階段后，乳酸會與酒中的高級醇反應生成酯類，因此會導致乳酸乙酯濃度的持續(xù)升高。與之類似的還有2-羥基-4-甲基戊酸乙酯和丁二酸二乙酯。除去這三種酯類，其余物質(zhì)在整個陳釀過程中乙酯的總量是在持續(xù)降低的，這主要是由于發(fā)酵過程中生成了過量的生化酯類，它們在進入陳釀階段后，發(fā)生大量的水解，以維持與對應酯類和酸類的平衡。如果單獨看每一種酯類物質(zhì)，它們在陳釀過程中也是持續(xù)下降的趨勢，除去苯甲酸乙酯。但以目前的方法并未檢測到苯甲酸，因此不能推斷其濃度維持穩(wěn)定的原因。

乙酸酯主要是發(fā)酵過程中由酵母氨基酸或糖代謝產(chǎn)生的高級醇和乙酰輔酶A 反應形成，是生化酯類，具有水果香氣。乙酸乙酯香味更為突出，在整個陳釀期基本保持穩(wěn)定或持續(xù)上升，證明該物質(zhì)不僅在發(fā)酵階段合成，在陳釀階段持續(xù)合成。除去乙酸乙酯后，最重要的乙酸酯是具有香蕉味的乙酸異戊酯，烘烤度和產(chǎn)地并未給乙酸異戊酯的濃度帶來影響，其在陳釀過程中濃度持續(xù)下降，這主要也是由于在發(fā)酵階段的大量合成的該物質(zhì)水解造成的。

其他酯方面，乳酸異戊酯是主要在陳釀過程中生成的酯類，由于經(jīng)過了蘋乳發(fā)酵生成了大量的乳酸，因此乳酸異戊酯的濃度在陳釀前9 個月幾乎是直線上升，且?guī)缀醪皇墚a(chǎn)地和烘烤度的影響。但是在陳釀到9～12 個月時，美國桶和中度烘烤的斯洛伐克桶出現(xiàn)了下降，這可能是由于桶的性質(zhì)引起的。其它酯類物質(zhì)主要是在發(fā)酵過程中生成的酯，總量在整個陳釀階段都是持續(xù)下降的。以上這些酯類物質(zhì)的持續(xù)下降，也就造成了葡萄酒在陳釀過程中果香味持續(xù)下降。

一般認為有機酸主要來自于漿果本身和發(fā)酵過程中氨基酸轉(zhuǎn)化[17]，也有研究認為橡木桶的表面也存在各類有機酸[18]，會在陳釀的最初三個月快速進入酒中。在整個陳釀過程中，有機酸的總量并未因烘烤度和橡木原產(chǎn)地表現(xiàn)出一致性的規(guī)律。但是有機酸在陳釀9個月時，由不同的桶帶來的濃度之間的差異在整個陳釀過程中最顯著。此外，己酸和辛酸在陳釀過程各個桶中的表現(xiàn)相似，推測是由于這兩種酸都屬于長鏈脂肪酸，且碳原子個數(shù)接近，因此具有相似的表現(xiàn)。

由于乙偶姻的濃度在陳釀9～12 個月時大量增加（增幅可達10 000 μg/L 以上），導致在所有樣品中，陳釀12 個月的醛酮類總量顯著高于其他月份。這類物質(zhì)中最重要的物質(zhì)是乙醛，在陳釀過程中乙醛一方面會與多酚發(fā)生縮合反應生成聚合物，另一方面乙醛也在由乙醇不斷進行轉(zhuǎn)化。有研究表明，這個過程是聚合大于轉(zhuǎn)化，因此陳釀過程中乙醛濃度應該是下降的[18]。但是本研究結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化速率大于聚合速率。另外具有生青香氣的壬醛在原始酒樣中基本是不存在的，在陳釀的前三個月甚至整個陳釀過程中，對照組的壬醛濃度都顯著高于橡木陳釀的樣品，因此可以推斷橡木桶陳釀阻礙的壬醛的生成，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是壬醛在氧化條件下不易生成。

萜烯類物質(zhì)一般具有濃郁的花香，感官閾值較低。之前有研究認為，萜烯類物質(zhì)在陳釀過程中保持穩(wěn)定，在本研究中，萜烯類物質(zhì)的總量在陳釀過程中呈現(xiàn)下降的趨勢，且在0～3 個月表現(xiàn)最為明顯，3 個月后變化并不大。在這類物質(zhì)中，只有順式-玫瑰醚的濃度超過的閾值的0.1 倍濃度，但是橡木桶產(chǎn)地和烘烤度并未給其帶來規(guī)律性的影響。

C13-降異戊二烯類物質(zhì)由于具有清新的水果香和花香，且具有較低的閾值，被認為是重要的香氣物質(zhì)，這類物質(zhì)中最重要的是β-大馬士酮。一般認為C13-降異戊二烯類物質(zhì)的漿果本身含有的，但從本次研究結(jié)果看，陳釀3 個月時，β-大馬士酮的濃度顯著提高，證明木桶也是可以為葡萄酒提供C13-降異戊二烯類物質(zhì)的，這一結(jié)論也已被前人的研究證明[18]，也有可能是由于橡木桶的環(huán)境促進了其前體物質(zhì)的水解。另外一種濃度超過閾值0.1 倍濃度的物質(zhì)是TDN，它在初始酒樣中未檢出，之后濃度持續(xù)上升，更證實了上述觀點。此外TDN 能夠很好地區(qū)分橡木桶的產(chǎn)地和烘烤度，出現(xiàn)法國桶高于斯洛伐克他高于美國桶的規(guī)律，同時輕度烘烤的橡木桶陳釀的葡萄酒高于中度烘烤中TDN的濃度。

2.4 橡木桶陳釀對美樂葡萄酒香氣值（OAV）的影響

用OAV 大于0.1 的18 種橡木相關物質(zhì)對所有樣品進行主成分分析（圖3），發(fā)現(xiàn)PC1 可以將美國桶和歐洲桶分開，美國桶陳釀的樣品位于PC1 正方向，歐洲桶位于負方向。除反式-異丁香酚、反式-橡木內(nèi)酯和橡木內(nèi)酯順反比外，所有的物質(zhì)都與PC1 顯著正相關，不存在與PC1 負相關的物質(zhì)。但是對樹種相同而產(chǎn)地不同的兩種歐洲桶則無法進行有效區(qū)分，從而證明樹種對于橡木桶的影響要高于原產(chǎn)地。借助判別分析對兩種產(chǎn)地的歐洲桶進行差異物質(zhì)的篩選，根據(jù)判別系數(shù)絕對值的高低來確定產(chǎn)地或烘烤程度對橡木相關物質(zhì)的影響程度（表1），結(jié)果顯示能夠區(qū)分斯洛伐克桶和法國桶的不僅包括丁香酚類、內(nèi)酯類和香草醛類等來自于橡木木材本身的物質(zhì)，還包括4-甲基愈創(chuàng)木酚、糠醇等與橡木烘烤過程有關的物質(zhì)，由此證明樹種和原產(chǎn)地的不同會影響木材中物質(zhì)的含量以及烘烤過程的反應。

圖3 基于“美樂”干紅葡萄酒中主要橡木香氣的主成分分析的得分圖（上）和載荷圖（下）Fig.3 Scatter plot (up) and loading plot (down) of scores of PCA based on the volatile compounds associated with oak in 'Merlot'dry red wines

表1 逐步判別分析結(jié)構(gòu)矩陣系數(shù)Table 1 Structure matrix of the stepwise discriminant function

用同樣的方法，還能將不同烘烤度木桶陳釀的樣品分開（表1），起主要作用的不僅包括與烘烤過程直接或間接相關的物質(zhì)，還包括反式-橡木內(nèi)酯。有研究認為該物質(zhì)是木材本身存在的，烘烤度過高會造成其揮發(fā)或碳化；也有研究認為橡木內(nèi)酯也會由橡木中的脂肪酸在烘烤過程中氧化生成，會隨著烘烤度升高而升高[9]。本研究中反式-橡木內(nèi)酯的變化與上述結(jié)論都不完全吻合，因而考慮其可能受多種因素的影響。

而用同樣的方法對32 種來源于果實和發(fā)酵過程的物質(zhì)進行分析時，結(jié)果顯示通過這些物質(zhì)的含量無法區(qū)分不同類型橡木桶陳釀帶來的影響，說明這部分香氣物質(zhì)受橡木的影響要明顯小于與橡木有關的香氣物質(zhì)。

2.5 陳釀過程中樣品香氣輪廓的變化

通過每個取樣點“美樂”干紅葡萄酒中各種香氣物質(zhì)的OAV，計算13 種香氣特征的總香氣值，建立相對應的模擬香氣輪廓圖（圖4）。

圖4 陳釀0 個月（a）、3 個月（b）、9 個月（c）、12 個月（d）的“美樂”干紅葡萄酒模擬香氣輪廓Fig.4 The simulate aroma profiles of 'Merlot' dry red wines aged for 0 (a),3 (b),9 (c),12 (d) months,respectively

樣品未入桶前（圖4a），“美樂”干紅葡萄酒的香氣特征以花香、果香為主，分別占據(jù)總香氣特征的32.05%和24.33%。前者主要是由酯類物質(zhì)貢獻而來[19]，包括乙酯、乙酸酯和其他酯類物質(zhì)；后者的香氣表現(xiàn)主要是由萜烯類、高級醇類物質(zhì)構(gòu)成，這些物質(zhì)基本都來自于果實和發(fā)酵階段。其次比較突出的是焦糖香氣，占總特征的16.53%，主要貢獻這種香氣的也是一類和二類香氣物質(zhì)?；瘜W香氣作為原始酒樣中的第四大特征香氣解釋了總香氣特征的10.11%，主要由發(fā)酵產(chǎn)生的高級醇構(gòu)成[1]，原始酒樣中高級醇含量遠低于會產(chǎn)生負面影響的臨界值400 mg/L[19]，表明這些高級醇對原始酒樣香氣的構(gòu)成仍然起著有益的作用。

在陳釀過程中這13 種香氣的強度均發(fā)生改變。在所有樣品陳釀過程中只有果香香氣是持續(xù)下降的，主要下降發(fā)生在3～9 個月。雖然構(gòu)成果香的物質(zhì)乳酸乙酯、丁二酸二乙酯和乙酸乙酯合成速率大于分解速率[20]，但是其他酯類的大量水解還是造成了果香的下降[3]。果香還與C13 降異戊二烯有關，其中最重要的是β-大馬士酮。一般認為這種物質(zhì)只存在于果實中，其糖苷結(jié)合態(tài)前體物在陳釀階段水解產(chǎn)生β-大馬士酮[20]；也有研究表明它在橡木桶中是存在的[7]，可能對橡木陳釀進程中β-大馬士酮的增加有所貢獻。在陳釀過程中，由香氣輪廓圖發(fā)現(xiàn)中度烘烤橡木桶陳釀的葡萄酒果香的強度均高于輕度烘烤，這與橡木桶的品種或產(chǎn)地無關，但這種差異不具有顯著性。在陳釀初期，法國桶和斯洛伐克桶之間的差異比較小，但隨著時間的延長差異也逐漸增大，法國桶果香強度下降最多。

與果香整體變化規(guī)律相反的是堅果、化學、烘烤、橡木、香料和煙熏香氣，后4 種香氣主要是由于與橡木接觸產(chǎn)生的。其中受烘烤度影響的最大的是烘烤和煙熏香氣，這兩者的香氣都是中度烘烤高于輕度烘烤。對烘烤貢獻最大的是糠醇、糠醛和麥芽酚。糠醛是由橡木在烘烤過程中碳水化合物降解生成，而糠醇是由糠醛在酶的作用下轉(zhuǎn)化而來[21]。有研究認為糠醛主要在陳釀前期有葡萄酒從橡木中萃取而來，在陳釀后期轉(zhuǎn)化為糠醇或其它物質(zhì)[22]。這與本研究的結(jié)果是相反的，推測這可能是由于本研究使用的橡木桶在烘烤過程中生成和積累的糠醛類物質(zhì)較多，在葡萄酒陳釀過程中糠醛源源不斷進入葡萄酒造成的。此外，呋喃類物質(zhì)的含量即使達不到閾值，也可以通過疊加作用或協(xié)同作用增強內(nèi)酯的香氣[6,23]。煙熏氣味主要由愈創(chuàng)木酚和紫丁香酚貢獻，這兩種物質(zhì)都屬于揮發(fā)性酚類物質(zhì)，在橡木桶烘烤中由木質(zhì)素降解生成[24]，并且陳釀中含量持續(xù)增加。但這兩種香氣類別幾乎不受橡木品種和原產(chǎn)地的影響。而受橡木品種和原產(chǎn)地影響的主要是橡木和香料香氣。這兩種香氣在陳釀0～3 個月強度迅速增加，因為構(gòu)成這兩種香氣的物質(zhì)大多位于橡木桶受烘烤的內(nèi)側(cè)表面，在陳釀開始后被迅速萃取。對橡木香氣造成重大影響的是順式-橡木內(nèi)酯[25]，這種物質(zhì)也是對葡萄酒整體香氣貢獻很大的物質(zhì)之一。本研究結(jié)果顯示其在美國桶中的含量要遠高于另外幾種桶，這是由于橡木樹種的差異造成的。另外一類與橡木樹種和產(chǎn)地關系密切的是香料香氣，它主要與酚醛和揮發(fā)性酚類物質(zhì)有關，占最大比例的是反式-異丁香酚這種來源于橡木本身的物質(zhì)[24]。在陳釀終點時美國桶陳釀的葡萄酒這兩種香氣的增幅最大，斯洛伐克桶次之，法國桶最低，且具有顯著性差別。

除去上述的7 種香氣類別外，還有3 種香氣的強度在陳釀的前3 個月迅速升高，但在后9 個月因使用木桶的不同而有不同的表現(xiàn)，這類香氣包括：花香、草本和焦糖香氣。呈現(xiàn)這3 種香氣的香氣物質(zhì)主要來自于葡萄果實和發(fā)酵階段，它們在陳釀期間含量不同的變化可能與橡木桶烘烤度的不同有關。在陳釀3 個月和12 個月這兩個點，中度烘烤橡木桶中這3 種香氣的強度從美國桶、法國桶到斯洛伐克桶依次上升，但在輕度烘烤橡木桶陳釀的樣品中規(guī)律則完全相反?；ㄏ阒饕奢葡╊?、高級醇類物質(zhì)構(gòu)成[5]，本研究中該香氣OAV 貢獻最大的是苯乙醛、β-大馬士酮，這也證明這兩種物質(zhì)可能受烘烤度的影響較大。雖然焦糖香氣中也包含著香草醛、麥芽酚等橡木相關的物質(zhì)，但由于較高的閾值，它們未對焦糖香氣的變化起到?jīng)Q定性作用。

剩余兩類香氣有各自的規(guī)律。皮革香氣強度在0～3個月下降，之后持續(xù)升高，在陳釀終點時法國桶陳釀的葡萄酒中該香氣增幅高于斯洛伐克桶、美國桶，并且與烘烤度無關。皮革香氣主要由乙基酚類和乙烯基酚類物質(zhì)構(gòu)成，強度過高時會對葡萄酒香氣產(chǎn)生負面影響。在本研究中，乙烯基酚類的含量在陳釀過程中持續(xù)上升超過閾值。乙烯基酚類是乙基酚類的前體物質(zhì)[5]，后者在不良微生物污染時產(chǎn)生，具有馬廄味、動物味等不良氣味[26]。這兩種乙基酚在陳釀過程中OAV都小于0.1，也從側(cè)面說明木桶存放的酒窖環(huán)境干凈衛(wèi)生，葡萄酒陳釀過程安全可靠，研究結(jié)果具有較高的可信度。此外，脂肪香氣也在樣品香氣輪廓中占據(jù)了較重要的地位，它主要與各類脂肪酸及部分高級醇有關。一般認為脂肪酸主要來自發(fā)酵過程中氨基酸的轉(zhuǎn)化[7]，也有研究認為橡木桶表面也存在各類脂肪酸[5]，且會在陳釀的前三個月快速進入酒中。相比而言，本研究結(jié)果與前一種觀點更為一致，脂肪香氣受橡木陳釀的影響較小且變化趨勢在各種處理中較為一致。

陳釀結(jié)束時，整體香氣強度最高的是使用輕度烘烤美國桶陳釀的葡萄酒，它在果實和發(fā)酵過程產(chǎn)生的花香、果香、焦糖等主要香氣和與橡木桶接觸有關的橡木、香料主要香氣上都有最高的強度，香氣濃郁且平衡度較高。美國中度烘烤橡木桶陳釀的樣品同樣具有較高的橡木、香料香氣，但它的焦糖、花香等香氣的香氣值很低，可能存在橡木味過重的特征，因而在實際生產(chǎn)中也很少用于“美樂”單品種干紅葡萄酒的陳釀。橡木桶樹種對樣品香氣輪廓的影響主要體現(xiàn)在橡木和香料香氣上，它們在歐洲桶陳釀的樣品中要遠低于美國桶[27]。中度烘烤的斯洛伐克桶陳釀的酒樣與輕度烘烤的美國桶具有相似的花香、果香香氣強度，但其橡木香氣要遠低于后者，因此中度烘烤斯洛伐克桶陳釀的樣品表現(xiàn)為一類、二類香氣較濃郁但三類香氣略淡。法國桶陳釀的葡萄酒也具有這樣相似的香氣輪廓，且受烘烤度的影響不顯著。輕度烘烤的斯洛伐克桶陳釀的樣品是所有樣品中香氣最柔和的，一類、二類和三類香氣在樣品中都具有較低強度，但這幾類香氣強度較為平衡，因而這種桶陳釀的葡萄酒應該具有輕柔平衡的香氣特征，與“美樂”葡萄酒本身的風格更為協(xié)調(diào)[28]。

3 結(jié)論

本研究對3 個原產(chǎn)地和2 種烘烤度的6 種橡木桶陳釀的“美樂”干紅葡萄酒的香氣組成進行研究。通過SPME/LLE-GC-MS技術共檢測定量到114種香氣物質(zhì)。其中與橡木相關的香氣物質(zhì)且OAV 大于0.1 的有18 種，能用于區(qū)分不同橡木品種和原產(chǎn)地的是內(nèi)酯類、丁香酚類物質(zhì)，能用于區(qū)分不同烘烤度的有香草醛、乙酰香草酮、糠醇、4-丙基愈創(chuàng)木酚、反式-橡木內(nèi)酯。而來自葡萄果實和發(fā)酵過程的香氣物質(zhì)不能用于區(qū)分不同木桶帶來的影響。利用陳釀全過程所有物質(zhì)建立的香氣輪廓，在原始酒樣中花香、果香、焦糖和化學香氣最突出；在陳釀過程中，果香在所有樣品中持續(xù)下降，堅果、化學、烘烤、橡木、香料和煙熏香氣持續(xù)上升，花香、草本和焦糖香氣在陳釀的前三個月迅速上升，后九個月變化規(guī)律各異。受橡木桶烘烤度影響的主要香氣有花香、焦糖、堅果、化學、烘烤和煙熏香氣；主要用于區(qū)別不同橡木樹種和產(chǎn)地的有橡木、煙熏和皮革香氣。本研究分析結(jié)果表明，通過建立葡萄酒模擬香氣輪廓的方法可以區(qū)分不同品種、原產(chǎn)地和烘烤度的橡木桶，尤其是與橡木桶相關的香氣類別區(qū)分效果更好。