鄧卓瑤，韓凱寧，楊曉泉

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）

近年來，植物基膳食受到越來越多的關(guān)注，特別是針對植物蛋白的相關(guān)研究方興未艾。除了環(huán)境可持續(xù)、低成本和低致敏性，植物蛋白呈現(xiàn)機(jī)體多種代謝的調(diào)節(jié)作用，如改善改善高膽固醇血癥患者的血脂水平[1]，適度改善糖尿病患者的血糖水平[2]。薈萃分析發(fā)現(xiàn)動物蛋白的攝入量的增加會導(dǎo)致較高的心血管疾病死亡率[3]，而增加的植物蛋白攝入量則呈現(xiàn)較低的心血管病死亡率[4]。隨著全球?qū)χ参锏鞍椎男枨笱杆贁U(kuò)大，植物蛋白在新產(chǎn)品中的使用也在增加，常見的如植物基食品和乳品飲料。

乳液被認(rèn)為是保護(hù)和輸送營養(yǎng)物質(zhì)的優(yōu)良體系，在食品工業(yè)中已經(jīng)有著廣泛的應(yīng)用。由于乳液是一種熱力學(xué)不穩(wěn)定系統(tǒng)，需要通過乳化劑在油水界面形成吸附層，產(chǎn)生靜電斥力等防止隨著時間推移產(chǎn)生的液滴聚結(jié)和絮凝等變化[5]。然而一些常用的膳食乳化劑如卡拉膠等被證明可能對人體產(chǎn)生有害的影響，如改變微生物群的組成和促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)[6]。蛋白質(zhì)因自身具有兩親性，在兩相界面能夠自發(fā)形成穩(wěn)定的界面膜提高乳狀液的穩(wěn)定性，又兼有較高的營養(yǎng)價值，是一種優(yōu)質(zhì)、安全的天然乳化劑。酪蛋白和乳清蛋白是目前最常使用的蛋白乳化劑[7]，大豆蛋白也被廣泛研究和使用[8]。綠豆蛋白的氨基酸組成均衡[9]，是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白來源。已有的研究表明綠豆蛋白及其消化產(chǎn)物具有機(jī)體多種代謝的調(diào)節(jié)作用，例如降低膽固醇、改善血糖和血脂水平[10]，改善非酒精性脂肪肝[11]等。此外，綠豆蛋白可以通過調(diào)節(jié)宿主的膽酸代謝，從而改善脂質(zhì)代謝紊亂和調(diào)節(jié)腸道微生物的組成[12]。然而，關(guān)于綠豆蛋白在乳液中的應(yīng)用研究相對較少，仍需對其結(jié)構(gòu)與功能性質(zhì)進(jìn)行更多系統(tǒng)的研究以拓寬其應(yīng)用空間。

為了拓展綠豆蛋白在乳液體系中的應(yīng)用，本研究以大豆蛋白為對照，系統(tǒng)探究了熱處理前后綠豆蛋白結(jié)構(gòu)、表面疏水性、油水界面的吸附行為，以及綠豆蛋白穩(wěn)定的油水乳液的穩(wěn)定性和胃腸消化行為的變化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生綠豆購于廣州天河農(nóng)貿(mào)市場；脫脂大豆粕購于山東御馨生物科技有限公司；豬胃蛋白酶（P7012）、胰液素（P1750）均購于西格瑪公司；膽鹽（B875069）購于麥克林生化科技有限公司；蛋白Marker（11-180 ku）、上樣緩沖液（含DTT）和PAGE 膠促凝劑均購于索萊寶生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

DELTA 冷凍干燥機(jī)，德國Christ 公司；DSC 差示量熱掃描儀，瑞士Mettler Toledo 公司；OCA-20 光學(xué)接觸角儀，德國GmbH 公司；F7000 熒光分光光度計(jì)，日本Hitachi 公司；Nano-ZS 納米粒度分析儀，英國Malvern 公司；T25 高速剪切機(jī)，德國IKA 公司；M-110EH 高壓微射流納米均質(zhì)機(jī)，美國Microfluidics公司；LUMiSizer 穩(wěn)定分析儀，德國GmbH 公司；垂直電泳儀，美國BIO-RAD 公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白的分離制備

綠豆分離蛋白（MBI）的提取參考Budseekoad等[13]的方法并稍作修改。去皮綠豆粉碎后過200 目篩得到綠豆粉，綠豆粉以1:10 的料液比分散在去離子水中，用2 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH 值至10.0，于室溫下攪拌2 h，離心（8 000 r/min×30 min×25 ℃），取上清液。用2 mol/L HCl 調(diào)節(jié)上清液的pH 值至4.5，離心（8 000 r/min ×30 min×25 ℃），得到沉淀。沉淀用去離子水洗3 次后以6 倍水復(fù)溶，調(diào)節(jié)pH 值至7.0，在4 ℃冰箱中透析48 h，凍干獲得綠豆蛋白。

大豆分離蛋白（SPI）以脫脂大豆粕為原料，通過王金梅[14]的方法稍作修改提取獲得。豆粕以1:10 的料液比分散在去離子水中，用2 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH 值至9.0，室溫下攪拌2 h，離心（8 000 r/min×30 min×25 ℃），取上清液，調(diào)節(jié)清液的pH 值為4.5，再次離心。沉淀用去離子水洗3 次后以6 倍體積的水復(fù)溶，4 ℃下透析48 h，冷凍干燥。

經(jīng)杜馬斯燃燒法測定制備的綠豆分離蛋白和大豆分離蛋白的蛋白含量分別為90.69%和91.07%。

1.3.2 熱變性蛋白的制備

凍干后的MBI 和SPI 分別分散在去離子水中，配制成濃度為5%的蛋白溶液。于高壓滅菌鍋中120 ℃加熱20 min，取出溶液冷卻至室溫，使用冷凍干燥機(jī)凍干后得到熱變性綠豆蛋白（DMBI）和熱變性大豆蛋白（DSPI）粉末，將粉末置于干燥柜中以待后續(xù)使用。

1.3.3 差示量熱掃描（DSC）

樣品的熱流特征圖像由差示量熱掃描儀掃描獲得，方法參照Mohammadian 等[15]并有修改，加熱速率為5 ℃/min，加熱范圍為25～110 ℃。分別稱量2.5 mg的MBI、DMBI、SPI 和DSPI 蛋白粉末于鋁盤中，加入10 μL 磷酸鹽緩沖液（10 mmol/L，pH 值7.0）密封鋁盤。測試時用一個空鋁盤作為對照。手動設(shè)定吸熱峰的起點(diǎn)和終點(diǎn)，利用DSC 軟件計(jì)算變性焓（ΔH）和變性溫度（Td）。

1.3.4 界面張力

利用光學(xué)接觸角儀記錄表面張力的時間變化，監(jiān)測蛋白質(zhì)在葵花籽油-水界面處的動態(tài)表面性質(zhì)。實(shí)驗(yàn)在25 ℃下進(jìn)行，將注射器頂端沒入裝有純化葵花籽油的玻璃皿中，注射器推出體積為10 μL 的蛋白溶液（0.1%蛋白濃度），保持2 h，在油水界面實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)吸附。表面壓力數(shù)值通過楊氏模量方程計(jì)π=γ0-γt算得到，其中π為界面壓力，γ0為蒸餾水的界面張力，γt為受試樣品隨時間變化的界面張力。蛋白質(zhì)在油水處的吸附過程可簡單分為三個階段。分別是體系中蛋白質(zhì)向油水界面的遷移，附著在界面上的蛋白質(zhì)的展開以及被吸附的蛋白質(zhì)的重排形成更有利的構(gòu)象[16]。

在第一階段，蛋白質(zhì)的遷移受擴(kuò)散控制，遷移過程中不存在吸附能壘。當(dāng)界面壓力較低時，界面壓力隨時間的變化可以用公式（1）描述[17]：

式中：

C0——體相濃度，mg/mL；

K——玻爾茲曼常數(shù)；

T——絕對溫度，K；

D——擴(kuò)散系數(shù)；

t——時間，s。

當(dāng)吸附過程中擴(kuò)散是決定因素時，π關(guān)于t1/2的擬合曲線呈現(xiàn)出良好的線性，曲線的斜率為擴(kuò)散速率（kdiff）。

蛋白質(zhì)遷移到界面后，吸附過程的二、三階段即蛋白在界面處展開和重排的速率可以通過公式（2）來模擬[18]：

式中：

π0、πt、π7200——分別為實(shí)驗(yàn)開始時刻、任意時刻和最終吸附時刻的界面壓力。

ln[（π7200-πt）/（π7200-π0）] =-kit隨時間的變化會呈現(xiàn)出兩個線性區(qū)域。第一個斜率對應(yīng)蛋白質(zhì)展開的速率常數(shù)（ku），第二個斜率表示蛋白質(zhì)重排的速率常數(shù)（kr）。

1.3.5 表面疏水性

通過ANS 探針法測定蛋白質(zhì)的表面疏水性[19]。蛋白質(zhì)溶液用磷酸緩沖液（10 mmol/L，pH 值7.0）分別稀釋為0.05、0.1、0.15、0.2 及0.25 mg/mL。取4 mL蛋白溶液與50 μL 8 mmol/L ANS 溶液（溶于10 mmol/L PBS，pH 值7.0）混合，置于比色皿中。熒光測定條件為：激發(fā)波長為390 nm，發(fā)射波長為470 nm，狹縫寬度為5 nm。熒光強(qiáng)度與蛋白濃度線性回歸曲線的斜率表示蛋白表面疏水性（S0）。

1.3.6 乳液的制備

分別將MBI、DMBI、SPI 或DSPI 分散于去離子水中配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%或6%的蛋白溶液，緩慢攪拌2 h，在4 ℃中靜置過夜。乳液的制備方法參考Xu等[20]并稍作修改。將蛋白質(zhì)分散液與葵花籽油混合，油相含量為15%（m/m），用均質(zhì)器均質(zhì)2 min 進(jìn)行預(yù)乳化，隨后通過高壓微射流在50 MPa 下均質(zhì)三次。加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02%疊氮化鈉作為抑菌劑。

1.3.7 乳液的熱穩(wěn)定性

將新制備的乳液轉(zhuǎn)移到密封的玻璃瓶中，在121 ℃下加熱15 min，待加熱后的乳液后冷卻至室溫。對加熱前后乳液的平均粒徑進(jìn)行測定，乳液的熱穩(wěn)定性通過乳液粒徑的變化表示。乳液的粒徑通過Nano-ZS 納米粒度分析儀測量，測量前用10 mmol/L 磷酸緩沖液適當(dāng)稀釋乳液以避免多次散射造成的影響，所有的測試在25 ℃下進(jìn)行三次。

1.3.8 乳液的貯藏穩(wěn)定性

通過測量室溫下密封保存的乳液在第1、7、14、21、30 天的粒徑變化觀察乳液的儲存穩(wěn)定性。

1.3.9 乳液的物理穩(wěn)定性

蛋白質(zhì)乳液的物理穩(wěn)定性通過LUMiSizer 進(jìn)行評估。測量的儀器參數(shù)為：轉(zhuǎn)速2 828 r/min，實(shí)驗(yàn)時間250 min，溫度25 ℃，掃描間隔時間15 s。

1.3.10 體外模擬胃腸消化

采用兩步體外靜態(tài)消化模型[21]評價2%的蛋白質(zhì)乳狀液的消化情況。乳液在37 ℃下保溫后與模擬胃液（SGF）混合，消化液中需加入2 000 U/mL 豬胃蛋白酶及0.075 mmol/L CaCl2，使用1 mol/L HCl 調(diào)節(jié)混合物的pH 值至3.0，最終使乳液與SGF 的比例為1:1（V/V）。將消化液置于37 ℃水浴中，緩慢攪拌2 h。

用2 mol/L NaOH 將消化物調(diào)至pH 值7.0，與模擬腸液（SIF）混合，混合物中加入膽鹽至最終濃度為10 mmol/L，CaCl2濃度為0.3 mmol/L，加入胰液素使最終濃度為100 U/mL，最終的消化物與SIF 比例為1:1（V/V）。用2 mol/L NaOH 重新調(diào)節(jié)pH 至7.0，37 ℃攪拌2 h。結(jié)束消化時將混合物在90 ℃下加熱10 min。分別取乳液在胃消化過程中0、10、30、120 min 和腸消化過程中1、10、30、120 min 的樣品用作后續(xù)分析。

1.3.1 0.1 激光共聚焦顯微鏡觀察（CLSM）

通過激光共聚焦掃描顯微鏡觀察消化程中乳液微觀結(jié)構(gòu)的變化。分別將初始乳液和胃消化、腸消化過程中的樣品與0.1%（m/V）尼羅紅混合，以染色脂質(zhì)相。用63×油鏡觀察，激發(fā)波長為488 nm，吸收波長為510～610 nm。

1.3.1 0.2 SDS-PAGE 凝膠電泳

以未經(jīng)消化的蛋白質(zhì)乳液為對照，按照Chen 等[22]的方法對模擬胃、腸道消化過程中不同時間所取的樣品進(jìn)行SDS-PAGE 分析。SDS-PAGE 在不連續(xù)緩沖系統(tǒng)上進(jìn)行，使用4%的濃縮膠和12%的分離凝膠。將不同樣品與含上樣緩沖液混合，90 ℃加熱10 min。電泳凝膠每孔加入10 μL 樣品。電泳進(jìn)行條件為60 V 電壓持續(xù)運(yùn)行30 min 后以120 V 電壓運(yùn)行至結(jié)束。電泳膠片使用考馬斯亮藍(lán)R-250 染色后，用含20%無水乙醇和8%醋酸的脫色溶液脫色過夜。

1.3.11 數(shù)據(jù)分析處理

所有樣品測定均進(jìn)行三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)，利用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較兩組樣本間的顯著性差異（p＜0.05），采用單因素方差分析（AVOVA）結(jié)合Duncan 多種檢驗(yàn)比較多樣本間的顯著性差異（p＜0.05）。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白質(zhì)的熱力學(xué)性質(zhì)

DSC 可以揭示蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)構(gòu)象變化，圖1 中所示包括蛋白質(zhì)的變性溫度（Td）和焓變（ΔH）。MBI有一個主要的吸熱峰，Td為85.38 ℃，這可能是MBI 中的8S球蛋白的熱變性所致。8S球蛋白的ΔH為10.82 J/g。DSC測量的結(jié)果與Tang等[23]之前的研究結(jié)果相似。SPI有兩個主要的吸熱峰，分別對應(yīng)SPI 中有兩個主要的球蛋白的熱變性，7S 蛋白變性溫度較低，在較高溫度下，11S 蛋白發(fā)生變性。第一個峰值出現(xiàn)在76.90 ℃，第二個峰值出現(xiàn)在93.54 ℃，變性焓分別為1.14 J/g 和5.11 J/g，這與Wang 等[24]的研究結(jié)果一致。變性溫度與蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性有關(guān)，對于球狀蛋白質(zhì)來說，較高的Td值通常代表著較高的熱穩(wěn)定性，而焓變通常與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的緊密性相關(guān)[24]。在DMBI 和DSPI 的特征圖中未觀察到吸熱峰，即120 ℃的熱處理使綠豆分離蛋白和大豆分離蛋白徹底變性，改變了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。

圖1 MBI、MBI、SPI 和DSPI 的熱流曲線Fig.1 Heat flow curves of MBI,DMBI,SPI and DSPI

2.2 蛋白質(zhì)的界面性質(zhì)

圖2 所示為不同蛋白的界面壓力（π）隨時間的變化。所有蛋白質(zhì)的界面壓力隨吸附時間的增加而增大，π的增長速率隨著時間的推移而降低，這一現(xiàn)象是由于界面蛋白質(zhì)已飽和，進(jìn)一步吸附的靜電能壘增加[25]。蛋白質(zhì)在較短的時間內(nèi)的吸附過程是由蛋白質(zhì)從原本的體相向界面擴(kuò)散控制的。無論是綠豆分離蛋白或大豆分離蛋白，在經(jīng)120 ℃熱處理后的蛋白質(zhì)的吸附動力學(xué)都與天然蛋白質(zhì)相似，而DMBI 的kdiff（0.45）和DSPI 的kdiff（0.43）相對MBI（0.33）與SPI（0.34）增加，表明加熱后的蛋白質(zhì)具有柔性構(gòu)象和較高的表面活性。在王金梅[14]的研究中得到了相似的吸附曲線，并提出蛋白質(zhì)去折疊引起的疏水基團(tuán)暴露可以減小吸附的能壘，并改善蛋白質(zhì)在油水界面吸附的效率。

圖2 經(jīng)熱處理與非熱處理的蛋白穩(wěn)定的油水界面的界面壓力（π）與時間（s1/2）的關(guān)系Fig.2 Interfacial pressure (π) as a function of time (s1/2) for non or heat-treated protein stabilized O/W interfaces

在最開始的遷移階段過去后，吸附在界面上的蛋白質(zhì)的滲透、展開和構(gòu)象重排產(chǎn)生能壘，使吸附速率逐漸降低。常數(shù)ku和kr可以反映蛋白在界面上的滲透速率、展開速率和構(gòu)象重排速率。在本實(shí)驗(yàn)中，MBI 的ku（4.50E-4）和kr（11.90E-4）值高于DMBI（3.11E-4 和6.89E-4）（圖3），說明在界面上天然的蛋白能夠更有效地滲透和重排，這可能與熱處理引起了蛋白質(zhì)的聚集有關(guān)。蛋白質(zhì)聚集態(tài)比自然折疊態(tài)具有更低的自由能，且熱力學(xué)更穩(wěn)定[16]。

圖3 蛋白質(zhì)在油水界面展開和重排的一級速率常數(shù)擬合Fig.3 Fit of first-order rate constants of unfolding (ku) and rearrangement (kr) for protein at O/W interfaces

2.3 表面疏水性

表面疏水性是蛋白質(zhì)重要的表面性質(zhì)之一，這一特性反應(yīng)了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化引起的表面疏水基團(tuán)分布的變化。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以觀察到，對于天然的未變性的蛋白樣品，SPI 的表面疏水性（5 750.35）高于MBI（4 870.80）。經(jīng)過120 ℃，20 min 的熱處理后，兩種蛋白的表面疏水性都顯著提高，經(jīng)熱處理后，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)展開，球狀蛋白內(nèi)部更疏水的部分暴露[14]。表面疏水性與蛋白質(zhì)的乳化性能密切相關(guān)，換言之，熱處理后的綠豆分離蛋白和大豆分離蛋白變現(xiàn)出了更高的乳化潛力。Tang 等[26]和Zhong 等[27]都觀察到了類似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，即綠豆分離蛋白經(jīng)高溫?zé)崽幚砗笫杷燥@著提升。經(jīng)熱處理后DMBI 的表面疏水性（9 482.50）相比未處理前MBI 的疏水性提高94.68%，經(jīng)熱處理后DSPI 的表面疏水性（7 983.35）相比SPI 提高38.83%。這可能反應(yīng)了不同蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)構(gòu)象的差異，MBI 更容易發(fā)生變性或隨后的聚集。

圖4 不同蛋白樣品的的表面疏水性Fig.4 Surface hydrophobicity of different proteins

2.4 乳液的粒徑

2.4.1 乳液的初始粒徑

圖5 顯示了幾種新鮮乳液的粒徑分布，蛋白質(zhì)加熱后乳化性能得到提升，使用加熱后的蛋白質(zhì)作為乳化劑都能使乳液的粒徑降低，蛋白濃度高的乳液比蛋白濃度低的乳液具有更小的粒徑，這是因?yàn)楦嗟牡鞍踪|(zhì)吸附在小油滴的表面，形成了具有更強(qiáng)的內(nèi)聚力、抗斷裂能力更強(qiáng)的界面膜[20]。對比低濃度的MBI（498.55nm）和DMBI（372.46 nm）乳液粒徑分布可以發(fā)現(xiàn)，熱變性后的綠豆分離蛋白作為乳化劑不僅可以使乳液的液滴尺寸減小，還能改善蛋白乳液的分散性。這是熱處理后天然蛋白質(zhì)中隱藏的疏水氨基酸暴露出來的結(jié)果，表面疏水性的增加與界面張力的快速下降有關(guān)，這促進(jìn)了液滴的破碎和液滴尺寸的減小[28]。

圖5 不同濃度的蛋白(a)2%和(b)6%穩(wěn)定的乳液的初始粒徑分布Fig.5 Initial particle size distribution of protein-stabilized emulsions at different concentrations (a) 2% and (b) 6%

2.4.2 乳液的熱穩(wěn)定性

乳液經(jīng)121 ℃，15 min 的滅菌后粒徑的變化顯示在圖6 中，當(dāng)乳液中蛋白濃度為2%時，加熱使MBI乳液的粒徑顯著上升（加熱前為484.00 nm 加熱后為599.80 nm），用DMBI、SPI 和DSPI 穩(wěn)定的乳液粒徑?jīng)]有明顯的增加，當(dāng)乳液中蛋白濃度為6%時，乳液經(jīng)熱處理后粒徑皆增大，其中DMBI 顯示出對乳液更好的穩(wěn)定效果，加熱前后的粒徑分別為263.93 nm 和293.17 nm，而SPI 和DSPI 穩(wěn)定的乳液在滅菌后粒徑存在顯著性差異。在高蛋白濃度的乳液中，除了吸附在油水界面上的蛋白質(zhì)，還有一部分分散在連續(xù)項(xiàng)中非吸附蛋白質(zhì)。非吸附蛋白質(zhì)在加熱時展開并相互作用，產(chǎn)生蛋白質(zhì)聚集體，進(jìn)而對乳液的顆粒尺寸分布產(chǎn)生影響[29]。在Ma 等[28]的研究中觀察到相似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，與1%～4%的大豆蛋白穩(wěn)定的乳液相比，蛋白質(zhì)濃度為8%的乳液在加熱后粒徑變化更大。

圖6 高溫滅菌后乳液的粒徑變化Fig.6 Particle size change of emulsion after high temperature sterilization

2.4.3 乳液的貯藏穩(wěn)定性

觀察在25 ℃貯藏條件下的乳液的粒徑隨時間的變化，乳液的粒徑在總體上隨貯藏時間的增加而增大，在低濃度的蛋白乳液中，MBI 和DMBI 穩(wěn)定的乳液在檢測期內(nèi)粒徑增幅更大，分別增加至636.10 nm 和491.93 nm，可能是因?yàn)樗鼈兊某跏剂礁?，而小液滴有助于減緩重力分離，降低乳液絮凝的速率[30]。在高蛋白濃度的乳液中，MBI 穩(wěn)定的乳液粒徑顯著增加，第30 天的粒徑為1 011.60 nm，可能是由于穩(wěn)定小液滴的綠豆蛋白在儲存過程中從液滴界面解吸到水相中，水相中的蛋白濃度增加后通過疏水相互作用結(jié)合形成更大的聚集體，導(dǎo)致液滴絮凝[31]。經(jīng)熱處理后的綠豆分離蛋白穩(wěn)定的油水乳液的貯藏穩(wěn)定性與未處理前相比顯著上升。

圖7 乳液粒徑隨時間的變化Fig.7 Variation of emulsion particle size with time

2.5 乳液的物理穩(wěn)定性

利用LUMiSizer 光分析離心機(jī)對不同蛋白樣品和不同蛋白濃度穩(wěn)定的乳液進(jìn)行長期分散穩(wěn)定性的評估，圖8 是不同乳液樣品在測試過程中的時-空分辨消光剖面圖，透射曲線反應(yīng)了離心過程中樣品內(nèi)蛋白的沉降速率，透射曲線隨離心時間變化越大則說明樣品的分散穩(wěn)定性越差[32]。

圖8 不同蛋白樣品穩(wěn)定的乳液的透射剖面圖演變Fig.8 Evolution of transmission profiles of emulsions stabilized by different protein samples

觀察各個乳液樣品對應(yīng)的譜線圖可以發(fā)現(xiàn)隨時間推移，頂部的透射曲線逐漸增大，說明乳液從底部向上產(chǎn)生乳析，在離心過程中乳狀液分層。觀察下圖中不同蛋白穩(wěn)定的乳液樣品的透射譜演變可以明顯看出2% MBI 穩(wěn)定的蛋白乳液穩(wěn)定性最差，乳析現(xiàn)象嚴(yán)重，乳液中的油滴幾乎集中在試管的頂部，而同一濃度下DMBI、SPI 和DSPI 穩(wěn)定的乳液都顯示出更好的穩(wěn)定性。當(dāng)乳液中的蛋白濃度提高到6%，所有乳液樣品的物理穩(wěn)定性提升，MBI 穩(wěn)定的乳液仍有明顯的乳析現(xiàn)象，而DMBI 和DSPI 乳液僅在底部出現(xiàn)微量的乳析。這可以與前面乳液在儲存期間粒徑的變化對照，6%的DMBI、SPI、DSPI 乳液在儲存期間粒徑變化較小，蛋白質(zhì)的聚集程度降低從而體現(xiàn)了較高的穩(wěn)定性。

2.6 乳液的胃腸消化行為

2.6.1 SDS-PAGE 凝膠電泳

通過SDS-PAGE 凝膠電泳分析乳液中的蛋白質(zhì)在消化過程中的水解情況。在蛋白質(zhì)開始水解之前即胃消化的零時刻，MBI 的主要組分8S 球蛋白和SPI 的主要蛋白質(zhì)組分7S 蛋白和11S 蛋白都能被清晰地識別出來，而經(jīng)過熱處理的蛋白質(zhì)DMBI 和DSPI 對應(yīng)組分的條帶強(qiáng)度降低，這表明熱處理破壞了蛋白質(zhì)部分亞基結(jié)構(gòu)。

圖9 乳液中蛋白質(zhì)在消化過程中的SDS-PAGE 圖譜Fig.9 SDS-PAGE analysis of proteins in emulsions during digestion

MBI 乳液的電泳結(jié)果中大分子量的條帶隨時間增加逐漸水解變淺，分子量小于20 ku 的肽段增加，其中8S蛋白的α亞基和α′亞基在胃消化階段的前30 min 內(nèi)逐漸水解消失，而β亞基則在胃消化過程中表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗消化性。與之相似的是SPI 中7S 蛋白的水解過程，此外SPI 中的另一主要組分11S 蛋白中的酸性亞基A 也在胃消化的前段被逐漸水解，而堿性亞基B 在胃消化結(jié)束時仍有明顯的條帶，這些條帶表現(xiàn)出的消化特性與周志紅等[33]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，即β亞基最不容易被胃蛋白消化，亞基A 相比亞基B 更容易被胃蛋白酶消化。

可以看出蛋白質(zhì)經(jīng)過熱處理后消化性得到明顯改善，在胃消化過程中能被胃蛋白酶快速水解。經(jīng)加熱蛋白質(zhì)的天然有序的折疊結(jié)構(gòu)被展開，可以增強(qiáng)胃蛋白酶作用所需的特定肽鍵的可及性[34,35]。在Tang 等[36]的實(shí)驗(yàn)中同樣發(fā)現(xiàn)100 ℃的熱處理能促進(jìn)蛋白水解成更多的小片段肽。進(jìn)入到腸消化階段，不同蛋白乳液中的蛋白片段被快速水解，產(chǎn)生小分子量的肽段，有研究報道[37]在此過程中膽鹽可能取代界面上的肽成為乳化劑，使肽段轉(zhuǎn)移至溶液中增加與酶的接觸從而加速蛋白質(zhì)的水解。

2.6.2 乳液的微觀結(jié)構(gòu)

消化過程中液滴的界面組成發(fā)生變化可能會導(dǎo)致乳液的聚集和絮凝，使乳液的粒徑增大。未經(jīng)消化的乳液液滴尺度細(xì)小且分布均勻，MBI 穩(wěn)定的乳液在胃消化中迅速聚集形成大的油滴，而后在整個胃消化的過程中油滴的尺度逐漸減小。DMBI 和DSPI 穩(wěn)定的乳液展示出相似的現(xiàn)象即在胃消化過程中逐漸發(fā)生聚集，由前面電泳觀察到的結(jié)果可知，此時蛋白質(zhì)正被快速水解，并不足以維持液滴界面的穩(wěn)定。由于蛋白質(zhì)的構(gòu)象不同且對疏水和親水環(huán)境具有不同親和力的區(qū)域，胃蛋白酶對不同蛋白質(zhì)的水解能力也有差別，無序的蛋白質(zhì)能被胃蛋白酶快速水解，而具有高度折疊構(gòu)象的蛋白質(zhì)在天然狀態(tài)下對胃消化具有一定的抵抗力[38,39]。而SPI 穩(wěn)定的乳液在胃消化過程中并沒有聚集形成大的油滴，這似乎表明SPI 在實(shí)驗(yàn)中具有更明顯的抵抗胃消化的特性，而這與Bellesi 等[40]研究中發(fā)現(xiàn)的大豆蛋白穩(wěn)定的乳液在胃消化過程中粒徑增加的結(jié)果不一致。但另有研究報道稱SPI 在胃消化過程中聚集而不是形成大油滴，消化后的SPI 肽能夠維持較低的表面張力，但不能維持粒子間結(jié)合的空間位阻或靜電屏障[22]。

進(jìn)入腸消化后，四種蛋白乳液均被快速水解分散成小的油滴。在模擬腸消化中pH 值的增加導(dǎo)致蛋白質(zhì)電荷反轉(zhuǎn)，也可能會影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定油滴的靜電相互作用。在此相中，吸附在界面上或存在于體系中未吸附的蛋白質(zhì)和肽段被進(jìn)一步水解成更小的肽或氨基酸。與此同時消化液中存在的膽鹽具有高表面活性，殘留在液滴表面的蛋白質(zhì)或蛋白肽有可能被膽鹽置換。有研究稱膽鹽可使脂質(zhì)水解產(chǎn)物在水相中再次乳化，防止其在界面上聚集，并進(jìn)一步促進(jìn)水解[37]。因此，大量被膽鹽穩(wěn)定的小囊泡會降低腸消化期油滴的總體平均粒徑。

圖10 消化過程中乳液液滴的聚集情況Fig.10 Aggregation of emulsion droplets during digestion

3 結(jié)論

本研究以大豆蛋白為對照，系統(tǒng)探究了濕熱處理對綠豆蛋白結(jié)構(gòu)、表面疏水性、油水界面的吸附行為及綠豆蛋白穩(wěn)定的油水乳液的穩(wěn)定性與消化行為的影響。研究表明濕熱處理改變了綠豆蛋白的二級結(jié)構(gòu)，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的比例增加，內(nèi)部疏水集團(tuán)暴露從而導(dǎo)致表面疏水性提高。與天然的綠豆蛋白相比，經(jīng)濕熱處理得到的綠豆蛋白穩(wěn)定的油水乳液初始粒徑更小，分散性提高，貯藏穩(wěn)定性增加。此外6%的熱處理綠豆蛋白穩(wěn)定的乳液具有更好的熱穩(wěn)定性和物理穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)表明綠豆蛋白作為一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白來源，具有應(yīng)用于植物基食品乳液開發(fā)的潛力。