謝世英，趙英源,* ,薛文杰，周婧婕，謝思凡，王雪琴，張慧茹，小田裕昭

（1.河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，河南鄭州 450001）（2.名古屋大學(xué)大學(xué)院生命農(nóng)學(xué)研究科，愛知名古屋464-8601）（3.河南工業(yè)大學(xué)國際教育學(xué)院，河南鄭州 450001）

藥物的生物利用度（Bioavailability）是指藥物分子進(jìn)入機(jī)體后，從介質(zhì)中釋放的活性成分經(jīng)口腔、胃、腸消化后被小腸上皮細(xì)胞吸收進(jìn)入人體循環(huán)的程度，反映所給藥物進(jìn)入人體循環(huán)的比例[1,2]。藥物經(jīng)口服后在人體內(nèi)的消化過程如圖1 所示[3]，其生物利用度體現(xiàn)了機(jī)體物理化學(xué)和生化過程的復(fù)雜性，主要包括藥物成分從介質(zhì)中釋放、吸收、分布、代謝和排泄等過程。藥物經(jīng)攝入發(fā)揮藥效需要克服人類機(jī)體的天然屏障，以藥物經(jīng)口服給藥為例：首先，藥物進(jìn)入胃部的強(qiáng)酸性環(huán)境，接觸胃蛋白酶的酶解系統(tǒng)；其次，藥物通過十二指腸進(jìn)入小腸，即進(jìn)入人體的主要酶系消化場所；在經(jīng)歷了人體的兩個主要消化部位后，藥物需要被小腸中的腸上皮細(xì)胞吸收，才能到達(dá)血液送至靶細(xì)胞[4]。良好生物利用度的前提是具有充足的藥物分子被小腸上皮細(xì)胞吸收并輸送至人體循環(huán)，小腸上皮細(xì)胞對藥物的吸收量可通過生物可給率進(jìn)行評估。生物可給率（Bioaccessibility）是指生物活性制劑進(jìn)入機(jī)體后，可被小腸上皮細(xì)胞吸收的活性成分的量[5]。然而在目前技術(shù)條件下，尚無較為準(zhǔn)確可靠的方法進(jìn)行藥物體內(nèi)生物可給率測定；為此，研究人員開發(fā)了技術(shù)成熟且可靠的體外模擬藥物釋放法，用以探究活性成分在人體內(nèi)的釋放動力學(xué)，獲得相應(yīng)的生物可給率，為藥物生物利用度的研究提供重要依據(jù)[6]。

圖1 藥物和食物等經(jīng)口服后在人體內(nèi)的消化過程[3]Fig.1 The digestion process of drugs and food in the body after oral administration[3]

大多數(shù)天然或化學(xué)合成藥物分子因其結(jié)構(gòu)特殊性而不易穩(wěn)定存在、水分散性弱、不耐酸堿、對光和熱敏感[7]。由于首過效應(yīng)，這些藥物分子進(jìn)入體內(nèi)往往僅有很少部分能夠順利進(jìn)入體循環(huán)作用于全身，導(dǎo)致了生物利用度低，從而限制了它們在各方面的應(yīng)用。納米技術(shù)的興起和不斷發(fā)展，為活性分子的有效應(yīng)用開辟了新路徑，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、生物等領(lǐng)域。納米藥物遞送系統(tǒng)是指由大小為1～100 nm 的天然或合成的高分子和無機(jī)納米載體，以不同的形式形成的載藥納米分散系統(tǒng)，該載體系統(tǒng)具有良好的生物相容性[8,9]。經(jīng)過幾十年的發(fā)展，載藥載體在種類、數(shù)目、功能及藥物研發(fā)領(lǐng)域的應(yīng)用具有重大的突破。目前納米載體的種類及數(shù)目發(fā)展由最早開始研究的納米脂質(zhì)體擴(kuò)充到納米凝膠、聚合物膠束、樹枝狀聚合物、納米磁性顆粒[10]，除此之外還包括當(dāng)下較為流行的可對溫度、pH 值、酸堿、磁場等具有智能響應(yīng)型的納米載體[11,12]。

本論文以納米載體藥物為前提，對藥物生物利用度的藥物緩釋模型、體外模擬消化模型、細(xì)胞模型和體內(nèi)藥物代謝動力學(xué)等方法進(jìn)行總結(jié)，同時探討提高生物利用度的方法和今后應(yīng)用展望。

1 生物利用度的研究模型

藥物經(jīng)納米載體遞送到達(dá)體內(nèi)發(fā)揮藥效，首先需從制劑中充分釋放，因此藥物分子的生物可給率是研究生物利用度和藥代動力學(xué)的重要基礎(chǔ)。生物可給率常用的定量方法為體外模擬釋放。生物利用度的定量方法可簡單分為體外（in vitro）和體內(nèi)（in vivo）兩類，體外研究方法常見為體外模擬消化和細(xì)胞模型，體內(nèi)研究方法即測定活性分子的動物體內(nèi)藥物代謝動力學(xué)。

1.1 模擬藥物釋放模型

藥物釋放是指在規(guī)定條件下，藥物從緩釋制劑、控釋制劑、腸溶制劑及透皮貼劑等制劑中釋放的程度[13]。藥物活性成分自口腔到達(dá)胃腸道后必須從載體基質(zhì)中釋放并溶解在生物體內(nèi)部環(huán)境溶液中，與溶液中的成分相互作用從而被小腸上皮細(xì)胞吸收；而納米載體的材料、物理化學(xué)特性（形態(tài)、大小、電荷、負(fù)載程度等）以及消化酶系等均會影響活性成分的釋放[3]。目前可通過模擬藥物釋放獲取藥物的釋放動力學(xué)，常用的納米載體體外模擬藥物緩釋的檢測方法有：透析袋法和反向透析袋法[14]、擴(kuò)散池法[15]、流通池法[16]、外翻腸囊法[17]和樣品分離分析法[18]等，其中樣品分離分析法又包括離心/超速離心法攪拌法、超濾法和離心法等[19]。

體外模擬藥物釋放試驗(yàn)中，應(yīng)盡可能減小納米載體對藥物成分分析的影響。透析袋法（Dialysis Bag Method）可以巧妙解決藥物釋放后藥物與載體的分離問題，是目前最為常用的藥物緩釋試驗(yàn)方法[14]。透析袋通常是由人工或生物半透膜制成的袋狀，透析袋膜的相對分子質(zhì)量和內(nèi)外釋放介質(zhì)體積的比例是透析袋法檢測成功的主要影響因素[20]。不同規(guī)格的透析袋具有不同的截流分子量（Molecular Weight Cut-off，MWCO），可截留特定大小的分子，分子量較小的物質(zhì)可透過膜孔不斷擴(kuò)散至透析膜外，直到袋內(nèi)外兩邊的濃度達(dá)到平衡為止；因此，可利用透析袋這一特性充分分離載體與被釋放的藥物，一般試驗(yàn)要求MWCO 約為藥物分子大小的100 倍[21]。常見的透析袋法是將待測物質(zhì)加入裝有釋放介質(zhì)的透析袋內(nèi)，藥物透過透析膜進(jìn)入外部釋放容器后進(jìn)行取樣檢測，如圖2a 所示[20]。該方法具有取樣方便、能夠及時分離藥物分子與載體等優(yōu)點(diǎn)，但攪拌裝置在運(yùn)行狀態(tài)無法充分?jǐn)嚢柰肝龃鼉?nèi)部，無法充分模擬體內(nèi)的蠕動狀況。Kumar 等[22]在研究聚乙二醇化低分子量殼聚糖包載百里香醌的納米膠囊時，采用透析法進(jìn)行體外藥物釋放測定，并設(shè)計不同pH 值（胃部pH 值～1.5 和血液pH 值～7.4）的緩沖介質(zhì)進(jìn)行對照分析，其研究結(jié)果顯示該納米體系緩釋性能良好，且在血液中的緩釋性能優(yōu)于胃部。反向透析袋法（Reverse Dialysis Bag Method）與常規(guī)的透析袋法相反，將待測物質(zhì)分散在外部釋放介質(zhì)容器中，釋放出的藥物分子進(jìn)入透析袋，檢測樣品分時段取自透析袋內(nèi)部，同時立即添加等量的釋放介質(zhì)[14]，如圖2b 所示[20]。相對于常規(guī)透析法，反向透析法中的待測物質(zhì)可以得到充分地釋放和稀釋，并擴(kuò)散至內(nèi)部環(huán)境，但取樣較為繁瑣[23]。

圖2 透析袋法(a)和反向透析袋法示意圖(b)[20]Fig.2 Diagram of dialysis bag method (a) and reverse dialysis bag method (b)[20]

擴(kuò)散池法（Diffusion Cell Method）由接受池（Acceptance Cell）和供給池（Supply Cell）組成，兩池之間通過天然生物膜或人工合成膜隔開[15,19]，如圖3所示[24]。擴(kuò)散池包括立式、臥式和流通式擴(kuò)散池三種，其中立式擴(kuò)散池在藥物遞送系統(tǒng)領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛[24]。根據(jù)立式擴(kuò)散池配置的不同可以分為Franz 擴(kuò)散池、K-C 擴(kuò)散池（Keshary-Chien）和J-L（Jhawar-Lordi）擴(kuò)散池[15]。K-C 擴(kuò)散池在接收池內(nèi)設(shè)有攪拌系統(tǒng)用以提高流體混合效率，從而增加受體室中溶解介質(zhì)體積較大（＞15 mL）時的內(nèi)容物均勻性，是為克服Franz擴(kuò)散池的溶液流體動力學(xué)差、混合差以及供給池與接收池之間的溫度差等局限性而設(shè)計；J-L 擴(kuò)散池是在Franz 擴(kuò)散池的基礎(chǔ)上擴(kuò)大化，配備有1 L 的USP 溶解容器作為接收池，大大增加了有效接觸面積，其研發(fā)主要應(yīng)用于栓劑藥物的溶出度試驗(yàn)[15]。目前，擴(kuò)散池法多用于局部給藥和經(jīng)皮給藥等藥物的藥物緩釋性能測試或藥物透皮性能測試[15,25]。該法可通過選用不同的生物皮膚或膜，模擬和測量藥物在不同階段的吸收和代謝狀況；但離體后的生物組織不易保存，且過度處理會損壞膜性能，從而影響試驗(yàn)結(jié)果[15,24]。

圖3 立式Franz 擴(kuò)散池示意圖[24]Fig.3 Diagram of vertical Franz diffusion cell[24]

外翻腸囊法（Everted-Gut Technique）是通過體外孵育小腸研究營養(yǎng)物質(zhì)、藥物等在腸管吸收情況的一種實(shí)驗(yàn)技術(shù)[26]。首先取麻醉實(shí)驗(yàn)動物一段小腸，將其黏膜外翻，兩端結(jié)扎，內(nèi)充以適量液體；隨后，置于待測樣品溶液中進(jìn)行孵育，在固定的時間間隔從腸道兩側(cè)取樣，以確定藥物的擴(kuò)散率[14,26]。該方法可在真實(shí)的小腸環(huán)境模擬藥物的吸收狀況，為避免小腸組織活性喪失，應(yīng)提供與正常的生理環(huán)境相似的培養(yǎng)液、適當(dāng)?shù)臏囟扰c振搖速度、通氣等培養(yǎng)條件；具有操作簡單、可控、重復(fù)性高等特點(diǎn)[27]；但仍存在不足，例如試驗(yàn)要求在短時間內(nèi)完成、外翻過程易損壞腸道組織形態(tài)，且離體后的組織脫離了機(jī)體的完整調(diào)節(jié)系統(tǒng)，導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果與實(shí)際存在差異[14,28]。

樣品分離分析法（Sample Separation Method）通過各種分離技術(shù)將藥物與載體分離，在預(yù)定的時間間隔內(nèi)將納米顆粒從連續(xù)相中分離出，定期取上清液濾液進(jìn)行累積藥物釋放量分析[18]。相關(guān)的分離技術(shù)包括離心攪拌法、超速離心攪拌法、超濾法和離心超濾法[18,19]。樣品在分離過程中存在的機(jī)械力可能會破壞載體結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致藥物的過度釋放，從而與實(shí)際藥物釋放率存在較大差異；且過濾器過濾作為樣品分離技術(shù)使用時，易引起過濾器堵塞和藥物吸附到過濾器表面[19,21]。

藥物溶出度（Drug Dissolution）是指在規(guī)定的溶劑和條件下，藥物從片劑、膠囊劑、顆粒劑等固體制劑中溶出的程度[13]。根據(jù)美國藥典（United States Pharmacopoeia，USP）和藥品食品監(jiān)督管理局（Drug and Food Administration，F(xiàn)DA）規(guī)定，可用于藥物溶出度檢測的試驗(yàn)設(shè)備包括往復(fù)式圓筒、流通池、槳葉式圓盤、旋轉(zhuǎn)圓筒和往復(fù)式支架式裝置等[29]。其中流通池法（Flow-Through Cell）是一種新型溶出度檢查方法，同時可以用于獲得藥物的釋放曲線[15]。該方法不僅在傳統(tǒng)劑型（粉劑、顆粒劑、片劑、膠囊、腸溶片、栓劑和可注射混懸劑）中得到廣泛應(yīng)用，在貼劑、微球、藥物釋放支架、混懸劑、植入劑、納米粒及脂質(zhì)體等新劑型中的應(yīng)用也逐漸普及[21,29]。流通池設(shè)備由儲存器、用于溶解介質(zhì)的泵、流動池和一個將溶解介質(zhì)保持在（37±0.5）℃的水浴裝置組成。試驗(yàn)時將待測樣品放入流動池中，釋放介質(zhì)由泵流過該池，從載體中釋放出的藥物分子流過流動池中的過濾器，可通過在線或離線監(jiān)測藥物釋放量；試驗(yàn)過程中介質(zhì)的成分、pH值、流速可以根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行改變，以更有效地模擬體內(nèi)流體動力學(xué)[20,29]。但它的不足之處是設(shè)備維護(hù)昂貴，過濾器容易發(fā)生堵塞；若儀器出現(xiàn)故障，則需花費(fèi)大量時間維修，從而影響試驗(yàn)進(jìn)行。

1.2 模擬胃腸道消化模型

消化道是一個非常重要的人體結(jié)構(gòu)，日常營養(yǎng)素與藥物的攝取都需要依靠它。其整體可看作一個開放的管道，全長自口腔至肛門約8～9 m，由口腔、咽、食道、胃和小腸和大腸組成[30]。在食品、生物、醫(yī)藥等領(lǐng)域研發(fā)初期，常需要進(jìn)行生物利用度試驗(yàn)對活性物質(zhì)進(jìn)行初步有效性判斷。而胃腸道消化是最為關(guān)鍵的步驟，體內(nèi)消化試驗(yàn)需在動物體內(nèi)或人體內(nèi)進(jìn)行，往往存在實(shí)驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)性差、耗時耗資、取樣困難、以及人道倫理等問題[31]。因此，科研人員開發(fā)了各種體外模擬胃腸道消化模型，從人體或動物受試者體內(nèi)獲得食物的轉(zhuǎn)運(yùn)時間、酶的種類、各組織器官的pH 值曲線、溫度、收縮和蠕動、消化分泌率以及通過器官表面吸收水分和營養(yǎng)物質(zhì)等數(shù)據(jù)，設(shè)計了一系列評價運(yùn)載體在口腔及胃腸道模擬消化過程中的物理化學(xué)變化以及釋放效果的方法和設(shè)備。

體外消化系統(tǒng)模型是基于對人體體內(nèi)消化系統(tǒng)的仿生模擬而建立的，主要分為兩個部分，即上消化道系統(tǒng)模型和下消化道系統(tǒng)模型。上消化道指口腔、咽、食管、胃、小腸（十二指腸、空腸和回腸），下消化道指大腸（盲腸、闌尾、結(jié)腸、直腸和肛管）、肛門。目前大部分模型主要模擬人體上消化道的口腔、胃部、小腸的一個或幾個部位。體外消化模型包括靜態(tài)消化模型和動態(tài)消化模型。

1.2.1 靜態(tài)消化模型

靜態(tài)體外消化模型在實(shí)驗(yàn)室最為常用，通?？稍趯?shí)驗(yàn)室以簡單且基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)設(shè)備（錐形瓶、燒杯、離心管等）搭建而成，在設(shè)備中加入相應(yīng)的模擬消化液進(jìn)行模擬試驗(yàn)[32]。反應(yīng)容器放置在溫度為37 ℃的水浴或空氣浴中，再結(jié)合磁力攪拌或者搖晃等物理機(jī)械條件，以及人工調(diào)節(jié)相應(yīng)的pH 值即可進(jìn)行體外靜態(tài)模擬消化[33]。通常靜態(tài)消化模型僅模擬消化道單個部位的消化狀況，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求加入不同消化液模擬體內(nèi)消化情況?？谇豢赏ㄟ^機(jī)械研磨器模擬咀嚼，唾液（Simulated Saliva Fluid，SSF）一般由唾液酶、0.1594%（wt.%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)）NaCl、0.020% KCl、0.02%黏蛋白、0.02% NaN3（抗菌劑）組成，同時設(shè)定pH 值6.5～7.5和溫度37 ℃；胃部可通過水浴搖床振蕩2 h 模擬胃蠕動，胃液（Simulated Gastric Fluid，SGF）一般由0.32%胃蛋白酶、7 mol/L HCl、0.2% NaCl、0.02% NaN3（抗菌劑）組成，同時保持pH 值1～2 和溫度37 ℃；腸液（Simulated Intestinal Fluid，SIF）可由0.68% K2HPO4、5 mmol/L CaCl2、10 mg/mL 膽鹽、0.4 mg/mL 脂肪酶、0.02% NaN2（抗菌劑）組成，同時設(shè)定pH 值6.5～7.5和溫度37 ℃；小腸的消化過程可通過維持恒定的pH值，同時水浴振蕩2 h 進(jìn)行模擬[34-36]。

INFOGEST 模型是最具代表性的經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的體外靜態(tài)胃腸道消化研究模型，于2014 年由致力于研究充分模擬人類口腔、胃和小腸所需條件的國際科學(xué)院聯(lián)盟提出[37,38]，其模型示意圖如圖4 所示[3]。該組織對靜態(tài)消化模型的胃腸液配制、溫度、pH 值、離子成分、酶種類和含量、消化時間等進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，具有經(jīng)濟(jì)性高、操作簡易、可重復(fù)性高、體內(nèi)-體外相關(guān)性高等優(yōu)點(diǎn)，且使用該模型時參數(shù)值也可稍作調(diào)整[38,39]?，F(xiàn)已廣泛應(yīng)用于監(jiān)測蛋白質(zhì)、淀粉和脂類在不同胃腸道區(qū)域的消化動力學(xué)，以及評估疏水性生物活性物質(zhì)在胃腸條件下的穩(wěn)定性、釋放和生物可及性[39,40]。但也存在不足之處，如胃部pH 值為動態(tài)變化過程，食物進(jìn)入胃部時其結(jié)構(gòu)受體內(nèi)胃部瞬時 pH 值影響很大，而INFOGEST 模型的pH 值為固定值，模擬胃腸道消化時忽略了這一過程，從而導(dǎo)致食物成分吸收的生物可給性或動力學(xué)不準(zhǔn)確；另外，INFOGEST 模型試驗(yàn)周期可長達(dá)七天，在此期間添加的酶可能失活，從而影響系統(tǒng)的消化能力[37,39]。為克服INFOGEST 模型的不足，研究員們研發(fā)了一種半動態(tài)體外消化模型INFOGEST 2.0，該模型配備有動態(tài)調(diào)節(jié)pH 值、胃液分泌、酶分泌和胃排空系統(tǒng)，從而更真實(shí)地反映物質(zhì)在胃中的消化過程[39]。

圖4 靜態(tài)INFOGEST 消化模型和動態(tài)SHIME 消化模型示意圖[3]Fig.4 Diagram of static INFOGEST digestion model and dynamic SHIME digestion model[3]

靜態(tài)消化模型具有設(shè)備簡便、易操作、低成本和進(jìn)行多樣品分析等優(yōu)點(diǎn)，但不同課題組間設(shè)定的活性物質(zhì)用量、酶的添加量、pH 值、攪拌速度和時間均存在差異，導(dǎo)致各組之間結(jié)果可比性差[41]。與動態(tài)消化模型相比較，靜態(tài)模型無法模擬體內(nèi)胃部對物質(zhì)的剪切、混合等物理過程，忽略了胃腸道pH 值和消化液分泌的動態(tài)變化過程，無法真實(shí)地模擬整體胃部消化情況而更適用于局部消化試驗(yàn)[42]。

1.2.2 動態(tài)消化模型

相對于體外靜態(tài)消化模型，體外動態(tài)消化模型組成復(fù)雜，設(shè)備要求高而昂貴，但更加真實(shí)地模擬了體內(nèi)消化環(huán)境，提供了酶、pH 值實(shí)時控制、充足的蠕動條件、壓力等條件。體外動態(tài)消化模型有單室消化模型和多室消化模型。常見的單室模型有側(cè)重模擬胃底和胃竇的DGM（Dynamic Gastric Model）模型、側(cè)重胃部食物分解的HGS（Human Gastric Simulator）模型、可再現(xiàn)人體或動物結(jié)腸環(huán)境的ARCOL（Artificial Colon）模型等[41,43]。其中DGM 消化模型最為常用，因此動態(tài)單室模型主要介紹DGM 模型。多室消化模型有側(cè)重胃和小腸消化的DIDGI?模型，模擬胃、十二指腸、空腸和回腸四個部位的TIM（TNO Gastrointestinal Model）模型、可模擬人體腸道微生物生態(tài)系統(tǒng)的SHIME（Simulator or the Human Intestinal Microbial Ecosystem）模型等[44]。其中TIM 模型最為常用，而SHIME 是目前模擬體內(nèi)胃腸道系統(tǒng)最為全面的模型[30]，因此多室動態(tài)模型主要圍繞TIM 模型和SHIME模型展開。

DGM（Dynamic Gastric Model）模型是目前使用最多的單室模型，可模擬胃部的胃底和胃竇消化環(huán)境[43]，其模型結(jié)構(gòu)如圖5a 所示[44]。DGM 模型桶體外殼為乳膠材質(zhì)，內(nèi)部設(shè)立兩個相連的區(qū)域，分別對應(yīng)胃底和胃竇。其中胃底為主體部分，部分消化物在該區(qū)域受到系統(tǒng)周期性加壓而模擬動態(tài)消化；消化物到達(dá)胃竇區(qū)域時，桶體的上下運(yùn)動為消化過程提供了高強(qiáng)度剪切力和研磨力，使得該模型具有高混合效率和充分降低顆粒大小的能力；另外DGM 模型內(nèi)部設(shè)有閥門，通過計算機(jī)控制胃排空時間實(shí)時模擬胃排空[37]。

TIM（TNO Gastrointestinal Model）模型于上世紀(jì)90 年代初由荷蘭TNO（Netherlands Organization for Applied Scientific Research）營養(yǎng)與食品研究中心研發(fā)，包括胃、十二指腸、空腸和回腸四個隔室[44]，其模型結(jié)構(gòu)如圖5b 所示[45]。胃和十二指腸的分泌物由特定的蠕動泵控制；每個隔室通過將37 ℃的水泵入隔室內(nèi)外壁之間的空隙來模擬人體溫度，內(nèi)壁通過連續(xù)的壓縮和擴(kuò)張對人體胃部蠕動進(jìn)行復(fù)刻；每個隔間的pH 值由計算機(jī)監(jiān)測，并通過pH 值電極進(jìn)行控制[37]。研究人員在TIM 模型基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，研發(fā)了不同用途的TIM模型，包括TIM-1、TIM-2、TING-TIM 和TIM-AGC模型，其中TIM-1 最為常用，模擬了包括胃、十二指腸、空腸和回腸四個隔室；TIM-2 是利用志愿者的糞便獲取信息而設(shè)計的大腸消化系統(tǒng)；TING-TIM 是在TIM-1 模型基礎(chǔ)上進(jìn)行簡化，并提高了容量，其胃部與TIM-1 相同，小腸部分由三個隔室簡化為單個，并且沒有回腸出口；TIM-AGC 則配備有更加先進(jìn)的胃模型[30,45]。TIM 在模擬人體生理環(huán)境上具有可重復(fù)性高、可控和靈活等優(yōu)點(diǎn)，通過時間和位置變化實(shí)時控制消化液的收縮、胃排空時間、pH 值、胃液分泌速度、吸收速率和水分準(zhǔn)確地模擬動態(tài)胃腸道消化（GI）環(huán)境，對食品成分和藥物進(jìn)行充分地消化；除此之外，TIM模型還可以通過計算機(jī)控制胃的蠕動收縮和膜篩分技術(shù)模擬不同年齡階段人群（嬰兒、青少年、成年人、老年人）和動物物種的平均胃腸道狀況、生物變異和疾病狀況[30,31]。

圖5 動態(tài)單室DGM 消化模型(a)和多室TIM 消化模型示意圖(b)[45]Fig.5 Schematic diagram of dynamic single-chamber DGM digestion model (a) and multi-chamber TIM digestion model(b)[45]

SHIME?（Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem?）模型由比利時根特大學(xué)（Ghent University）根據(jù)原始的模擬成年人胃腸道的SHIME 模型研發(fā)而得，是目前報道的第一個模擬了幾乎整個胃腸道（胃、十二指腸、回腸、升結(jié)腸、橫結(jié)腸和降結(jié)腸，不包括口腔階段）的體外多室系統(tǒng)[31]，其基本結(jié)構(gòu)如圖4 所示[3]。胃部和十二指腸隔室采用填充式原理模擬食物吸收和消化的不同步驟，由蠕動泵按每天3次的頻率向胃中泵入一定數(shù)量的SHIME營養(yǎng)介質(zhì)和胃酶，并在小腸中添加膽汁?；啬c、升結(jié)腸、橫結(jié)腸和降結(jié)腸隔室是四個連續(xù)攪拌的釜式反應(yīng)器，通過接種來自糞便的微生物建立了穩(wěn)定的微生物群落，具有恒定體積和pH 調(diào)節(jié)系統(tǒng)[46]。反應(yīng)器通過接種來自的糞便微生物系統(tǒng)模擬升結(jié)腸、橫結(jié)腸和降結(jié)腸，因此該模型不僅從物理化學(xué)角度進(jìn)行了全面模擬，還模擬了人體腸道微生物生態(tài)系統(tǒng)，是最為接近人體內(nèi)部環(huán)境的體外消化模型[31]。但同時也存在經(jīng)濟(jì)性差、實(shí)用性差等問題，不適用于普通實(shí)驗(yàn)室研究，因此該模型目前多應(yīng)用于食品和發(fā)酵領(lǐng)域，在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用還有待研發(fā)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)模型

生物利用度試驗(yàn)中常用的細(xì)胞培養(yǎng)模型有Caco-2細(xì)胞模型、MDCK 狗腎細(xì)胞、HT29 人類結(jié)腸癌細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞IEC-18、HIEC 原代人類腸道上皮細(xì)胞等[47,48]。其中Caco-2 是體外模擬腸道吸收最為常用的細(xì)胞系，來源于人的結(jié)腸癌細(xì)胞，在體外培養(yǎng)條件下可自發(fā)進(jìn)行上皮樣分化，形成與小腸上皮細(xì)胞相同的微絨毛結(jié)構(gòu)并緊密連接，結(jié)構(gòu)和功能類似于人小腸上皮細(xì)胞，并含有與小腸刷狀緣上相關(guān)的酶系，形態(tài)學(xué)、標(biāo)志酶的功能表達(dá)及滲透特征都與小腸柱狀上皮細(xì)胞很相似[14,49]。在Caco-2 細(xì)胞中，主要的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體如寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)體PEPT1、P-糖蛋白MDR1、多藥耐藥相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（MRP2）和有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽（OATP2B1）均有較高水平表達(dá)，能夠快速得到藥物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)屬性；此外，Caco-2 細(xì)胞還表達(dá)一些腸道常見的糖苷酶、氨肽酶、酯酶和代謝酶，可考察存在代謝的情況下藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)情況，因此廣泛用于食品和藥物等在腸道上皮的吸收和運(yùn)輸機(jī)制[50,51]。

Caco-2 細(xì)胞模型可以反映藥物分子在體內(nèi)腸道上皮細(xì)胞的被動和主動等轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，被認(rèn)為是研究新藥滲透性、轉(zhuǎn)運(yùn)體機(jī)制和相互作用的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”[48]。但單層Caco-2 細(xì)胞一般需要3 周時間來完成細(xì)胞分化，因此實(shí)驗(yàn)周期較為漫長；且由于缺乏黏液層，相對于人體腸上皮細(xì)胞其跨膜電阻值（Transmembrane Resistance Value，TEER）通常偏高，細(xì)胞旁滲透性比人類上皮細(xì)胞低，以及所能反映的細(xì)胞被動轉(zhuǎn)運(yùn)旁路仍不全面，因此在模擬藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收仍然存在局限性[48,50]。為提高Caco-2 細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn)效率，研究人開發(fā)了不同的改進(jìn)方案，包括在細(xì)胞生長培養(yǎng)液中添加牛血清、鐵、激素和生長因子等來加速Caco-2 細(xì)胞生長，縮短實(shí)驗(yàn)周期；另外，目前已開發(fā)出結(jié)合三維模型（Three-Dimensional Models）加速培養(yǎng)周期為期4 天的Caco-2 細(xì)胞體系[48]；Caco-2 細(xì)胞與Raji 細(xì)胞誘導(dǎo)分化的微褶皺M 細(xì)胞（Microfold Cells）的共培養(yǎng)模型[51]，如Caco-2/HT29-MTX 共培養(yǎng)物[52]；人工添加黏液層[53]等方法。

1.4 動物研究模型

通常藥物進(jìn)入體內(nèi)后，人體會對藥物進(jìn)行吸收、分布、代謝，最終排出體外。體外消化模型雖然解決了體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)濟(jì)性、復(fù)雜性、周期長、倫理性等方面的不足，但數(shù)據(jù)的可靠性無法替代體內(nèi)分析。一般情況下，體內(nèi)生物利用度的評估方法是將已知劑量的待測藥物或其他生物活性分子通過不同的給藥途徑輸送至器官和生理功能與人類相近的動物（鼠、狗、豬等）體內(nèi)，并在一定的時間間隔內(nèi)測定血或尿中待測物質(zhì)濃度，獲得藥物在體內(nèi)的藥物代謝動力學(xué)參數(shù)，如時藥曲線下面積（AUC）、最大血藥濃度（Cmax）、達(dá)到Cmax的時間（Tmax）等。獲得參數(shù)可進(jìn)一步用于確定藥物的分布情況、作用機(jī)制、用藥量、給藥時間間隔、靶向性能等。

納米載體自發(fā)展至今，不斷延伸向各類疾病藥物的開發(fā)利用，動物試驗(yàn)也是評價一種新型納米載體系統(tǒng)的性能必不可少的項目。為了更準(zhǔn)確地研究藥物的在人體體現(xiàn)的藥理性質(zhì)，往往需要建立合適的動物病理模型，例如常見的腫瘤模型和糖尿病模型等。以乳腺癌為例，其癌癥腫瘤具有不同的分型和細(xì)胞株，相應(yīng)的乳腺癌分型模型的建立方法也各不相同。劉昱芃[54]在研發(fā)應(yīng)用于乳腺癌治療的納米載體時，將生長狀態(tài)良好的4T1 細(xì)胞株接種于雌性Balb/c 小鼠的乳腺脂肪墊上，成功構(gòu)建了乳腺癌原位模型。吳凱琪[55]則通過給健康小鼠皮下注射處理過的MDA-MB-231 細(xì)胞株成功建立了三陰乳腺癌皮下異種移植模型。糖尿病分為I型糖尿病和Ⅱ型糖尿病，且常伴有各類并發(fā)癥，進(jìn)行體內(nèi)藥物生物利用度研究時，需要根據(jù)藥物的預(yù)期治療目的建立病理模型，糖尿病動物模型常用鏈脲佐菌素、四氧嘧啶、地塞米松等誘導(dǎo)藥物誘導(dǎo)建立[56]。Toragall等[57]研究殼聚糖-海藻酸鈉-脂肪酸包載葉黃素納米載體的藥物代謝動力學(xué)時采用化學(xué)藥物誘導(dǎo)法，通過對大鼠進(jìn)行腹腔注射鏈脲佐菌素成功建立了糖尿病大鼠模型。根據(jù)鏈脲佐菌素注射計量不同，可以建立帶有不同并發(fā)癥的糖尿病小鼠。冷昌龍等[58]將50 mg/kg 的鏈脲佐菌素采用多次小劑量給藥法連續(xù)注射4 d，并給與高糖高脂飲食成功構(gòu)建了糖尿病腎病模型。彭偉康等[59]以60 mg/kg 劑量單次尾靜脈注射給藥成功建立了糖尿病性白內(nèi)障小鼠。

雖然研究生物利用度方法多種多樣且可根據(jù)實(shí)際需求進(jìn)行參數(shù)改變，但在醫(yī)藥研發(fā)領(lǐng)域，僅有藥物釋放模型、靜態(tài)胃腸道消化模型、細(xì)胞培養(yǎng)模型和動物研究模型較為常見，動態(tài)胃腸道消化模型在該領(lǐng)域的利用仍待研發(fā)。

2 提高生物利用度的方法

生物利用度的研究是證明食品與藥物等對人體具有保健或治療作用的重要參數(shù)。但大部分藥物在進(jìn)入體內(nèi)運(yùn)輸至全身時，所剩藥物量不足以達(dá)到治療需求。為此，研究者開發(fā)了不同的提高生物利用度的方法。傳統(tǒng)藥物劑型如片劑、注射劑、混懸劑、乳劑等在一定程度上改善了生物利用度，但依然存在不少藥物無法達(dá)到應(yīng)用要求。近幾十年興起的納米載體載藥策略從以下各個方面改善了生物利用度低的問題：增強(qiáng)藥物的穩(wěn)定性[60]；避免藥物其受光、熱、氧的影響[61]；提高藥物的溶解度[60,62]；控制藥物的釋放速率，延長作用時間[62]；降低藥物胃腸道降解、提高藥物吸收率[60]；靶向釋藥[63]。

2.1 提高藥物的溶解度

溶解度是指溶質(zhì)分子在特定溶劑中可溶解的最大限度。溶質(zhì)的物理特性（分子大小、形狀、結(jié)晶度等）和化學(xué)特性（分子結(jié)構(gòu)和官能團(tuán)種類等）均會影響溶解度的大??；除溶質(zhì)本身性質(zhì)外，溶劑的極性、溫度、離子強(qiáng)度、反離子的存在和酸堿度等對溶質(zhì)的溶解能力也具有影響[64,65]。醫(yī)藥領(lǐng)域中許多熱點(diǎn)活性分子均具有溶解能力差的缺陷，導(dǎo)致生物利用度低而不能滿足實(shí)際應(yīng)用需求。對此，研究人員開發(fā)了提高藥物溶解度的方法，包括物理改性、化學(xué)改性和載體遞送途徑等。物理改性法通過物理機(jī)械力作用將活性分子進(jìn)行微粉化減小顆粒尺寸，使得有效表面積增加達(dá)到溶解度增大的效果[65]?？梢酝ㄟ^添加極性基團(tuán)（如酮、羧酸等）對水溶性差的藥物進(jìn)行化學(xué)改性，使得氫鍵數(shù)量增加，從而提高溶解度[66]。載體遞送方法包括將溶質(zhì)分子制成環(huán)糊精絡(luò)合物、磷脂復(fù)合物、固體分散體、聚合物納米顆粒、固體脂質(zhì)納米顆粒、納米乳、脂質(zhì)體、聚合物膠束、固體自乳化給藥系統(tǒng)等[63]。生物活性物質(zhì)葉黃素具有廣泛的治療疾病潛力和典型的低溶解度特性，改善葉黃素生物利用度最為流行且有效的方法是載體遞送途徑，同時保護(hù)葉黃素不受外界環(huán)境損耗，靶向遞送至治療部位[66,67]。固體分散體制劑廣泛應(yīng)用于中草藥活性成分的開發(fā)，該方法將活性成分在固體狀態(tài)下通過熔融、溶劑或熔融-溶劑技術(shù)分散到惰性載體中，最終達(dá)到過飽和，使得活性成分的溶解量增加；同時惰性載體的存在阻礙過飽和溶液的晶體生成，可維持較長時間的過飽和狀態(tài)，體系穩(wěn)定性增加[68]。

2.2 控制釋放

納米載體的控制釋放是指將藥物與納米載體材料結(jié)合形成新的納米載藥系統(tǒng)，當(dāng)該體系進(jìn)入體內(nèi)后，可定向釋放并控制藥物從載體中的釋放速率，以維持其在靶點(diǎn)部位中的有效濃度，從而達(dá)到延長藥物作用時間、降低給藥劑量、減少給藥次數(shù)和提高生物利用度的目的[69]。傳統(tǒng)的控制釋放方法包括將活性成分制成片劑、栓劑、膠囊劑、膜劑、軟膏劑等，存在用藥劑量大、生物利用度低、副作用大、代謝速度快和患者依從性差等不足，已無法滿足當(dāng)下臨床需求?，F(xiàn)今最為流行的納米遞送技術(shù)解決了傳統(tǒng)藥物釋放制劑存在的缺陷。以目前研發(fā)較為成功的載體納米脂質(zhì)體為例，因其出色的釋放性能和材料低毒性而備受青睞，如脂質(zhì)體紫杉醇[70]和脂質(zhì)體阿霉素[71]等制劑已成功獲得上市批準(zhǔn)。脂質(zhì)納米粒同為脂類納米載體，藥物的釋放通過降解、侵蝕或擴(kuò)散實(shí)現(xiàn)，其機(jī)制取決于脂類及其組成、溫度或表面活性劑、顆粒大小和pH 值[72]。但值得注意的是在高溫或高濃度表面活性劑存在的情況下，脂質(zhì)納米粒具有突釋效應(yīng)（突釋效應(yīng)是指制劑在短時間內(nèi)釋放出大量的活性成分，使體內(nèi)血藥水平迅速增長而引起不良反應(yīng)）[72]。因此開發(fā)釋放性能良好的制劑對用藥安全至關(guān)重要。

2.3 靶向釋藥

靶向釋藥是指藥物分子在載體的作用下精準(zhǔn)且高濃度遞送釋放至靶器官，從而達(dá)到高效低（無）毒的治療效果。納米載體的靶向策略包括直接在目標(biāo)部位給予納米載體、利用磁場將磁性納米載體引導(dǎo)到目標(biāo)部位、主動靶向和被動靶向[9]。由于疾病產(chǎn)生的感染、炎癥等往往會在體內(nèi)進(jìn)行系統(tǒng)性的傳播，因此直接在目標(biāo)部位給藥較為困難；磁性靶向目標(biāo)部位雖然能一定程度上增加患病部位細(xì)胞對藥物的吸收，但依賴于磁場強(qiáng)度、顆粒的理化性質(zhì)、血液供應(yīng)、目標(biāo)組織的深度和血流速度等[9,73]。主動靶向是在納米載體的表面載入配體分子（如：小分子、抗體、肽、轉(zhuǎn)鐵蛋白、多糖、低分子量維生素等），使其能主動與特定的受體結(jié)合，保留在目標(biāo)部位并能被病變細(xì)胞主動吸收，具有特異性、高親和力和高選擇性[9,74]。被動靶向設(shè)計多用于腫瘤治療，是使特定分子量大小的納米載體可以通過炎癥區(qū)、腫瘤組織或缺血組織的漏斗狀血管外滲，從而增強(qiáng)納米載體的滲透性，增加藥物在疾病部位的積累，產(chǎn)生滯留效應(yīng)。但低分子量藥物的納米載體會導(dǎo)致藥物在靶點(diǎn)擴(kuò)散至血液循環(huán)，引起毒性反應(yīng)；該方法適用于分子量超過40 ku 的納米載體[8,9]。

為實(shí)現(xiàn)藥物的精準(zhǔn)靶向遞送，近幾年研發(fā)出的刺激響應(yīng)型納米遞送系統(tǒng)具有突破性進(jìn)展。根據(jù)刺激條件的不同可分為內(nèi)部刺激響應(yīng)型和外部刺激響應(yīng)型。內(nèi)部刺激響應(yīng)型靶點(diǎn)包括pH 值、酶、受體和氧化還原狀態(tài)等；外部刺激響應(yīng)型因素包括磁性、熱、光（可見光、紫外光、紅外光等）和超聲波等[75,76]。另一種有前途的靶向釋藥方法是在前藥設(shè)計基礎(chǔ)上結(jié)合脂質(zhì)的遞送系統(tǒng)[72]。前藥設(shè)計的目的包括增加藥物的代謝穩(wěn)定性；掩蓋藥物的不良?xì)馕叮唤档退幬锔弊饔没蚨拘?；干擾轉(zhuǎn)運(yùn)，使藥物定向靶細(xì)胞[72]。因此，將前藥的設(shè)計結(jié)合具有靶向作用納米載體可起到雙重靶向作用，從而達(dá)到治療目的。

2.4 其他

納米載體對藥物生物利用度所做的貢獻(xiàn)遠(yuǎn)不止于上述所提，目前所研發(fā)的納米載體類型已成千上萬種。此外，為提高藥物的生物利用度，納米載體的研發(fā)往往對藥物是多方面起保護(hù)和運(yùn)輸作用。如具有親脂性的類胡蘿卜素類天然功能性食品或藥物分子，大部分存在溶解度較低和理化性質(zhì)不穩(wěn)定等不足，而通過納米載體包載遞送是當(dāng)下較為流行的解決方案之一，其不僅可增加藥物分子的溶解性和穩(wěn)定性，且具有靶向遞送功能，從而大大增加這類藥物分子的生物利用度[77]。

3 結(jié)論與展望

生物利用度是檢驗(yàn)納米載體藥物系統(tǒng)的安全性和高效性重要指標(biāo)。本文主要從生物利用度的模型構(gòu)建、研究方法、提高生物利用度的途徑等方面進(jìn)行綜述。生物利用度檢測方法主要包括體外藥物釋放試驗(yàn)、體外模擬消化試驗(yàn)、細(xì)胞培養(yǎng)模型和體內(nèi)動物試驗(yàn)，各類體外試驗(yàn)方法均在一定程度上解決了體內(nèi)動物試驗(yàn)存在的不足，但數(shù)據(jù)的可靠性和準(zhǔn)確性仍無法替代體內(nèi)真實(shí)情況，因此還需不斷完善。至今，納米載體藥物系統(tǒng)研發(fā)主要從改善藥物溶解度、控制藥物釋放和靶向釋放藥物等方面改善藥物生物利用度，但目前已上市的高效納米載體藥物系統(tǒng)仍只占少部分。本文對生物利用度常見的研究模型和提高生物利用度的方法的總結(jié)，將為今后納米藥物遞送體系的體外和體內(nèi)生物利用度模型的應(yīng)用和拓新提供參考。