周聰聰，趙夢蝶，李松明，馬美湖，金永國，黃茜

（華中農業(yè)大學食品科學技術學院，蛋品加工技術國家地方聯(lián)合工程中心，湖北武漢 430070）

骨組織作為人體結構的重要組成部分，對人體健康具有重要意義，而骨質疏松癥是目前最常見的骨骼病變。骨質疏松是一種以骨密度減少、骨脆性增加為特征，容易引起骨折的全身性骨病。據(jù)報道，年齡在50 歲以上的人群，有近20%的人患有骨質疏松癥等骨骼疾病，且發(fā)病率一直呈現(xiàn)上升趨勢[1]。可以通過增加成骨細胞活性與抑制破骨細胞活性來改善骨質疏松的病理狀態(tài)[2]。

研究發(fā)現(xiàn)，骨髓基質干細胞、成骨細胞和破骨細胞在骨組織的正常生長和代謝中有重要作用，它們會形成一個動態(tài)平衡的生物過程，即成骨細胞分泌特征因子調節(jié)如：膠原蛋白、堿性磷酸酶、骨鈣素和其他骨基質蛋白來誘導骨生成和破骨細胞相關因子調節(jié)誘導骨吸收[3-5]，在這個過程中，若生骨量少于被吸收骨量，骨總量丟失，則會引起骨質疏松癥[6]。這些過程受到雌激素、核因子κB 受體激活配體（RANKL）/骨保護素（OPG）通路、活性氧（ROS）、多種生長因子和其他相關激酶信號轉導通路的調控[7]。

卵黃高磷蛋白（PV）是磷酸化程度最高的蛋白質。由于卵生動物的胚胎骨骼在發(fā)育過程中所需要的磷元素主要由卵內的卵黃提供，因此卵黃高磷蛋白PV 與卵生動物的骨礦化過程關系密切。PV 經(jīng)過酶解后形成的一種短肽物質是卵黃高磷蛋白磷酸肽（PPP），PPP 因其多聚陰離子的結構表現(xiàn)出獨特的金屬螯合、抗氧化、乳化等特性[8]。已有實驗證明PPP 可顯著提高生長期大鼠的鈣吸收[9]。牛奶中的酪蛋白磷酸肽（CPP）作為一種已知的磷酸肽補鈣制劑，能夠促進嬰幼兒對鈣元素的吸收，作為一種新型功能性食品添加劑，已被廣泛添加到嬰幼兒奶粉和保健食品當中[10]。PV 是自然界中磷酸化程度最高的蛋白質，更多的磷酸基團使PPP 具有比CPP 更強的持鈣能力[11]。目前，PPP 的研究還處在實驗室階段，有望發(fā)展成為一種新型的食品添加劑。

前期實驗室已證實PV 和PPP 能促進MC3T3-E1細胞增殖、分化和礦化結節(jié)的形成[12]。還研究了PV 對破骨前體細胞RAW264.7 的作用機制，主要是通過下調TRAP 的分泌活性來影響RAW264.7 細胞分化形成破骨細胞[13]。但關于PV 和PPP 在成骨細胞和破骨細胞共培育體系中作用還未見報道。通過測定AKP、TRAP 因子的分泌，以及成骨細胞中RANKL/OPG 通路的RT-PCR 表達量，進一步研究PPP 和PPP-Ca 在共培養(yǎng)體系中對成骨細胞分化的影響。為在細胞水平上更好的模擬體內骨細胞相互作用的微環(huán)境，本研究建立了MC3T3-E1-RAW264.7 細胞共培養(yǎng)體系，以便進一步探索PPP和PPP-Ca在共培養(yǎng)體系中對成骨細胞分化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

PV 由實驗室制得。成骨細胞（MC3T3-E1 cells）和破骨前體細胞（RAW264.7 cells），由武漢普諾賽生命科技有限公司提供。

1.1.2 試劑與藥品

醫(yī)用酒精、KBr、NaOH、CaCl2，國藥集團化學試劑有限公司；青霉素、鏈霉素、α-DMEM 培養(yǎng)基，美國HYCLONE 公司；胰蛋白酶（EC 3.4.4.4）、磷酸二氫鉀、HEPES、MTT、二甲基亞砜，美國SIGMA 公司；胎牛血清、0.25%胰酶-EDTA，澳洲GIBCO 公司；TRAP 染液、TRAP 活性試劑盒、堿性磷酸酶（AKP）試劑盒，南京建成生物有限公司。

1.1.3 儀器與設備

HERAcell 1501 二氧化碳培養(yǎng)箱，德國Thermo Scientific 公司；IX71 熒光倒置顯微鏡，日本Olympus公司；MS104S/01 分析天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；iMark 酶標儀，聯(lián)想生物科技有限公司；TDL-50B 臺式低速離心機，上海安亭科學儀器廠；Option S7 超純水系統(tǒng)，英國ELGA 公司；DL-CJ-2ND超凈工作臺，哈爾濱東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司；HH-4數(shù)顯電子恒溫水浴鍋，鞏義市予華儀器有限責任公司；EDC-810 RT-PCR 儀，東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；QuantStudio 6 實時熒光定量PCR 儀，ABI；Nano-100微量分光光度計，杭州奧盛儀器有限公司；LS-100HD高壓滅菌鍋，江陰濱江醫(yī)療設備有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 溶液配制

細胞凍存液：按照DMEM:胎牛血清:DMSO=6:3:1 的體積比配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。

完全培養(yǎng)基（m/m）：89%的DMEM，10%的胎牛血清，1%的雙抗（100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素）。0.22 μm 無菌濾膜過濾，4 ℃儲存。

成骨分化培養(yǎng)基：含有50 μg/mL 的L-抗壞血酸和10 mmol/L 的β-甘油磷酸鈉的完全培養(yǎng)基。

1.2.2 PV、PPP、PPP-Ca 的制備

PV 的提取參照文獻方法，主要為加入2 倍體積的蒸餾水稀釋蛋黃液后，離心分離，收集下層沉淀。用4倍質量體積比的m=10% NaCl 和0.06 mol/L NaOH（pH值11.3～11.5）溶液均質沉淀5 min，再用5 mol/L HCl調節(jié)pH 值到3.5～4.0，加入3 倍體積的水離心，收集上清液。超濾脫鹽，離心后將上清液凍干得到PV[14]。

前期實驗室已通過單因素實驗確定了嗜熱菌蛋白酶的加酶量2 000 U/g、酶解時間24 h、復合酶解順序（先胰蛋白酶后嗜熱菌蛋白酶復合酶解）時鈣螯合率最高并優(yōu)化了PPP-Ca 的螯合條件（pH 值9.5，肽鈣比7:1）[15]。PPP 的制備參照文獻方法并加以修改，通過高溫中壓（HTMP）對PV 溶液進行預處理。配制10 mg/mL 的PV 溶液，調節(jié)pH 值6.5 后利用高壓滅菌設備對PV 進行HTMP 處理，HTMP 預處理的條件為：溫度121 ℃、壓力0.1 MPa、時間30 min[16]。選擇胰蛋白酶和嗜熱菌蛋白酶復合酶解制備PPP，按照酶與底物比為1:50（m/m）加入胰蛋白酶，調節(jié)pH 值8.0，在37 ℃下酶解8 h。隨后樣品在100 ℃下水浴滅酶10 min。滅酶后再用嗜熱菌蛋白酶對PV 進行酶解，按照酶與蛋白比為2 000 U/g 加入胰蛋白酶，調節(jié)pH 值6.8，在68 ℃下酶解24 h。進一步在100 ℃下水浴滅酶10 min 后凍干得到PPP。

將凍干后得到的PPP 溶于去離子水，配制成10 mg/mL 的溶液，以多肽與鈣質量比7:1 的比例加入0.1 mol/L CaCl2混勻，調節(jié)pH值9.5，室溫下反應30 min得到PPP-Ca。

1.2.3 細胞培養(yǎng)

對MC3T3-E1，加入m=0.25%胰酶37 ℃消化3 min，用完全培養(yǎng)基終止消化；對RAW264.7，加入完全培養(yǎng)基，用細胞刮刀將貼壁的RAW264.7 細胞刮下，后續(xù)兩種細胞分別按照1:2 比例分瓶，補加3 mL 完全培養(yǎng)基，于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞復蘇后培養(yǎng)3～5 代，此時細胞活力上升，處于生長對數(shù)期，可進行實驗操作。

1.2.4 MTT 法測細胞毒性

試驗分為四組：①空白組：培養(yǎng)液+MTT 溶液；②對照組：培養(yǎng)液+MTT 溶液+細胞；③給藥組1：PPP（1、2、4、8 mg/mL）+培養(yǎng)液+MTT 溶液+細胞；④給藥組2：PPP-Ca（1、2、4、8 mg/mL）+培養(yǎng)液+MTT 溶液+細胞。

取對數(shù)生長期的MC3T3-E1 和RAW264.7 細胞，以每毫升3×104～5×104個的細胞懸濁液100 μL 放入96孔培養(yǎng)板中，放置在37 ℃，5% CO2，濕度90%的培養(yǎng)箱中培育24 h，細胞貼壁后換液，分別加入含有不同質量濃度的樣品的培養(yǎng)基100 μL（添加樣品前經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾）。培養(yǎng)24 h 結束后，吸棄舊培養(yǎng)基，每孔加入含有0.5 mg/mL 的MTT 的無血清培養(yǎng)液MEM 200 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，盡可能的吸去上清液，每孔加入150 μL DMSO，室溫下在搖床上震蕩10 min，充分混勻并溶解藍紫色的甲臜顆粒。在酶聯(lián)免疫檢測儀上選擇570 nm 波長，測定各孔吸光度值。實驗重復3 次，取平均值。按以下公式計算細胞增殖率（B，%）：

式中：

As——實驗組吸光度值；

Ac——對照組吸光度值；

Ab——空白組吸光度值。

1.2.5 MC3T3-E1 與RAW264.7 共培養(yǎng)的建立

用含成骨誘導劑（抗壞血酸50 μg/mL、β-甘油磷酸鈉10 mmol/L）以及m=10%胎牛血清、m=1%青霉素和m=1%鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃含體積分數(shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中。隔天換液1 次，待分化為成熟的成骨細胞。

MC3T3-E1 細胞與RAW264.7 細胞以1:1（成骨細胞的種植密度為每毫升5×104個，破骨細胞為每毫升5×104個）和2:1（成骨細胞的種植密度為每毫升1×105個，破骨細胞為每毫升5×104個）的比例共同接種于6孔板。置于37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中。成骨細胞分泌的RANKL 因子能促使RAW264.7 單核巨噬細胞向多核的破骨細胞分化，培養(yǎng)7 d，對破骨細胞進行鑒定。

1.2.6 破骨細胞的鑒定

按照TRAP 染色試劑盒說明書進行染色，將細胞用PBS 緩沖液沖洗后晾干，TRAP 固定液4 ℃固定30 s～3 min，水洗，放置3 min，加入TRAP 孵育液，置于37 ℃溫箱，避光侵染45～60 min，水洗。蘇木素復染3 min，水洗，晾干，鏡下觀察。TRAP 能夠將破骨細胞的細胞質染為酒紅色，鑒定為破骨細胞。

1.2.7 抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）活性測定

接種后，每2 d 更換新鮮培養(yǎng)基一次并添加不同濃度的PPP 和PPP-Ca，共培養(yǎng)7 d 后，收集細胞培養(yǎng)液，1 000 r/min 離心10 min，去除細胞沉淀后，進行抗酒石酸酸性磷酸酶活性檢測。按照試劑盒說明書操作，依次加入檢測緩沖液、顯色底物和培養(yǎng)基上清，充分混勻后37 ℃下反應30 min，取出加入終止液終止其反應，于530 nm 處，光徑1 cm，測定其吸光度。

式中：

u——TRAP 活力，U/L；

ε——呈色物微摩爾消光系數(shù)，為12.8×10-3L·μmol-1·cm-1；

l——比色光徑，cm；

t——反應時間，s；

V0——反應液總體積，L；

V1——取樣量，L；

OD1——測定OD值；

OD0——對照OD值。

1.2.8 堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，AKP）活性檢測

選擇共培養(yǎng)7 d 后，收集細胞培養(yǎng)液上清，1 000 r/min 離心10 min 去除細胞沉淀后，進行AKP 活性檢測。按照AKP 活性試劑盒說明書操作，依次加入檢測緩沖液、顯色底物和培養(yǎng)基上清，充分混勻后37 ℃下孵育30 min，取出加入終止液終止其反應，于405 nm處測定其吸光度。

1.2.9 MC3T3-E1 成骨細胞和RAW264.7 巨噬細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)的蛋白基因RT-PCR

首先通過Trizol 法提取RNA，在細胞樣品中加入1 mL Trizol 試劑，用槍吹打混勻，移至無RNase 的1.5 mL EP 管中，裂解10 min。按照試劑盒說明書提取總RNA 后，放于-80 ℃冰箱內保存以備用。接著RT逆轉錄成cDNA，最后實時熒光定量PCR 檢測?；驒z測使用引物序列如表1 所示。

表1 引物序列表Table 1 Primer sequence

1.2.10 數(shù)據(jù)處理

所有試驗數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 軟件進行單因素方差分析，采用鄧肯分析法進行差異性分析，p＜0.05為差異顯著。使用Origin 軟件作圖。

2 結果與討論

2.1 細胞毒性試驗

從圖1 可知，MC3T3-E1 細胞（a）在經(jīng)過PPP 處理24 h 后，細胞活性分別為95.53%、95.25%、94.79%、92.93%，經(jīng)過PPP-Ca 處理后，細胞活性分別為94.49%、93.11%、93.00%、92.68%；RAW264.7 細胞（b）在經(jīng)過PPP 處理后，細胞活性分別為95.35%、95.70%、92.88%、92.23%，經(jīng)過PPP-Ca 處理后，細胞活性分別為96.78%、95.70%、93.10%、92.82%。細胞活性均呈現(xiàn)下降趨勢，但兩種細胞的細胞活性均高于85%，說明PPP 和PPP-Ca 對MC3T3-E1 細胞和RAW264.7 細胞沒有明顯的毒性作用，可用于后續(xù)試驗。

圖1 不同質量濃度PPP 和PPP-Ca 對MC3T3-E1（a）細胞和RAW264.7（b）細胞的細胞毒性作用Fig.1 Cytotoxic effects of different concentrations of PPP and PPP-Ca on MC3T3-E1 (a) cells and RAW264.7 cells (b)

2.2 抗酒石酸酸性磷酸酶染色

倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)MC3T3-E1 細胞的細胞形態(tài)是貼壁的纖維狀，而RAW264.7 細胞在未分化前是圓形，分化后形成破骨細胞。進行TRAP 染色可以觀察到RAW264.7 細胞分化形成破骨細胞的形態(tài)變化。

如圖2 所示，MC3T3-E1 細胞和RAW264.7 細胞的共培養(yǎng)體系中，RAW264.7 細胞體積增大，分化形成破骨細胞。這是由于MC3T3-E1 分泌的RANKL 因子可以通過 OPG/RANKL/RANK 通路將信號傳遞給RAW264.7 細胞，進而調節(jié)RAW264.7 細胞的分化，促使RAW264.7 單核的巨噬細胞向多核的破骨細胞分化。介怡琳[17]也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象：TRAP 染色后，細胞的體積變大，有三個以上的細胞核，有棕褐色的顆粒出現(xiàn)在細胞質中。楊興等[18]也觀察到了在共培養(yǎng)體系建立后，RAW264.7 細胞發(fā)生融合，體積變大，分化為了破骨細胞。

圖2 MC3T3-E1 細胞和RAW264.7 細胞共培養(yǎng)的TRAP 染色Fig.2 TRAP staining of MC3T3-E1 cells and RAW264.7 cells co-cultured

2.3 堿性磷酸酶活性測定

堿性磷酸酶（AKP）是成骨細胞早期分化階段分泌的標志酶，在分化后期可水解有機磷酸酯釋放出游離磷酸鹽與鈣結合促進骨礦化的形成[19]。成骨細胞AKP 活性檢測結果如圖3 所示，在單一MC3T3-E1 成骨細胞中，PPP 和PPP-Ca 組的AKP 活性分別為2.07 金氏單位/100 mL 和2.13 金氏單位/100 mL，顯著高于對照組的1.89 金氏單位/100 mL，這表明PPP 和PPP-Ca 處理可以促進成骨細胞AKP 的分泌。一方面，PPP 和PPP-Ca 中更多的磷酸基團增強了與MC3T3-E1細胞的相互作用，并通過MC3T3-E1 細胞表面受體介導的方式觸發(fā)了信號的轉化，刺激成骨細胞分化；另一方面，這可能是因為Ca2+與PPP 表面的磷酸基團結合，并與為MC3T3-E1 細胞發(fā)生相互作用，為細胞礦化提供了大量的成核位點，從而加速了MC3T3-E1 細胞的礦化[12]。類似的研究發(fā)現(xiàn)，加入0.1、0.3、1.0 mg/mL的卵黃高磷蛋白后，堿性磷酸酶表達增加[20]。在MC3T3-E1 細胞與RAW264.7 細胞（1:1）的共培養(yǎng)體系中，對照組的AKP 活性為2.06 金氏單位/100 mL，經(jīng)過PPP 和PPP-Ca 處理的AKP 活性上升到2.39 金氏單位/100 mL 和2.79 金氏單位/100 mL。MC3T3-E1 細胞與RAW264.7 細胞（2:1）的共培養(yǎng)體系中，AKP 活性表現(xiàn)出相同的趨勢。這說明，PPP 和PPP-Ca 可能通過增加 AKP 的活性，進而誘導共培育體系中MC3T3-E1 細胞分化，并有利于后期的礦化。單一MC3T3-E1 細胞和MC3T3-E1 細胞與RAW264.7 細胞共培養(yǎng)體系之間的AKP 活性沒有太大差異，表明在成骨細胞早期分化過程中，破骨前體細胞對成骨細胞并無顯著性的影響。

圖3 PPP 和PPP-Ca 對MC3T3-E1 細胞和RAW264.7 細胞共培養(yǎng)體系中AKP 活性的影響Fig.3 Effect of PPP and PPP-Ca on AKP activity in MC3T3-E1 cells and RAW264.7 cells co-culture system

2.4 TRAP 活力測定

破骨前體細胞RAW264.7 細胞在形成破骨細胞后會分泌TRAP 酶，因此，可用TRAP 酶活表示破骨細胞活性[21]。圖4 表明無論是在單一RAW264.7 細胞中，還是MC3T3-E1 細胞和RAW264.7 細胞的共培養(yǎng)體系中，樣品處理組的TRAP 酶活力顯著低于對照組，表明PPP 和PPP-Ca，均可顯著降低TRAP 的活性。有研究表明，PV 同樣可以抑制RAW264.7 的分化，從而使TRAP 酶活降低[13]。

圖4 PPP 和PPP-Ca 對MC3T3-E1 細胞和RAW264.7 細胞共培養(yǎng)體系中TRAP 活性的影響Fig.4 Effect of PPP and PPP-Ca on TRAP activity in MC3T3-E1 cells and RAW264.7 cells Co-culture system

在單一RAW264.7 細胞組中，空白組中對照的TRAP 活性為5.78 U/L，添加PPP 和PPP-Ca 的細胞TRAP 活性下降為3.01 U/L 和3.32 U/L，分別降低了48%和43%。在人體骨重建過程中，MC3T3-E1 細胞能分泌破骨細胞因子[6]，從而影響破骨細胞的生理活性。結果顯示，在MC3T3-E1 細胞與RAW264.7 細胞（1:1）的共培養(yǎng)體系中，對照組的TRAP 值為4.26 U/L，低于單一RAW264.7 細胞的對照組TRAP 活性，表明共培育體系中的MC3T3-E1 細胞會對RAW264.7 細胞分泌TRAP 產生影響，添加了PPP 和PPP-Ca 的共培育組，TRAP 值進一步減低到2.69 U/L和2.46 U/L。MC3T3-E1細胞與RAW264.7 細胞（2:1）的共培養(yǎng)體系中，PPP和PPP-Ca 的加入，使TRAP 活性從5.08 U/L 降低至1.72 U/L 和1.60 U/L，降幅達到66%和69%，比1:1 體系的降幅更大。類似研究發(fā)現(xiàn)，在MC3T3-E1 與RAW264.7 的共培養(yǎng)條件下，添加不同濃度的牛乳蛋白（20、100、500 μg/mL）后，共培養(yǎng)體系中的TRAP 活性呈現(xiàn)先上升后下降的變化，20、100、500 μg/mL 的TRAP活性分別為對照組的187.8%、168.9%與25.6%[22]。

2.5 PPP 和PPP-Ca 對共培養(yǎng)體系中MC3T3-E1細胞的OPG和RANKL基因mRNA表達的影響

通過RT-PCR 技術檢測在MC3T3-E1 和RAW264.7細胞的共培養(yǎng)體系中成骨細胞骨保護素（OPG）、核因子κB 受體活化因子配體（RANKL）基因mRNA 表達量[23]。圖5a 中可看出共培養(yǎng)7 d 后，單一MC3T3-E1細胞組中，PPP 和PPP-Ca 組的OPG mRNA 表達量分別為1.25 和1.39，高于對照組0.92，表明PPP 和PPP-Ca能促進OPG 基因的表達。同樣如圖5b 所示，在單一MC3T3-E1 培養(yǎng)體系中，PPP 和PPP-Ca 組的RANKL基因表達量為1.23 和1.45，高于對照組1.00。在共培養(yǎng)體系中，OPG 的表達量顯著低于單一MC3T3-E1 細胞體系中的，說明RAW264.7 能抑制MC3T3-E1 細胞OPG mRNA 的表達。這是因為在共培養(yǎng)體系中，受到RAW264.7 破骨前體細胞的刺激，成骨細胞分泌RANKL，并通過與破骨前體細胞RAW264.7 表面受體RANK 結合，刺激破骨細胞的分化，從而影響成骨細胞的增殖。因此，在共培養(yǎng)體系中OPG 表達量比單一成骨細胞中低。但相較于共培養(yǎng)的空白對照組，PPP和PPP-Ca 仍提高了共培養(yǎng)體系的OPG 和RANKL mRNA 的表達量，這表明PPP 和PPP-Ca 在單一體系和共培養(yǎng)體系中均能促進OPG 和RANKL 的表達。

圖5 a：PPP 和PPP-Ca 對MC3T3-E1 細胞和RAW264.7 細胞共培養(yǎng)體系中成骨細胞中OPG 和RANKL mRNA 的表達量的影響；b：OPG 與RANKL 的比值；c：OPG m RNA 的電泳圖；d：RANKL mRNA 的電泳圖Fig.5 a: Effects of PPP and PPP-Ca on the expression of OPG and RANKL m RNA in osteoblast in co-culture system of MC3T3-E1 cells and RAW264.7 cells;b: OPG to RANKL ratio;c: Run plastic figure of OPG m RNA;d: Run plastic figure of RANKL m RNA

OPG 能抑制破骨細胞的形成和分化，誘導破骨細胞凋亡[24]。OPG 和RANKL 基因mRNA 的表達水平能反應出對破骨細胞的調控情況，OPG/RANKL 比值高，抑制破骨細胞分化；OPG/RANKL 比值低，促進破骨細胞分化[25]。此外，共培養(yǎng)體系中，空白組、PPP 和PPP-Ca 處理下OPG 與RANKL 的比值為0.09、0.16、0.18，呈現(xiàn)上升的趨勢，表明PPP 和PPP-Ca 處理能夠增強對破骨細胞分化的抑制作用。介怡琳的研究表明，卵黃高磷蛋白能通過上調OPG/RANKL 的比例從而對RANKL 和OPG 的表達產生積極影響[17]。Li 等[26]也發(fā)現(xiàn)松果菊苷可以通過上調OPG/RANKL 的比值來促進成骨細胞的增殖和分化。

3 結論

PPP 和PPP-Ca 可以顯著提高單一MC3T3-E1 體系中的AKP 活性；顯著降低單一RAW264.7 體系中的TRAP 活性。無論是在單一體系還是共培育體系中，PPP及其鈣處理后，成骨細胞OPG、RANKL mRNA 的表達量明顯提高，表明磷酸肽及其鈣螯合物能促進成骨細胞的分化，抑制破骨細胞的活性。該研究為進一步探索磷酸肽在多細胞模型體系中的作用提供了研究基礎，同時為磷酸肽的功能活性開發(fā)提供理論依據(jù)。后期將進一步研究PPP 和PPP-Ca 在小腸上皮細胞、成骨細胞和破骨細胞等三細胞體系中的對細胞生理活性的影響，明確其作用機制。