段潔，孫敏，付玉婷，邊文文，劉靜，趙燕妮，張亞鋒，李卓，余鄭綠，谷文軍，曾橋*

（1.陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，陜西西安 710048）（2.陜西農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究院，陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，陜西西安 710021）（3.西安市食品藥品檢驗所，陜西西安 710054）（4.陜西樸道茶業(yè)股份有限公司，陜西西安 713700）

茯磚茶為后發(fā)酵茶，屬于緊壓黑茶的一種，是所有茶中加工工藝最為復(fù)雜和獨特的產(chǎn)品[1]，具有降脂減肥、降血糖、抗腫瘤、提高免疫和抑菌等功效[2-5]，自古以來是我國西北各民族的生活必需品，被譽(yù)為“絲綢之路上的黑黃金”。近年來，隨著人們生活水平的提高和保健意識的增強(qiáng)，以茯磚茶為代表的具有較好保健功能的發(fā)酵茶受到了消費者的青睞。茯磚茶常以黑毛茶為原料，經(jīng)篩選、渥堆、氣蒸、壓制成型、發(fā)花干燥和陳化等工序加工制作而成，“發(fā)花”又被稱為“品質(zhì)風(fēng)味”工序[6]，是茯磚茶加工過程中最為關(guān)鍵的步驟，其實質(zhì)是在適宜的溫度、濕度下，以冠突散囊菌為主的多菌群協(xié)同作用的固態(tài)發(fā)酵過程[7]，微生物的發(fā)酵作用不僅賦予了茯磚茶金花普茂、菌香濃郁的特征，而且使得其內(nèi)含活性成分如多糖、黃酮、多酚及兒茶素類、生物堿、氨基酸、咖啡堿、茶色素等[8]發(fā)生了明顯的協(xié)調(diào)變化，這促進(jìn)了茯磚茶開湯后湯色紅濃、香氣純正和口感甘厚醇等優(yōu)良品質(zhì)的形成[9]，因此，對茯磚茶發(fā)花過程中活性成分變化進(jìn)行研究對于闡明茯磚茶品質(zhì)形成機(jī)制具有重要作用。然而，目前對于茯磚茶活性成分的研究主要是基于靶向測定茯磚茶加工過程中活性成分的含量，而對于整體代謝物特征的研究較少，具有較大的局限性。

代謝組學(xué)是一種新興的對生物體內(nèi)小分子和代謝網(wǎng)絡(luò)的動態(tài)調(diào)控進(jìn)行全局性分析的研究手段，廣泛應(yīng)用于食品營養(yǎng)學(xué)、毒理學(xué)、疾病診斷、藥效評價、動植物代謝和響應(yīng)機(jī)制等各領(lǐng)域[10-12]。目前，代謝組學(xué)在茶葉種植、加工工藝、質(zhì)量評價和溯源鑒別等各方面均得到了廣泛應(yīng)用，如李鑫磊等[13]基于非靶向代謝組學(xué)比較分析了同一茶樹原料按不同加工工藝制成的白茶、綠茶、烏龍茶和紅茶的代謝產(chǎn)物特征，Ku 等[14]采用代謝組學(xué)研究了不同年份普洱茶代謝產(chǎn)物特征，為普洱茶年份鑒定提供了新方法，Wang 等[15]采用代謝組學(xué)可區(qū)分生普和熟普。因此，通過代謝組學(xué)技術(shù)全面了解茶葉內(nèi)含活性成分的變化對于揭示茶葉品質(zhì)特征的形成和變化規(guī)律，闡明茶葉品質(zhì)形成機(jī)理具有重要理論意義?；诖?，本研究以LC-MS 為研究手段，對茯磚茶發(fā)花過程中內(nèi)含活性成分的變化進(jìn)行研究，挖掘茯磚茶發(fā)花過程中代謝物變化特征，探索茯磚茶獨特風(fēng)味物質(zhì)和保健作用形成機(jī)理，以期為茯磚茶加工技術(shù)改良，滋味品質(zhì)、功效提升和功能性成分富集提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茯磚茶：以同一批次黑毛茶（一級，湖南安化）為原料，在陜西涇陽陜西樸道茶業(yè)股份有限公司經(jīng)篩選、拌釉渥堆、氣蒸、手筑成型、發(fā)花干燥、陳化等工藝制成。整個發(fā)花過程為14 d，分別于發(fā)花的第0 d、7 d、14 d 取樣，依次記為FT0、FT7 和FT14，所有樣本取樣后先對茶磚外形進(jìn)行評審，然后迅速破碎混勻，立即進(jìn)行冷凍干燥處理（真空度：0.01 kPa；溫度為-50 ℃），均勻的分為兩份，一份儲存于-80 ℃下待進(jìn)行液質(zhì)分析，另一份密封儲藏于4 ℃，用于感官內(nèi)質(zhì)評審和冠突散囊菌數(shù)量檢測。

甲醇、甲酸、醋酸銨（質(zhì)譜級），美國Thermo Fisher公司；水（質(zhì)譜級），德國Merck 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Vanquish UHPLC 液相色譜、Q-ExactiveTMHF-X 質(zhì)譜儀，Thermo Fisher（德國）公司；D3024 R 低溫離心機(jī)，Scilogex（美國）公司；FD5-2.5 真空冷凍干燥機(jī)，SIM（美國）公司；Hypesil Gold column（100×2.1 mm，1.9 μm）色譜柱，Thermo Fisher（美國）公司。

1.3 方法

1.3.1 茶葉感官評審及發(fā)花過程中冠突散囊菌數(shù)量測定

茯磚茶發(fā)花過程中所取得茶樣按GB/T 23776-2018《茶葉感官審評方法》的規(guī)定進(jìn)行感官評審，同時計算各不同樣本審評得分，其中各審評因子權(quán)重分別為：外形占25%，湯色占10%，香氣占25%，滋味占30%，葉底占10%[16]。冠突散囊菌的數(shù)量按GB 4789.15-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 霉菌和酵母計數(shù)》的規(guī)定檢測。

1.3.2 樣本處理

取適量凍干后貯存于-80 ℃下茯磚茶樣本進(jìn)行液氮研磨，精密稱取100 mg 研磨后的樣本，置于EP 管中，加入80%甲醇溶液500 μL，漩渦振蕩至樣本與沉淀劑混勻，冰浴靜置5 min 后，離心20 min（13 000×g，4 ℃），進(jìn)一步取適量上清液置于EP 管中，加入一定體積的水稀釋上清液至甲醇含量為53%后，離心20 min（13 000×g，4 ℃），收集上清，進(jìn)行LC-MS/MS 分析。同時從每個樣本中取適量等體積樣本混勻作為質(zhì)控（QC）樣本。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Hypesil Gold column C18；流動相正離子模式：A 為0.1%（V/V）甲酸，B 為甲醇；流動相負(fù)離子模式：A 為5 mmol/L 醋酸銨（pH 值9.0），B 為甲醇；洗脫梯度：0～12 min，98% A；12～14 min，100% B；14～17 min，98% A；流量0.2 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量2 μL。

1.3.4 質(zhì)譜條件

電離方式：電噴霧離子源；質(zhì)量掃描范圍：70～1 050m/z；離子噴霧電壓：3.2 kV；鞘氣流速：40 arb；輔助氣流速：10 arb；離子傳輸管溫度：320 ℃；電離模式：分別采用正、負(fù)離子模式采集數(shù)據(jù)；MS/MS 二級掃描為：data-dependent scans。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有樣本均設(shè)置3 個重復(fù)，將下機(jī)數(shù)據(jù)導(dǎo)入compound discover 3.1 搜庫軟件中，進(jìn)行譜圖處理和數(shù)據(jù)庫搜庫，得到代謝物的定性和定量結(jié)果，然后對數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控分析，保證數(shù)據(jù)結(jié)果的準(zhǔn)確度、可靠性。采用多元統(tǒng)計分析，包括采用無監(jiān)督的主成分分析方法（PCA）來觀察各樣品之間的總體分布和組間的離散程度，然后用有監(jiān)督的正交偏最小二乘法分析（OPLS-DA）來區(qū)分各組間代謝輪廓的總體差異，尋找組間的差異代謝物，進(jìn)一步根據(jù)變量重要性（Variable Importance on Projection Scores，VIP＞1.0）結(jié)合t檢驗（p＜0.05）篩選出組間差異代謝物。

2 結(jié)果與分析

2.1 茯磚茶發(fā)花過程中感官審評及冠突散囊菌數(shù)量變化

對茯磚茶發(fā)花過程中所取茶樣的外形、湯色、香氣、滋味以及葉底等5 個相關(guān)因子進(jìn)行感官審評，同時對茯磚茶發(fā)花過程中冠突散囊菌數(shù)量進(jìn)行檢測，結(jié)果如表1 所示。由表1 中感官審評結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過14 d 的發(fā)花，茯磚茶的品質(zhì)得到大幅的提升，逐步形成了其內(nèi)質(zhì)金花普茂，無雜菌，開湯后湯色紅濃、菌香濃郁、香氣純正、口感圓潤、滋味醇和的風(fēng)味和口感，以及葉底棕褐，葉片完整、軟亮的獨特特征[9]。“金花”是茯磚茶區(qū)別于其它茶葉的重要特征，冠突散囊菌的數(shù)量常常做為評價茯磚茶質(zhì)量的重要指標(biāo)之一[7]，通過對發(fā)花過程中茶磚所含冠突散囊菌數(shù)量的檢測發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)花過程的進(jìn)行，茶磚中冠突散囊菌的數(shù)量逐步增多，其數(shù)量變化與茯磚茶感官審評結(jié)果正相關(guān)，至發(fā)花結(jié)束時，冠突散囊菌數(shù)量達(dá)到45×105CFU/g，符合DBS 61/0006-2014《食品安全地方標(biāo)準(zhǔn) 涇陽茯磚茶》中特一級要求，說明在本發(fā)花過程中工藝條件控制良好，產(chǎn)品質(zhì)量較好。

表1 茯磚茶發(fā)花過程中感官審評及冠突散囊菌數(shù)量變化Table 1 Sensory evaluation and changes in the number of Eurotium cristatum in the flowering process of Fu brick tea

2.2 茯磚茶發(fā)花不同時期代謝物分布特征分析

2.2.1 主成分分析（PCA）

通過對茯磚茶發(fā)花不同時期各樣本以及質(zhì)控樣本進(jìn)行主成分分析，可以從總體上反映各樣本組間的總體差異以及組內(nèi)樣本之間的變異度大小。圖1a 和1b 分別為茯磚茶發(fā)花不同時期各樣本及質(zhì)控樣本的正、負(fù)離子模式PCA 圖，由圖可知，在正離子模式下，第一主成分的貢獻(xiàn)率為40.24%，第二主成分的貢獻(xiàn)率為14.54%，二者之和為54.78%，在負(fù)離子模式下，第一主成分的貢獻(xiàn)率為38.90%，第二主成分的貢獻(xiàn)率為20.02%，二者之和為58.92%。從主成分分析圖可以看出，茯磚茶發(fā)花不同時期的各組樣本之間在正、負(fù)離子模式下均表現(xiàn)出明顯的分離趨勢，說明發(fā)花不同時期化合物差異較大，質(zhì)控組內(nèi)平行樣本成分接近，聚集在PCA 圖的中心附近，表明方法穩(wěn)定性較好，數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠。

圖1 茯磚茶發(fā)花不同時期各樣本及質(zhì)控的正離子模式（a）和負(fù)離子模式（b）PCA 圖Fig.1 PCA results of samples and quality control in positive (a)and negative ion model (b) in the flowering process of Fu brick tea

2.2.2 差異代謝物篩選

茯磚茶發(fā)花不同時期各樣本中共檢測到1 316 個物質(zhì)信號，其中正離子模式下754 個，負(fù)離子模式下562 個，通過OPLS-DA 分析，設(shè)定閾值為VIP＞1.0，上調(diào)代謝物Fold Change（FC）＞1.5 和下調(diào)代謝物FC＜0.667 且p＜0.05，篩選出的差異代謝物結(jié)果見圖2。

圖2 茯磚茶發(fā)花不同時期差異代謝物火山圖Fig.2 Differential metabolite volcano map in the flowering process of Fu brick tea

由圖2a 和2d 可以看出，發(fā)花7 d 和發(fā)花0 d 在正離子模式下的差異代謝物共有172 個，其中99 個上調(diào)，即相對含量增加，73 個下調(diào)，即相對含量下降，負(fù)離子模式下的差異代謝物共有88 個，其中59 個上調(diào)，29 個下調(diào)。進(jìn)一步分析可知，在茯磚茶發(fā)花的0 d～7 d，兩種離子模式下差異代謝物占代謝物總數(shù)19.76%，其中上調(diào)差異代謝物總數(shù)為158 個，占差異代謝物總數(shù)60.77%，102 個下調(diào)，占差異代謝物總數(shù)39.23%。圖2b 和2e 可以看出，發(fā)花14 d 和發(fā)花7 d 在正離子模式下的差異代謝物共有117 個，其中68 個上調(diào)，49 個下調(diào)，負(fù)離子模式下的差異代謝物共有112 個，其中59個上調(diào)，53 個下調(diào)，差異代謝物占代謝物總數(shù)17.40%，且上調(diào)代謝物占差異代謝物總數(shù)55.46%，下調(diào)代謝物占差異代謝物總數(shù)44.54%。圖2c 和2f 可以看出，發(fā)花14 d 和發(fā)花0 d 在正離子模式下的差異代謝物共有298 個，其中173 個上調(diào)，125 個下調(diào)，在負(fù)離子模式下的差異代謝物共有208 個，其中123 個上調(diào)，85 個下調(diào)，差異代謝物占代謝物總數(shù)38.45%，且上調(diào)代謝物占差異代謝物總數(shù)58.50%，下調(diào)代謝物占差異代謝物總數(shù)41.50%。上述結(jié)果表明，茯磚茶發(fā)花不同時期樣本代謝物差異明顯，且上調(diào)差異代謝物數(shù)量大于下調(diào)代謝物數(shù)量。

Venn 圖直觀的體現(xiàn)了不同分組之間共有及特有差異代謝物數(shù)量，以及多組差異代謝物之間的關(guān)系。從圖3 可以看出，在正離子模式下，各組差異代謝物總數(shù)為367個，F(xiàn)T7.VS.FT0與FT14.VS.FT7、FT14.VS.FT0組共有的差異代謝物數(shù)量分別為14 和130 個，分別占總數(shù)的3.81% 和 35.42%，而 FT14.VS.FT7 和FT14.VS.FT0 組共有的差異代謝物數(shù)量為79 個，占總數(shù)的21.52%，3 個不同分組共有的差異代謝物數(shù)量為3個，僅占總數(shù)的0.82%。在負(fù)離子模式下，各分組差異代謝物總數(shù)為 246 個，其中 FT7.VS.FT0 與FT14.VS.FT7、FT14.VS.FT0 組共有的差異代謝物數(shù)量分別為19 和62 個，分別占總數(shù)的7.72%和25.20%，而FT14.VS.FT7 和FT14.VS.FT0 組共有的差異代謝物數(shù)量為87 個，占總數(shù)的35.37%，3 個不同分組共有的差異代謝物數(shù)量為6 個，占總數(shù)的2.44%。上述結(jié)果表明，差異代謝物在發(fā)花不同時期的變化規(guī)律各異。

圖3 正離子模式（a）和負(fù)離子模式（b）差異代謝物Venn 圖Fig.3 Venn analysis of differential metabolite in positive (a) and negative ion model (b)

2.2.3 主要差異代謝成分分析

在數(shù)據(jù)庫比對的基礎(chǔ)上，查閱相關(guān)文獻(xiàn)鑒定出的茯磚茶發(fā)花不同時期代謝物差異主要可分為生物堿、有機(jī)酸及其衍生物、氨基酸及其衍生物、黃酮類、甾體及其衍生物、苯丙素類、香豆素類、多酚及兒茶素、維生素、萜類等，具體如表2 所示。

從表2 可以看出已鑒定出的各不同差異代謝物種類數(shù)量及變化情況，苯丙素類、香豆素類、多酚及兒茶素類、維生素和萜類在發(fā)花過程中鑒定出的差異代謝物數(shù)量較少，生物堿和有機(jī)酸為發(fā)花過程中數(shù)量較多的差異代謝物，其中，在發(fā)花各不同階段，生物堿差異代謝物上調(diào)數(shù)量均略高于下調(diào)數(shù)量，而有機(jī)酸中上調(diào)數(shù)量明顯高于下調(diào)數(shù)量。氨基酸及其衍生物的差異代謝物數(shù)量僅次于生物堿和有機(jī)酸，在發(fā)花的0 d～7 d，代謝物下調(diào)數(shù)量高于上調(diào)數(shù)量，而在7 d～14 d，氨基酸及其衍生物的差異代謝物數(shù)量與0 d～7 d 相比明顯降低，且在該階段上調(diào)數(shù)量大于下調(diào)數(shù)量，從0 d～14 d全過程看，氨基酸及其衍生物的差異代謝物以下調(diào)為主。黃酮類化合物差異代謝物在0 d～7 d，上調(diào)數(shù)量高于下調(diào)數(shù)量，而在7 d～14 d，上調(diào)數(shù)量低于下調(diào)數(shù)量，0 d～14 d 整個發(fā)花過程中，上調(diào)數(shù)量和下調(diào)數(shù)量相當(dāng)，甾體及其衍生物在發(fā)花過程中差異代謝物以上調(diào)為主。

表2 茯磚茶發(fā)花不同時期的差異代謝物種類及變化情況Table 2 Differential metabolite types and changes in the flowering process of Fu brick tea

2.3 茯磚茶發(fā)花不同時期主要成分變化規(guī)律

2.3.1 生物堿

生物堿是茯磚茶發(fā)花過程中的主要差異代謝物之一，對茯磚茶發(fā)花過程中咖啡堿、可可堿和茶堿以及結(jié)合VIP 值篩選出0 d～14 d 全發(fā)花過程中其他部分生物堿差異代謝物進(jìn)行分析，各代謝物名稱、保留時間及在發(fā)花不同時期相對峰面積等如表3 所示，將發(fā)花結(jié)束時峰面積和發(fā)花初始進(jìn)行對比，峰面積增大的記為上調(diào)，反之為下調(diào)。

表3 茯磚茶發(fā)花不同時期生物堿代謝物差異Table 3 Differences of alkaloid metabolites in the flowering process of Fu brick tea

咖啡堿、可可堿和茶堿是茶中主要的生物堿[17]，研究表明，發(fā)花對茯磚茶中部分生物堿有較大影響。由表3 可以看出，發(fā)花結(jié)束（14 d）時，茯磚茶中咖啡堿和可可堿含量均較發(fā)花初期（0 d）增加，但差異不顯著（p＞0.05），咖啡堿本身較為穩(wěn)定，項飛等[18]以同一茶樹鮮葉原料在同一條件下采用不同工藝分別加工為綠茶、紅茶、白茶、青茶、黃茶和黑茶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各不同種類茶中咖啡堿含量無顯著差異。而茶堿在發(fā)花過程中上調(diào)明顯，發(fā)花結(jié)束時茶堿相對峰面積較發(fā)花初期增加219.47%。其他生物堿中，肉毒堿、異喹啉、相思子堿、長春質(zhì)堿在發(fā)花過程中均上調(diào)，而甜菜堿、吲哚和檳榔堿均下調(diào)。肉毒堿亦稱維生素BT，具有促進(jìn)脂類代謝，降低血脂，治療肥胖等作用[19]，和FT0相比，其在FT14 樣本中相對峰面積增加468.11%，肉毒堿含量的增加有助于增強(qiáng)茯磚茶減肥功效。異喹啉類生物堿具有降血壓、降血糖、抗炎和抗腫瘤等多種生物活性[20,21]，茯磚茶發(fā)花過程中，異喹啉上調(diào)明顯，發(fā)花結(jié)束時其相對峰面積約為發(fā)花初始的100 倍。而具有抗炎、免疫增強(qiáng)和抗肝損傷作用的相思子堿[22]和發(fā)花初期相比，其發(fā)花結(jié)束時樣本相對峰面積增加394.49%。長春質(zhì)堿具有較好的降血糖、利尿和止血作用[23]，F(xiàn)T14 和FT0 相比，相對峰面積增加1 152.21%。甜菜堿是一種廣泛分布于動植物及微生物中的天然產(chǎn)物，是枸杞、甜菜等的活性成分，具有提高機(jī)體抗氧化酶活力的作用[24]。甜菜堿在發(fā)花0 d～7 d呈下降趨勢，而在7 d～14 d 上調(diào)明顯，發(fā)花結(jié)束時含量與發(fā)花初期相當(dāng)。吲哚和檳榔堿在發(fā)花過程中下調(diào)明顯，發(fā)花結(jié)束和發(fā)花初始相比，相對峰面積分別下降52.13%和65.51%，檳榔堿具有致口腔粘膜下纖維性變的作用，從而導(dǎo)致口腔癌，此外，檳榔堿對神經(jīng)系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)均有一定的毒害作用，其下調(diào)對于提高茯磚茶安全質(zhì)量具有一定作用[25]。

2.3.2 多酚及兒茶素類

多酚及兒茶素是茯磚茶中重要的活性物質(zhì)，發(fā)花不同時期主要多酚及兒茶素和差異代謝物名稱、保留時間及在發(fā)花不同時期相對峰面積等如表4 所示，將發(fā)花結(jié)束時峰面積和發(fā)花初始進(jìn)行對比，將峰面積增大的記為上調(diào)，反之為下調(diào)。

由表4 可以看出，在多酚差異代謝物中，除順式白藜蘆醇、白果內(nèi)酯和4-甲基兒茶酚呈下調(diào)水平外，其余均上調(diào)，其中以鼠尾草酚上調(diào)最為明顯，其次為白藜蘆醇、異丹葉大黃素、厄弗酚和二氫白藜蘆醇。兒茶素差異代謝物中，和FT0 相比，F(xiàn)T14 中兒茶素，表兒茶素、沒食子酸乙酯和表沒食子兒茶素分別上調(diào)54.00%、52.52%、1 494.49%和56.35%，兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素-3-O-沒食子酸脂和表兒茶素沒食子酸酯分別下調(diào)47.08%、56.86%、67.31%和62.63%。多酚和兒茶素是茯磚茶中主要的抗氧化活性成分和呈味物質(zhì)，尤其兒茶素類物質(zhì)對賦予茶湯苦、澀味以及特有的收斂性具有重要作用[17]。研究發(fā)現(xiàn)，EGCG、ECG 等酯型兒茶素的苦澀、收斂性強(qiáng)，而EGC、EC 等非酯型兒茶素滋味較醇和、回味爽口[26]，因此，發(fā)花過程中EGCG、ECG 的下調(diào)和EGC、EC 的上調(diào)對于賦予茯磚茶口感醇和的特征具有重要作用。

表4 茯磚茶發(fā)花不同時期多酚及兒茶素類代謝物差異Table 4 Differences of polyphenol and catechin metabolites in the flowering process of Fu brick tea

2.3.3 黃酮類

對FT7.VS.FT0、FT14.VS.FT7、FT14.VS.FT0 差異代謝物進(jìn)行鑒別，并對鑒別出的代謝物在發(fā)花結(jié)束和發(fā)花初始的相對峰面積進(jìn)行對比，同時分析主要黃酮類代謝物在發(fā)花過程中的變化，將峰面積增大的記為上調(diào)，反之為下調(diào)，相關(guān)結(jié)果如表5 所示。

表5 茯磚茶發(fā)花不同時期黃酮類代謝物差異Table 5 Differences of flavonoid metabolites in the flowering process of Fu brick tea

二氫槲皮素和二氫楊梅素為二氫黃酮醇類化合物，根皮素為具有二氫查爾酮結(jié)構(gòu)的黃酮類化合物，它們和龍血素A、香葉木素、漢黃芩素、金腰乙素等均具有較好的抗炎活性、抑菌和抗腫瘤作用[27,28]，鳶尾黃素為一種天然存在的異黃酮，具有抗炎、抗氧化等作用[29]，普魯寧具有保護(hù)組織細(xì)胞，調(diào)節(jié)血糖平衡，抑制腫瘤的作用[30]，橙皮素、柚皮素和圣草素為黃烷酮類化合物，具有清除自由基、抗炎和抗腫瘤作用[31]，橙皮素為具有獨特的風(fēng)味的淡黃色固體，和柚皮素均有增甜的作用[32,33]，其在發(fā)花過程中的上調(diào)對于有助于改善茯磚茶的湯色、滋味和香味，上述黃酮類化合物在發(fā)花過程中呈上調(diào)水平，對于提高茯磚茶的品質(zhì)和保健功能具有一定作用。槲皮素為茶葉中重要的黃酮醇類化合物，在發(fā)花過程中下降明顯，和發(fā)花初期相比，發(fā)花結(jié)束時降幅達(dá)44.84%，此外鞣花酸、落新婦苷、柚皮苷二氫查爾酮、黃酮、大豆甙、金雀異黃酮等均下調(diào)明顯，降幅分別達(dá)77.66%、64.69%、56.53%、53.88%、51.23%和49.78%。

2.3.4 氨基酸及其衍生物

對FT7.VS.FT0、FT14.VS.FT7、FT14.VS.FT0 所有氨基酸差異代謝物進(jìn)行鑒別，并對鑒別出的代謝物在發(fā)花結(jié)束和發(fā)花初始的相對峰面積進(jìn)行對比，分析氨基酸及其衍生物在發(fā)花過程中的變化，將峰面積增大的記為上調(diào)，反之為下調(diào)，結(jié)果如表6 所示。

茯磚茶發(fā)花過程中由于微生物生長繁殖需要大量的氮源，因而導(dǎo)致氨基酸總量降幅較大。茶氨酸是茶葉中代表氨基酸，占氨基酸總量的50%以上，實驗表明，發(fā)花末期和初期相比，茶氨酸含量變化不大，因而未出現(xiàn)在氨基酸類差異代謝物中，茶氨酸具有焦糖香和鮮爽味，能緩解苦澀味，增強(qiáng)甜味感[34]，這為茯磚茶良好的口感奠定了基礎(chǔ)。由表6 可以看出，在鑒別出的差異代謝物中，上調(diào)氨基酸有8 種，其中纈氨酸上調(diào)幅度最大，為574.04%，纈氨酸為苦味氨基酸，但在茶葉中含量極低[35]，其次為乙?；?L-蘇氨酸，上調(diào)505.86%，上調(diào)幅度最小為L-酵母氨酸，上調(diào)46.49%。下調(diào)氨基酸有22 種，占總數(shù)的73.33%，其中4-胍基丁酸降幅最大，為73.54%，其次為D-絲氨酸，降幅為66.36%，其余降幅介于26.51%～62.43%。氨基酸在茶葉中主要賦予產(chǎn)品鮮爽的口感，而醇和是茯磚茶重要的風(fēng)味特征之一，因此，發(fā)花過程中氨基酸的下調(diào)有助于促進(jìn)茯磚茶品質(zhì)的形成，這與普洱茶有類似之處[36]。由于氨基酸類物質(zhì)呈味差異較大，既有呈現(xiàn)鮮味、甜味的氨基酸，又有呈現(xiàn)苦味、酸味的氨基酸，各不同氨基酸對茶湯滋味既有獨立影響，又有協(xié)同作用[37]，因此，應(yīng)繼續(xù)深入研究茯磚茶發(fā)花過程中氨基酸含量和組成對茯磚茶滋味的影響，并進(jìn)一步進(jìn)行代謝調(diào)控研究，從而為改善茯磚茶湯滋味提供新的思路和方法。

表6 茯磚茶發(fā)花不同時期氨基酸及其衍生物代謝物差異Table 6 Differences of amino acid and their derivatives metabolites in the flowering process of Fu brick tea

3 討論

茯磚茶為黑茶類全發(fā)酵茶，“發(fā)花”是茯磚茶加工過程中的關(guān)鍵步驟，通過發(fā)花不僅大大降低了原料本身由于較高的酚/氨比而導(dǎo)致的粗澀味，使得茯磚茶口感更醇和[38]，而且賦予了茯磚茶特有的“菌花香”，而“菌花香”融入茶湯形成的“菌花香”進(jìn)一步改善了茯磚茶的口感和風(fēng)味，提升了產(chǎn)品品質(zhì)。研究表明，發(fā)花過程是以冠突散囊菌為主的金花菌群協(xié)同作用的固態(tài)發(fā)酵過程[7]，在濕熱環(huán)境下，由于微生物的作用，茯磚茶中活性成分發(fā)生了顯著的變化，這與非靶向代謝組學(xué)分析結(jié)果相符。傅冬和等[39]對茯磚茶加工過程中主要化學(xué)成分的變化研究發(fā)現(xiàn)，茯磚茶加工過程中內(nèi)含成分以下降為主，且發(fā)花階段是內(nèi)含成分下降的主要環(huán)節(jié)，在此過程中，氨基酸、茶多酚、黃酮類和總兒茶素下降幅度分別為36.84%、50.86%、50.21%和61.68%，僅咖啡堿下降幅度較小，為10.85%。進(jìn)一步結(jié)合本文非靶向代謝研究結(jié)果分析可知，雖然茯磚茶發(fā)花過程中各活性成分總量呈下降趨勢，但仍有部分活性成分含量亦上升明顯，從而導(dǎo)致生物堿、多酚及兒茶素、黃酮類和氨基酸等主要活性成分的組成和結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大的變化，這對于有效的改善茯磚茶的口感、風(fēng)味和保健功效具有重要作用，如多酚由于酶促氧化向茶褐素轉(zhuǎn)變不僅改善了茶湯顏色[8]，而且降低了澀味，氨基酸的變化促進(jìn)了醇和滋味的形成[34]，以橙皮素、柚皮素等為代表的黃酮類化合物則對茯磚茶湯色、滋味和香味的改善均有重要作用[32,33]。因此，發(fā)花的特殊工藝賦予了茯磚茶獨特的產(chǎn)品特征。茯磚茶為全發(fā)酵茶中的后發(fā)酵茶，具有“越陳越香”的特點[40]，陳化和儲藏過程中，茯磚茶在以冠突散囊菌為主的金花菌群的持續(xù)作用下促進(jìn)了其感官品質(zhì)的進(jìn)一步提升，這與發(fā)花過程具有類似作用。此外，盡管傳統(tǒng)靶向研究結(jié)果表明茯磚茶加工和儲藏過程中主要功能成分含量下降明顯，但茯磚茶仍具有較好的保健作用[41]，除抗氧化作用隨著加工過程的進(jìn)行和陳化時間的延長降低外，降脂、降壓、降糖和抗炎、抗腫瘤活性均較好。這一方面可能是由于部分保健功能突出的活性成分在茯磚茶發(fā)花過程中含量增加所導(dǎo)致，如肉毒堿、異喹啉、長春質(zhì)堿等有助于增強(qiáng)茯磚茶降脂、降壓和抗炎等作用，二氫槲皮素、二氫楊梅素、龍血素A、香葉木素、漢黃芩素、金腰乙素等的增加有助于增強(qiáng)茯磚茶抗腫瘤作用；另一方面發(fā)花過程中還可能產(chǎn)生了其他新的成分，但由于非靶向代謝組學(xué)主要是針對低分子量代謝物的分析，因此發(fā)花過程中產(chǎn)生的新的成分還需要結(jié)合其他方法進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

綜上，運用UPLC-MS 對茯磚茶發(fā)花過程中不同時間代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測，主成分分析結(jié)果表明茯磚茶發(fā)花過程中內(nèi)含成分存在較大差異，在檢測到的1 316 個物質(zhì)信號中，0 d 和7 d、7 d 和14 d 以及0 d 和14 d 之間分別篩選出260、229 和506 個代謝差異物，篩選和鑒定結(jié)果表明，這些物質(zhì)屬于生物堿、氨基酸及其衍生物、黃酮類、茶多酚及兒茶素、有機(jī)酸及其衍生物、苯丙素類、維生素、萜類等。進(jìn)一步對影響茯磚茶品質(zhì)和功能的主要代謝物質(zhì)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)花改變了茯磚茶生物堿、多酚及兒茶素、黃酮和氨基酸等主要代謝物的組成，這不僅降低了茯磚茶的苦澀味，促進(jìn)了醇和口感和紅濃湯色的形成，且肉毒堿、異喹啉、相思子堿、長春質(zhì)堿等生物堿在發(fā)花過程中的上調(diào)有助于提升茯磚茶降脂、降壓和抗炎等功效。和傳統(tǒng)活性成分分析方法相比，非靶向代謝組學(xué)分析技術(shù)更加全面的揭示了茯磚茶發(fā)花過程中代謝物整體特征，進(jìn)一步加深了對茯磚茶活性成分的了解，后續(xù)有必要對采用代謝組學(xué)分析出的差異代謝物進(jìn)一步進(jìn)行定量分析，并研究差異代謝物與茯磚茶風(fēng)味和保健功能的相關(guān)性，為深刻揭示茯磚茶風(fēng)味和保健功能形成機(jī)制提供依據(jù)和參考。