梁燕惠，高珺珊，薛亮*，王林平，孟洛冰，蔡偉程，李貽靜，張菊梅，王涓，陳謀通，葉青華，吳詩，劉細(xì)霞，吳清平*

（1.湖北師范大學(xué)，生命科學(xué)學(xué)院食用野生植物保育與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北黃石 435002）（2.廣東省科學(xué)院微生物研究所，華南應(yīng)用微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省微生物安全與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)微生物組學(xué)與精準(zhǔn)應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510070）

食源性諾如病毒（Norovirus，NoV）是導(dǎo)致世界范圍內(nèi)流行性和散發(fā)性急性胃腸炎的主要病原[1]。NoV傳播途徑廣，主要通過糞-口途徑傳播，此外，進(jìn)食被NoV 污染的食物是其重要傳播途徑之一[2]。通過食用在源頭上被該病原污染的食物，如海鮮、漿果和沙拉等，或者在加工過程中被該病原污染的食品都可導(dǎo)致NoV 感染[3]。據(jù)估計(jì)，每年約有21.2 萬人因感染NoV發(fā)病以致死亡，相關(guān)經(jīng)濟(jì)損失600 多億美元[4]。

NoV 屬于杯狀病毒科，諾如病毒屬，是一種極易變異且遺傳多樣性豐富的RNA 病毒[5]。根據(jù)主要衣殼蛋白的序列可將其分為10 個(gè)基因群，其中基因群GI、GII、GIV、GVIII 和GIX 均可感染人[6]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，超過75%的人類急性胃腸炎病例由GII 基因群感染所致[7]。其中GII.4 在過去20 年內(nèi)流行，并通過突變和重組不斷演化，進(jìn)而在NoV 流行中占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)地位[8]。但近年來，GII.17 等原非流行株開始突然暴發(fā)并不斷引起食源性疫情[9-12]，尤其GII.2 更是成為包括我國(guó)在內(nèi)一些國(guó)家的主要流行基因型[13-15]，給全球食品安全帶來了新威脅。

我國(guó)是NoV 流行的主要地區(qū)之一[16]，作者課題組研究表明，長(zhǎng)期以來NoV 是我國(guó)華南地區(qū)重要的急性腹瀉病原[17,18]，同時(shí)在市售貝類、城市水體中均存在普遍的NoV 污染[19]。為深入了解NoV 流行進(jìn)化機(jī)制以對(duì)其進(jìn)行有效防控，本研究擬以團(tuán)隊(duì)前期獲得的GII.2[P2]型GZ2015-L335 毒株為對(duì)象，對(duì)其基因組結(jié)構(gòu)及衣殼蛋白功能進(jìn)行分析和研究，以期為食品中NoV 快速檢測(cè)方法建立及疫苗研發(fā)提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 毒株和細(xì)胞

GII.2[P2]型GZ2015-L335 毒株來自作者團(tuán)隊(duì)前期廣州地區(qū)急性腹瀉臨床樣本并已分型鑒定；Sf9 昆蟲細(xì)胞購自國(guó)家細(xì)胞資源平臺(tái)；大腸桿菌DH10Bac和DH5α感受態(tài)細(xì)胞分別購自北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司和寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。

1.2 質(zhì)粒及試劑

GZ2015-L335-ORF2 質(zhì)粒、載體pFastBac1、唾液樣本收集自廣東省科學(xué)院微生物研究所51 名健康志愿者并于前期完成表型鑒定；抗GII.2[P]衣殼P 顆粒血清為實(shí)驗(yàn)室前期制備[20]；Prime STAR? Max DNA Polymerase、限制性內(nèi)切酶BamH I 和SphI，寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；Western blot 快速封閉液、桿狀病毒載體質(zhì)粒提取試劑盒和BeyoECL Plus（超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒），北京碧云天生物公司；10×PBST WB 漂洗液、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl-Beta-DThiogalactopyranoside，IPTG）、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）、四環(huán)素、慶大霉素、卡那霉素、氨芐青霉素，上海生工生物工程股份有限公司；辣根過氧化物酶（Horse Radish Peroxidase，HRP）標(biāo)記的Goat Anti Mouse IgG (H+L)、無血清培養(yǎng)基和昆蟲細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑，北京義翹神州科技股份有限公司；豬胃粘蛋白III 型，美國(guó)Sigma 公司；DL 5,000 DNA Marker 和Blue Plus?IV Protein Marker（10～180 kDa），北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器設(shè)備

Bio-Rad Power Pac 基礎(chǔ)電泳儀，美國(guó)伯樂公司；Tanon 凝膠成像系統(tǒng)，上海天能科技有限公司；DHP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；GI-54TW 高壓滅菌鍋，美國(guó)ZEALWAY；電子天平，常熟市雙杰測(cè)試儀器廠；JY92-IIDN 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技有限公司；BE-9008 微孔板恒溫振蕩器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；EPOCH2 酶標(biāo)儀，美國(guó)Biotech 公司；HBS-4009 自動(dòng)洗板機(jī)，南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；BECKMAN Avanti J-301 高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Beckman Coulter 有限公司；Hitachi H-7650透射電子顯微鏡，日本HITACHI。

1.4 方法

1.4.1 基因序列分析

將毒株GZ2015-L335 核苷酸序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，并進(jìn)行BLAST 在線比對(duì)（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），根據(jù)參考毒株對(duì)GZ2015-L335 基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。同時(shí)，采用在線基因分型工具（http://www.rivm.nl/mpf/norovirus/typingtool）進(jìn)行毒株基因分型。

1.4.2 重組pFastBac-GZ2015-L335 轉(zhuǎn)座質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)GZ2015-L335 毒株的ORF2 區(qū)域設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物，上下游引物分別加上酶切位點(diǎn)BamH I 和Sph（I下劃線部分）。F：5'-CGGGATCC ATGAAGATGG CGTCGAATGA-3'；R：5'-CATGCATGCTTATTGAACC CTTCTACGCC-3'，由北京六合華大公司合成。以病毒基因組為模板擴(kuò)增ORF2 序列，PCR 反應(yīng)體系（50 μL）：PrimeSTAR Max Premix（2×）25 μL，模板1 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，ddH2O 22 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；98 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃，1 min，共3 個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min。使用BamH I 和SphI分別對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物及pFastBac 載體進(jìn)行雙酶切，連接酶切產(chǎn)物后將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于氨芐青霉素抗性瓊脂平板后進(jìn)行菌落PCR 篩選，將陽性克隆送至北京六合華大公司測(cè)序。

1.4.3 重組Bacmid-GZ2015-L335 質(zhì)粒的構(gòu)建

將測(cè)序正確的重組pFastBac-GZ2015-L335 質(zhì)粒提取后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10Bac 感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含X-gal (100 μg/mL)、IPTG (40 μg/mL)、卡那霉素（50 μg/mL）、四環(huán)素（10 μg/mL）和慶大霉素（7 μg/mL）的抗性平板上，37 ℃培養(yǎng)48 h 后，挑白色單菌落于LB抗性平板上劃線，37 ℃過夜培養(yǎng)后，挑單菌落進(jìn)行菌落PCR 驗(yàn)證，設(shè)定野生型桿狀病毒為對(duì)照組。

1.4.4 重組桿狀病毒構(gòu)建和蛋白表達(dá)

從 PCR 驗(yàn)證正確的陽性菌株中提取重組Bacmid-GZ2015-L335 質(zhì)粒，按照昆蟲細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑操作說明，將重組Bacmid-GZ2015-L335 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至Sf9昆蟲細(xì)胞中，獲得P1 代桿狀病毒。將P1 代桿狀病毒接種至Sf9 細(xì)胞中，獲得P2 代桿狀病毒。對(duì)病毒進(jìn)行滴度測(cè)定后，當(dāng)感染復(fù)數(shù)（Multiplicity of Infection）值為0.05～0.1 時(shí)，接種至Sf9 細(xì)胞并于27 ℃、150 r/min條件下表達(dá)48 h 后進(jìn)行SDS-PAGE 分析。

1.4.5 超離純化

收集細(xì)胞培養(yǎng)物7 000 r/min、4 ℃離心10 min，收集沉淀并用PBS 重懸，經(jīng)超聲破碎后，離心收集上清。上清用7%（m/V）PEG6000 和2%（m/V）的NaCl 沉降過夜，次日10 000 r/min、4 ℃離心30 min，收集沉淀，然后加入等體積濃度為1.4 g/mL 的CsCl 溶液并重懸于13.2 mL 的超離管中，288 000 r/min、8 ℃離心24 h，收集可見帶，PBS 重懸后，141 000 r/min、8 ℃離心3 h 以去除CsCl 并收集沉淀。PBS 重懸沉淀即獲得GZ2015-L335 VLP。

1.4.6 透射電鏡觀察

通過紫外分光光度計(jì)測(cè)定毒株GZ2015-L335 VLP蛋白濃度，經(jīng)磷鎢酸負(fù)性染色后，于40 000×透射電子顯微鏡下觀察病毒樣顆粒的形態(tài)及大小。

1.4.7 Western blot 鑒定

純化的GZ2015-L335 VLP 經(jīng)SDS-PAGE 電泳分離后，將其電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene Fluoride，PVDF）膜上，經(jīng)Western blot 快速封閉液封閉15 min后，加入1:3 000 稀釋的抗GII.2[P]衣殼P 顆粒血清4 ℃過夜孵育，次日用漂洗液漂洗3 次，每次10 min，加入1:3 000 稀釋的HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37 ℃孵育1 h。用洗滌液漂洗3 次，條件同上，最后采用ECL 化學(xué)發(fā)光法對(duì)PVDF 膜進(jìn)行顯影。

1.4.8 ELISA 鑒定

將GZ2015-L335 VLP 濃度稀釋為1 μg/mL，4 ℃包被過夜。次日用PBST 洗板3 次。5%脫脂奶37 ℃封閉2 h。PBST 洗板3 次，加入1:10 000 稀釋的抗GII.2[P]衣殼P 顆粒血清，37 ℃孵育1 h。PBST 洗板4 次，將HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG 按1:3 000 稀釋并加至板中，37 ℃孵育0.5 h。PBST 洗5 次。加入TMB 37 ℃避光孵育10 min。反應(yīng)結(jié)束后，加入終止液。酶標(biāo)儀上測(cè)定OD450值。OD450值＞0.2 且至少為陰性對(duì)照的2 倍為判為陽性，同時(shí)設(shè)置PBS 為陰性對(duì)照。

1.4.9 受體結(jié)合功能驗(yàn)證

利用 NoV 結(jié)合組織血型抗原（Histo-Blood Groupsantigens，HBGAs）實(shí)驗(yàn)評(píng)估重組GZ2015-L335 VLP 與不同血型人唾液（A、B、O 和非分泌型）以及豬胃粘蛋白III 型（Pig Gastric Mucin Type III，PGM）的結(jié)合情況。將不同血型的唾液樣本以1:1 000 稀釋后，4 ℃包被過夜，5%（m/V）脫脂奶粉37 ℃封閉2 h，隨后加入濃度為1 μg/mL 的GZ2015-L335 VLP，37 ℃孵育1 h，加入1:10 000 稀釋的抗GII.2[P]衣殼P 顆粒血清，37 ℃孵育1 h。PBST 洗板4 次，將HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG 按1:3 000 稀釋并加至板中，37 ℃孵育0.5 h。PBST 洗板5 次后，加入TMB 37 ℃避光孵育10 min。反應(yīng)結(jié)束后，加入終止液。酶標(biāo)儀上測(cè)定OD450值。設(shè)置PBS 為陰性對(duì)照，以PGM 包板作為陽性對(duì)照。

2 結(jié)果與討論

2.1 毒株GZ2015-L335 基因序列分析

毒株 GZ2015-L335 基因組全長(zhǎng)為 7 496 bp（GenBank 登錄號(hào)為MK729086），包括3 個(gè)開放閱讀框（Open Reading Frames，ORFs），分別位于5～5 104 bp，5 085～6 713 bp 和6 713～7 492 bp 處。其中，ORF1 與ORF2 存在重疊區(qū)域含有20 bp，而ORF2 與ORF3 重疊一個(gè)堿基A（圖1）。在線分型工具分析結(jié)果表明毒株GZ2015-L335 屬于GII.2[P2]基因型。

圖1 毒株GZ2015-L335 基因組結(jié)構(gòu)組成Fig.1 Genome composition of the norovirus strain GZ2015-L335

2.2 重組pFastBac-GZ2015-L335轉(zhuǎn)座質(zhì)粒和重組Bacmid-GZ2015-L335 質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

將目的片段與表達(dá)載體連接后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，利用抗性板篩選后進(jìn)行測(cè)序分析。結(jié)果表明插入片段大小與序列均正確，重組轉(zhuǎn)座質(zhì)粒 pFastBac-GZ2015-L335 成功構(gòu)建。接著將pFastBac-GZ2015-L335 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH10Bac 感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)抗性平板篩選后，進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果如圖2。可見擴(kuò)增產(chǎn)物在約4 000 bp 處有單一明顯條帶，其大小與預(yù)期相符，表明重組Bacmid-GZ2015-L335 質(zhì)粒已成功構(gòu)建。

圖2 重組質(zhì)粒Bacmid-GZ2015-L335 的菌落PCR 鑒定Fig.2 Colony PCR identification of the recombinant plasmid Bacmid-GZ2015-L335

2.3 毒株GZ2015-L335 VLP 的表達(dá)及純化

將重組Bacmid-L335 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至Sf9 昆蟲細(xì)胞中，獲得P1 代桿狀病毒，將該病毒接種至Sf9 細(xì)胞中，獲得P2 代桿狀病毒。收集P2 代感染后的細(xì)胞，對(duì)重組蛋白提取純化后，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分析，由圖3可見在約58 ku 處有較為清晰的條帶，其大小與目的蛋白一致，在略低于目的蛋白下方出現(xiàn)蛋白條帶，可能為GZ2015-L335 VLP 的N 端缺失部分氨基酸所致[21]。

圖3 毒株GZ2015-L335 VLP 的SDS-PAGE 鑒定Fig.3 SDS-PAGE identification of the norovirus strain GZ2015-L335 VLP

2.4 毒株GZ2015-L335 VLP 的透射電鏡觀察

NoV 病毒樣顆粒作為天然病毒的替代品，具有與天然病毒相似的形態(tài)結(jié)構(gòu)和免疫原性，能夠誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生較高水平的免疫應(yīng)答，被廣泛應(yīng)用于NoV 疫苗研發(fā)和抗體制備[22]。本研究中，通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，純化后的GZ2015-L335 VLP 可以形成直徑約為30 nm的顆粒，與天然病毒粒子大小相近，表明其可自組裝成病毒樣顆粒[23]。

圖4 毒株GZ2015-L335 VLP 的透射電鏡觀察（40 000×）Fig.4 Observation of the GZ2015-L335 VLP by transmission electron microscopy

2.5 毒株GZ2015-L335 VLP的Western blot鑒定

利用Western blot 對(duì)純化后的GZ2015-L335 VLP進(jìn)行鑒定。結(jié)果如圖5，膜上在58 ku 處有特異性條帶，而野生型桿狀病毒感染組和正常的Sf9 細(xì)胞對(duì)照組都沒有出現(xiàn)特異性條帶，表明純化得到的GZ2015-L335VLP 具有較好的反應(yīng)原性和特異性。而在目標(biāo)蛋白下方出現(xiàn)多條條帶的原因可能是在制樣過程中蛋白質(zhì)發(fā)生了降解所致。

圖5 毒株GZ2015-L335 VLP 的Western blot 鑒定Fig.5 Western blot identification of the norovirus strain GZ2015-L335 VLP

2.6 毒株GZ2015-L335 VLP 的ELISA 鑒定

采用間接ELISA 法，以抗GII.2[P]衣殼P 顆粒血清為一抗，HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG 為二抗對(duì)純化后的VLP進(jìn)行鑒定。ELISA 結(jié)果見圖6，表明GZ2015-L335VLP與抗血清具有較高結(jié)合活性。

圖6 毒株GZ2015-L335 VLP 的ELISA 鑒定Fig.6 ELISA identification of the norovirus strain GZ2015-L335 VLP

2.7 毒株GZ2015-L335 VLP 的受體結(jié)合功能驗(yàn)證

大量研究表明HBGAs 為NoV 的天然受體或協(xié)同因子[24,25]，能促進(jìn)病毒感染宿主細(xì)胞[26]。目前發(fā)現(xiàn)大多數(shù)NoV 基因型的受體結(jié)合模式相似，即與A/B/O 分泌型受體結(jié)合，而與非分泌型受體不結(jié)合[27,28]。本研究將39 份分泌型（A、B、O 和AB）和12 份非分泌型（N）唾液樣品用于分析GZ2015-L335 VLP 與HBGAs的結(jié)合情況。受體結(jié)合功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，重組GZ2015-L335VLP 與A/B/O 等分泌型及非分泌性唾液受體均呈現(xiàn)廣泛的結(jié)合作用，表現(xiàn)出廣泛的受體結(jié)合譜（圖7）。Michael 等[29]通過對(duì)比新現(xiàn)株GII.2[P16]和祖先株GII.2[P2]（即雪山病毒）的進(jìn)化過程，發(fā)現(xiàn)兩者衣殼蛋白序列相似性＞96%，兩種毒株的受體結(jié)合譜也相似，并且體外受體結(jié)合阻斷實(shí)驗(yàn)也顯示衣殼蛋白的輕微變異未對(duì)抗體中和作用造成影響。因此，NoV可通過多種機(jī)制在人群中持續(xù)流行，除衣殼蛋白變異造成受體結(jié)合能力及免疫原性變化外，基因重組也已成為重要驅(qū)動(dòng)力[30]。

圖7 毒株GZ2015-L335 VLP 的受體結(jié)合功能驗(yàn)證Fig.7 Receptor binding function of the norovirus strain GZ2015-L335 VLP

3 結(jié)論

近年來，食源性GII.2 型NoV 逐漸成為中國(guó)及其他國(guó)家NoV 暴發(fā)流行的主要基因型之一[31-35]。系統(tǒng)掌握GII.2 型NoV 進(jìn)化機(jī)制是防控該基因型病毒流行的重要基礎(chǔ)，因此本研究以2015 年在廣州地區(qū)檢出的GII.2[P2]型GZ2015-L335 毒株為對(duì)象，對(duì)其基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行系統(tǒng)分析。此外，利用昆蟲細(xì)胞桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成功制備GII.2[P2]型VLP，并對(duì)其免疫原性和受體結(jié)合功能進(jìn)行了系統(tǒng)研究。SDS-PAGE 結(jié)果表明，重組GII.2[P2]型VP1 蛋白大小與預(yù)期相符。透射電鏡結(jié)果表明，該VP1 蛋白可自組裝成VLP，其形態(tài)大小與天然病毒粒子相似。Western blot和ELISA 結(jié)果顯示，該VLP 與抗GII.2[P]衣殼P 顆粒血清具有較高結(jié)合活性，表明其具有良好的反應(yīng)原性和特異性。此外，受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該VLP 與A/B/O 等分泌型及非分泌性唾液受體均呈現(xiàn)廣泛的結(jié)合作用，表現(xiàn)為人群普遍易感。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果將為食品中NoV 的高效抗體研制及新型檢測(cè)技術(shù)研發(fā)提供支撐，同時(shí)也為進(jìn)一步揭示病毒的流行機(jī)制和監(jiān)測(cè)該毒株的變異特點(diǎn)提供理論數(shù)據(jù)。