程映雪，王夢露，賀軍波,2*，林紅，胡志雄,2，齊玉堂,2，張維農(nóng),2

（1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，農(nóng)產(chǎn)品加工與轉(zhuǎn)化湖北省重點實驗室，湖北武漢 430023）(2.湖北省油脂精細化工工程技術(shù)研究中心，湖北武漢 430023）

蛋白質(zhì)與小分子表面活性劑的復(fù)合物具有降低表面張力、促進乳狀液形成等重要的物理化學(xué)性質(zhì)，在食品和其他工業(yè)中受到廣泛關(guān)注[1,2]。蛋白質(zhì)可以通過空間和靜電穩(wěn)定機理吸附于油滴表面，提供乳液的長期穩(wěn)定性。但是，蛋白質(zhì)的乳化活性和乳化能力通常低于小分子表面活性劑。與蛋白質(zhì)相比，小分子表面活性劑能更有效地降低界面張力[3]，然而，由于缺乏空間斥力和界面粘彈性，油滴聚結(jié)的阻力較低[4]，乳化穩(wěn)定性不如蛋白質(zhì)。因此，蛋白質(zhì)和小分子表面活性劑的復(fù)合物可以結(jié)合兩者優(yōu)點來改善乳化性質(zhì)。

酪蛋白酸鈉（Sodium Caseinate，NaCas）具有良好的乳化穩(wěn)定性，是一種廣泛應(yīng)用的食品蛋白質(zhì)乳化劑[5]。NaCas 由αs1-、αs2-、β和κ-酪蛋白組成，αs1-和β是影響NaCas 表面活性的主要成分[6]。然而，NaCas穩(wěn)定的食品乳狀液在酸化過程中會由于靜電排斥作用減弱而容易失穩(wěn)[7,8]，并且NaCas 降低界面張力的能力不夠理想而具有較低的油體積分數(shù)。為了改善這些缺陷，通常將NaCas 與蔗糖酯[9]、卵磷脂[10]、吐溫-80[11]等復(fù)合來提高體系的乳化性質(zhì)。

聚甘油脂肪酸酯（Polyglycerol Fatty Acid Esters，PGFEs）是一種安全、有效降低油水界面張力的非離子型表面活性劑，廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域[12,13]。改變甘油的聚合物和脂肪酸的結(jié)構(gòu)，可以合成具有優(yōu)良的兩親性和特定親水親油平衡值（HLB）的PGFEs[14]。有文獻表明二聚甘油單油酸酯與酪蛋白復(fù)配時會發(fā)生界面處的競爭作用，導(dǎo)致乳液的不穩(wěn)定性[15]?；赑GFEs 的兩親性及脂肪酸與NaCas 間的潛在非共價結(jié)合[16]，NaCas 與PGFEs 可通過氫鍵、疏水相互作用等形成復(fù)合物，從而提高蛋白質(zhì)的乳化性能。

本研究構(gòu)建了 NaCas 與十聚甘油單油酸酯（Decaglycerol Monooleate，DGMO）復(fù)合物，并用動態(tài)光散射和Zeta-電位進行了表征，用紫外-可見分光光度計、熒光光譜、傅里葉變換紅外光譜研究了NaCas 與DGMO 的相互作用，考察了溫度、pH 和鹽離子濃度對復(fù)合物穩(wěn)定性的影響及復(fù)合物對水包油（Oil-in-Water，O/W）乳液的乳化性能和檸檬醛的穩(wěn)定作用。

1 材料與方法

1.1 原料

1.1.1 原料與試劑

酪蛋白酸鈉（來自牛乳，蛋白含量90%），梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；十聚甘油單油酸酯（HLB=12.9[14]），山東濱州金盛新材料科技有限責(zé)任公司；熒光素-5-異硫氰酸酯（FITC）、尼羅紅和1-苯胺基-8-萘磺酸鹽（ANS），Sigma-Aldrich 公司；米糠油，武商超市；氫氧化鈉、氯化鈉、0.1 mol/L 鹽酸、磷酸氫二鈉、檸檬酸，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

Lambda 650 紫外分光光度計，德國珀金埃爾默公司；Malvern Zetasizer Nano ZS90 粒度分析儀，英國馬爾文儀器有限公司；Spectrum 100 傅里葉變換紅外光譜儀，美國珀金埃爾默公司；F-4600 熒光分光光度計，日本日立；FV1200-OSR 激光共聚焦顯微鏡，日本奧林巴斯。

1.2 實驗方法

1.2.1 NaCas-DGMO 復(fù)合物分散液的制備

NaCas 溶于Milli-Q 水中制備40 mg/mL 的儲備液。稱取DGMO 溶于Milli-Q 水中制得160 mg/mL 的溶液，然后用Milli-Q 水稀釋得到不同濃度的儲備液（20、40、80 mg/mL）。用0.1 mol/L HCl 溶液將所有儲備液調(diào)節(jié)至pH 值7.0。將1 mL NaCas 儲備液和1 mL DGMO 儲備液添加到6 mL Milli-Q 水中，達到最終體積8 mL，NaCas 和DGMO 的終濃度分別為5 mg/mL 和2.5～20 mg/mL，對應(yīng)NaCas 和DGMO 質(zhì)量比為2:1、1:1、1:2、1:4。樣品在80 ℃攪拌1 h 后水浴冷卻至25 ℃，然后添加0.02 wt%的疊氮化鈉抑制微生物生長。所有樣品均保存在25 ℃下進行進一步分析。

1.2.2 粒徑、PDI 和Zeta-電位測定

用Malvern Zetasizer Nnano ZS 粒徑分析儀測定制備的NaCas-DGMO 復(fù)合物分散液的粒徑、PDI 及Zeta-電位。使用Milli-Q 水稀釋復(fù)合物分散液80 倍測定粒徑和PDI，Zeta-電位不稀釋直接測定。

1.2.3 濁度測定

用Lambda 650 紫外分光光度計測定NaCas-DGMO復(fù)合物分散液在室溫（25 ℃）和600 nm 波長處的吸光度以表征濁度[17]。

1.2.4 熒光光譜表征

用F-4600 型熒光分光光度計進行熒光實驗。固定激發(fā)和發(fā)射狹縫為5 nm，激發(fā)波長設(shè)置為280 nm，發(fā)射光譜采集范圍為290～500 nm，掃描速度為2 400 nm/min，電壓為500 V，所有樣品稀釋10 倍后測定。

1.2.5 表面疏水性測定

用1-苯胺基-8-萘磺酸鹽（ANS）熒光法測定NaCas-DGMO 復(fù)合物的表面疏水性。用磷酸鹽緩沖溶液（0.01 mol/L，pH 值7.0）將復(fù)合物分散液稀釋至酪蛋白酸鈉濃度為0.05～0.25 mg/mL。將4 mL 稀釋液與相同磷酸鹽緩沖溶液中制備的20 μL 8 mmol/L ANS 溶液混合，然后在室溫下靜置15min。使用F-4600 熒光分光光度計測定激發(fā)波長390 nm 和發(fā)射波長470 nm處的熒光強度。熒光強度與NaCas 濃度曲線的初始斜率即被認為是表面疏水性[18]。

1.2.6 FT-IR 分析

分別取 NaCas、DGMO 和質(zhì)量比 1:2 的NaCas-DGMO 復(fù)合物在80 ℃制備的復(fù)合物凍干粉與KBr 粉末混合研磨壓片，在4 000～400 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)進行FT-IR 掃描。掃描次數(shù)16 次，分辨率4 cm-1。DGMO作為液體樣品采用ATR 方法在600～4 000 cm-1范圍內(nèi)進行FT-IR 掃描，掃描次數(shù)16 次，分辨率4 cm-1。

1.2.7 NaCas-DGMO 復(fù)合物對pH 值和離子強度的穩(wěn)定性

用檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液將NaCas-DGMO復(fù)合物分散液的pH 值調(diào)節(jié)至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0和7.0，評價pH 值對復(fù)合物分散液穩(wěn)定性的影響。評估復(fù)合物分散液在NaCl 濃度為0.05、0.10、0.15、0.30 mol/L的穩(wěn)定性。測定室溫下12 和24 h 后的粒徑和PDI。

1.2.8 NaCas-DGMO 復(fù)合物穩(wěn)定乳液的制備

采用超聲均質(zhì)方法制備NaCas-DGMO復(fù)合物穩(wěn)定水包油乳液。取NaCas 與DGMO 質(zhì)量比1:2 的復(fù)合物分散液6 mL，分別加入復(fù)合物質(zhì)量5 倍、10 倍、15 倍和20 倍的米糠油，將混合液在斡旋儀上混合2 min 后，用探頭超聲器將混合物于20 kHz 下連續(xù)超聲5 min，形成乳白均一的水包油乳液。NaCas 和DGMO 的水分散液作為對照用于穩(wěn)定水包油乳液。分別測定0、15、30 d的粒徑和PDI 用于表征水包油乳液。

1.2.9 激光共聚焦顯微鏡表征

用100 μg/mL 的異硫氰酸熒光素（FITC）和尼羅紅溶液分別添加到NaCas-DGMO復(fù)合物分散液和米糠油中，用來標記蛋白和油樣（復(fù)合物與油相質(zhì)量比為1:10），避光染色過夜后，取10 μL 乳液滴到載玻片上，蓋上載破片后放置顯微鏡下放大80 倍觀察。其中染料FITC和尼羅紅的激發(fā)波長分別為488 nm和543 nm[19]。單獨NaCas 和DGMO 穩(wěn)定的O/W 乳液作為對照。

1.2.10 負載檸檬醛米糠油乳液的制備

向1.2.8 制備的米糠油O/W 乳液中加入檸檬醛，檸檬醛的載藥量為米糠油質(zhì)量的5%、10%、15%和20%。利用高壓微射流在10 000 Psi 壓力下循環(huán)均質(zhì)3 次制備出負載檸檬醛的米糠油乳液，乳液中米糠油是酪蛋白酸鈉質(zhì)量的10 倍。NaCas 穩(wěn)定米糠油乳液包埋作用對照，檸檬醛的載藥量為15%。測定乳液的粒徑、PDI和Zeta-電勢進行表征。

1.2.11 檸檬醛儲存穩(wěn)定性測定

取20 mL 新制的檸檬醛乳液，25 ℃避光保存28 d，測定檸檬醛的保留率（A，%）。保留率測定方法：取50 μL 檸檬醛乳液用乙腈稀釋100 倍，并超聲處理10 min，使所載檸檬醛全部游離出來，然后通過HPLC檢測檸檬醛保留量（W保留），定義新制備的乳液的檸檬醛含量為W總。

A=W保留/W總×100%。

HPLC 色譜條件：流動相為水和乙腈，0～12 min：乙腈占40%～70%，12～16 min：乙腈占70%～40%；固定相為C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫為30 ℃;流速為1 mL/min；檢測波長為237 nm。檸檬醛標準曲線擬合方程為Y=51 912X+1.584 0，R2=0.999 9。

1.2.12 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每組進行3 次平行實驗，實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，并用SPSS 20.0 軟件進行顯著性差異分析（p＜0.05）。采用Origin 8.5 軟件制圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)量比對NaCas-DGMO 復(fù)合物的影響

由表1 可知，NaCas 與DGMO 復(fù)合后粒徑與PDI均較NaCas 顯著下降（p＜0.05），說明兩種物質(zhì)可能以某種形式相互結(jié)合。DGMO 的添加量對復(fù)合物的形成也有顯著影響（p＜0.05），當(dāng)NaCas 與DGMO 質(zhì)量比小于1:1 時，復(fù)合物的PDI 均小于0.3，表明能形成穩(wěn)定的復(fù)合體系，且在25 ℃儲存7 d 后的粒徑和Zeta-電位變化不明顯（p＞0.05)，仍保持著相似的趨勢，表明該復(fù)合物能穩(wěn)定存在。

表1 不同質(zhì)量比制備的NaCas、DGMO 及其復(fù)合物的粒徑、PDI、Zeta-電位Table 1 Particle size,PDI,Zeta-potential of NaCas,DGMO,and their complexes prepared with different mass ratios

NaCas 是常用的蛋白質(zhì)類食品乳化劑，在水中以膠束存在，本身具有較強的表面活性和乳化性[20]。Panja等[16]研究了酪蛋白膠束與不同飽和度脂肪酸的結(jié)合能力，發(fā)現(xiàn)油酸與酪蛋白膠束具有更強的疏水相互作用。DGMO 是一種高HLB 值（12.9）的非離子型食品乳化劑，具有優(yōu)異的水溶性。NaCas 與DGMO 的相互作用可能是油酸鏈與NaCas 以疏水相互作用嵌入膠束中，同時十聚甘油基團的強親水性改變了NaCas 膠束的表面性質(zhì)，使得分子間斥力作用增強而具有更好的分散性，即表現(xiàn)出更小的粒徑和PDI。

2.2 NaCas-DGMO 復(fù)合物分散液濁度

靜態(tài)濁度法可以用來表征乳液或分散系的穩(wěn)定性[21]，即測量乳液或分散系的濁度隨放置時間的變化。不同質(zhì)量比的NaCas-DGMO復(fù)合物分散液的濁度與放置時間的關(guān)系如圖1 所示。圖1 表明隨著DGMO 添加量的增加，復(fù)合物分散液的濁度呈現(xiàn)上升趨勢，而且7 d儲存期內(nèi)濁度值基本無明顯變化，進一步說明NaCas-DGMO 復(fù)合物分散液具有很好的穩(wěn)定性。

圖1 NaCas-DGMO 復(fù)合物的濁度與質(zhì)量比和儲藏時間的關(guān)系Fig.1 The relationship between the turbidity of the complex NaCas-DGMO and its mass ratio and storage time

2.3 NaCas 熒光光譜的變化

NaCas 中的色氨酸和酪氨酸殘基在受到特定波長光激發(fā)后發(fā)射一定強度的熒光[22]，其強度變化可反映蛋白質(zhì)微結(jié)構(gòu)的改變。圖2 所示是NaCas-DGMO 復(fù)合物中NaCas 熒光光譜圖，固定280 nm 的激發(fā)波長時，NaCas 在346 nm 處有最大發(fā)射波長，為色氨酸殘基產(chǎn)生的熒光。與DGMO 復(fù)配后，NaCas 的最大發(fā)射波長發(fā)生輕微紅移（λmax=349 nm），說明DGMO 的加入引起NaCas 的結(jié)構(gòu)變化，色氨酸暴露到親水環(huán)境而引起熒光淬滅效應(yīng)。隨著DGMO 添加量的增加，NaCas 的熒光淬滅效應(yīng)越發(fā)明顯。當(dāng)NaCas 與DGMO 質(zhì)量比1:2 時，NaCas 的熒光強度下降了48%，表明在此比例下，DGMO 與NaCas 相互作用明顯增強。Gan 等[23]利用NaCas-果膠包埋植物甾醇，發(fā)現(xiàn)植物甾醇對NaCas產(chǎn)生了熒光淬滅效果，兩者間發(fā)生了疏水相互作用。

圖2 NaCas 與DGMO 相互作用后熒光光譜變化Fig.2 Changes in fluorescence spectra after interaction of NaCas with DGMO

結(jié)合NaCas-DGMO 復(fù)合物的粒徑、PDI、Zeta-電位、濁度和熒光光譜，可以推斷NaCas 與DGMO 質(zhì)量比為1:2 時形成復(fù)合物最佳，并用于后續(xù)所有研究。

2.4 NaCas 表面疏水性變化

蛋白質(zhì)表面疏水性的變化可反映蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變及疏水性氨基酸殘基的分布變化，與蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)緊密相關(guān)。圖3 表示NaCas 與DGMO 以質(zhì)量比1:2形成復(fù)合物后的表面疏水性變化。相比單純NaCas 而言，NaCas-DGMO 復(fù)合物的表面疏水性增加了一倍（319.46 增至596.45），說明DGMO 與NaCas 作用后，蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水區(qū)逐漸暴露，導(dǎo)致表面疏水性增強。王碧璇[24]的研究發(fā)現(xiàn)：糖接枝后的大豆分離蛋白表面疏水性呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。接枝度在44.73%以內(nèi)時，表面疏水性最高達到2 043.33，相對于天然大豆分離蛋白提升了163.66%。NaCas 表面疏水性的增大也可能增強其與DGMO 中油酸鏈的疏水相互作用，促進復(fù)合物的形成。另一方面，NaCas 內(nèi)部疏水區(qū)的暴露增加了蛋白質(zhì)中色氨酸殘基與水相的接觸，引起熒光淬滅效應(yīng)，從而證明了前面復(fù)配致使NaCas 熒光強度降低的現(xiàn)象。

圖3 NaCas 和NaCas-DGMO 復(fù)合物（1:2，m/m）的表面疏水性Fig.3 Surface hydrophobicity of NaCas and NaCas-DGMO complexes (1:2,m/m)

2.5 NaCas-DGMO 復(fù)合物的紅外光譜表征

圖4 為NaCas、DGMO 和兩者復(fù)合物的紅外光譜圖，DGMO 紅外光譜圖中3 371 cm-1為聚甘油基團的-OH 伸縮振動峰；2 923、2 854 cm-1為油酸鏈的C-H 鍵伸縮振動峰；1 737 cm-1為油酸中C=O 伸縮振動峰；1 117 cm-1為典型的聚甘油中C-O-C伸縮振動峰。NaCas紅外光譜圖中3 309 cm-1吸收峰為O-H 伸縮振動峰；2 961、2 875 cm-1為C-H 鍵伸縮振動峰；1 659 cm-1為蛋白質(zhì)酰胺I 帶（C=O）伸縮振動峰；1 400～1 550 cm-1為酰胺II帶的N-H變形振動和C-N伸縮振動峰；1 241 cm-1為酰胺III 帶的N-H 面內(nèi)彎曲振動和C-H 伸縮振動峰。DGMO 與NaCas 復(fù)合后，蛋白質(zhì)的O-H 伸縮振動峰向3 317 cm-1波數(shù)移動，產(chǎn)生輕微藍移，說明DGMO 與NaCas 間的氫鍵作用影響了O-H 的吸收峰。NaCas 的酰胺基團的紅外光譜在復(fù)合后基本沒有變化，說明兩者間沒有共價鍵的形成，而是以弱相互作用力結(jié)合[25]。

圖4 NaCas、DGMO 和NaCas-DGMO 復(fù)合物FT-IR 圖Fig.4 FT-IR of NaCas,DGMO and NaCas-DGMO complex

2.6 pH 對NaCas-DGMO 復(fù)合物分散液的影響

蛋白質(zhì)功能性質(zhì)受pH 值的影響顯著，而聚甘油脂肪酸酯的水解敏感性小，具有較強的熱穩(wěn)定性和抗酸性[12]，因此考察了NaCas-DGMO 復(fù)合物受pH 值的影響。圖5a 和5b 為NaCas、DGMO 及在80 ℃制備的兩者復(fù)合物分散液在不同pH 值條件下放置12 h 的粒徑和PDI，圖5c 和5d 為放置24 h 中，表明DGMO 與NaCas 的復(fù)配并未改變NaCas 在等電點處的溶解性。除pH 值4.0 外，NaCas 均以納米尺度（250～450 nm）分散于水相中，但PDI 值均較大（0.35～0.70），說明蛋白質(zhì)粒徑分布不均。Qian 等[26]研究了β-乳球蛋白穩(wěn)定的乳液在接近蛋白質(zhì)等電點的pH 值（pH 值4 和5）、高離子強度（NaC＞0.2 mol/L，pH 值7）和較高的儲存溫度（55 ℃）下穩(wěn)定性，結(jié)果表明在此條件下乳液不穩(wěn)定，乳液中油滴容易聚集。相比而言，DGMO 則在不同pH 值下均以優(yōu)異的納米膠束存在，粒徑處于180～250 nm 范圍，PDI 處于0.07～0.16，不受pH 值變化的影響。NaCas-DGMO 復(fù)合物分散液在pH 值為2.0、3.0、5.0、6.0 和7.0 時均具有明顯更低的粒徑，復(fù)合體系的PDI 值也顯著低于NaCas 本身，說明DGMO 的加入可改善NaCas 的分散性，抑制蛋白質(zhì)的聚集效應(yīng)。隨著不同pH 值條件下放置時間延長至24 h，NaCas 本身在pH 值6和7條件下的粒徑均有顯著增加，達到400 nm（圖5c），但其PDI 卻呈降低趨勢（圖5d），說明NaCas分子間的聚集效應(yīng)降低了分散的不均勻性。而NaCas-DGMO 復(fù)合物的粒徑整體變化幅度不大（圖5c），進一步表明NaCas-DGMO 復(fù)合物受pH 值影響不顯著。

圖5 NaCas、DGMO 及兩者復(fù)合物分散液在不同pH 條件下放置12 h（a、b）和24 h（c、d）的粒徑和PDIFig.5 Particle size and PDI of NaCas,DGMO and their complex dispersions at different pH for 12 hours (a,b) and 24 hours (c,d)

2.7 NaCl 濃度對NaCas-DGMO 復(fù)合物分散液的影響

鹽離子強度會改變蛋白質(zhì)界面的靜電作用而影響其對乳液的穩(wěn)定性。圖6 為不同NaCl 濃度對NaCas、DGMO及兩者復(fù)合物的影響，可以看出在0.05～0.30 mol/L NaCl 濃度范圍內(nèi)，放置12 h（圖6a、6b）和24 h（圖6c、6d）后的粒徑和PDI 值均變化不大，說明離子強度對NaCas-DGMO 復(fù)合物的穩(wěn)定性影響較小。相反，NaCas 分散液在同樣NaCl 濃度下的PDI 值處于0.48～0.66 之間，較高的PDI 說明NaCas 膠束在水中粒度分散性不均勻，孫勤等[27]的實驗結(jié)果也表明，當(dāng)離子強度為0.2 mol/L 時，采用微射流高壓均質(zhì)法制備的酪蛋白酸鈉-海藻油納米乳液的PDI 從0.22 變成0.31。這可能是因為較多鹽離子競爭吸附蛋白質(zhì)界面水分，一定程度上破壞了蛋白質(zhì)水化層，導(dǎo)致NaCas 膠束的聚集[28]。從而影響粒徑分布均一性。DGMO 未受NaCl濃度的影響，粒徑和PDI 均保持穩(wěn)定。粒徑和PDI 變化說明DGMO 能顯著改變NaCas 的表面性質(zhì)，使其耐受鹽離子強度，能增強NaCas 的分散性與均一性，抑制其團聚。

圖6 NaCas、DGMO 及兩者復(fù)合物在不同NaCl 濃度下放置12 h（a、b）和24 h（c、d）的粒徑和PDIFig.6 Particle size and PDI of NaCas,DGMO and their complexes at different NaCl concentrations for 12 hours (a,b)and 24 hours (c,d)

2.8 NaCas-DGMO 復(fù)合物穩(wěn)定O/W 乳液

在獲得穩(wěn)定NaCas-DGMO 復(fù)合物的基礎(chǔ)上，進一步對其乳化性能進行研究。圖7a、7b 和7c 分別為NaCas、DGMO 及80 ℃制備的兩者復(fù)合物穩(wěn)定O/W 乳液在0～30 d 的粒徑和PDI 變化。圖7a 可以看出，新制乳液樣品中隨著油相添加量的增加，NaCas 穩(wěn)定O/W乳液的粒徑逐漸增大，除油相添加量為5 倍的O/W 乳液的PDI 為0.24 外，其余均較高（PDI=0.37～0.42），表明NaCas 乳化油相能力有限，是因為隨油相增加缺乏足夠蛋白覆蓋于乳液界面而導(dǎo)致橋架凝聚（Bridging Flocculation）[29]。隨著儲存時間延長至15 d 和30 d，粒徑雖變化不大，但在樣品儲存過程中發(fā)現(xiàn)高于5 倍油相的O/W 乳液均出現(xiàn)分層現(xiàn)象，進一步表明NaCas較弱乳化能力。DGMO 穩(wěn)定O/W 乳液的粒徑和PDI在儲存過程中雖均有一定降低（圖7b），但除5 倍油相樣品外，也均出現(xiàn)破乳現(xiàn)象，亦說明其較弱乳化能力。然而，NaCas-DGMO 復(fù)合物穩(wěn)定的O/W 乳液在0～30 d的儲存期內(nèi)，對不同油相比例的O/W 乳液均表現(xiàn)出較低的粒徑（160.8～203.0 nm）和更低的PDI（圖7c）。前面研究可知，與DGMO 形成復(fù)合物后，NaCas 的表面疏水性增強，會使蛋白質(zhì)展開而增強乳化性，此外，DGMO 也與NaCas 競爭吸附油滴界面而提供穩(wěn)定作用。這與Cheong 等[30]研究結(jié)果一致。NaCas-DGMO 復(fù)合體系穩(wěn)定的O/W 乳液也表現(xiàn)出很好宏觀穩(wěn)定性，30 d 的儲存期內(nèi)無破乳現(xiàn)象。研究結(jié)果表明DGMO 能顯著增強NaCas 的乳化能力和乳液穩(wěn)定性。

圖7 NaCas(a)，DGMO(b)，NaCas-DGMO 復(fù)合物(c)穩(wěn)定不同油相比例O/W 乳液在儲存期間的粒徑和PDI 變化Fig.7 Particle size and PDI during storage of NaCas (a),DGMO(b),and NaCas-DGMO complex (c) stabilized O/W emulsions with different oil-phase ratios

2.9 激光共聚焦顯微鏡表征

激光共聚焦顯微鏡能從微觀角度解析NaCas、DGMO 和兩者復(fù)合物對O/W 乳液的穩(wěn)定情況，所述米糠油的添加量為乳化劑（NaCas、DGMO 和兩者復(fù)合物）質(zhì)量的10 倍。圖8 顯示了O/W 乳液儲存0 d 和30 d 后的激光共聚焦顯微圖（米糠油油滴被尼羅紅標記為紅色，NaCas 和DGMO 被FITC 標記為綠色）。圖8a 表明新制NaCas 穩(wěn)定乳液主要為亞微米級的液滴，而儲存30 d 后小液滴聚集形成大顆粒油滴（圖8d），說明納米級油滴在儲存過程中因為界面層蛋白質(zhì)量不足而發(fā)生橋架凝聚[29]，逐漸聚集形成微米級油滴。新制的DGMO 穩(wěn)定油相為粒徑分布均勻的油滴（圖8b），且油滴表面具有清晰的綠色界面層（DGMO 所含羥基與FITC 反應(yīng)后形成的吸附層），表明經(jīng)FITC 染色的DGMO 提供了很好的乳化穩(wěn)定作用。經(jīng)30 d 儲存后，油滴產(chǎn)生了明顯的因聚集作用而形成的多重乳液（圖8e），可以看出多重乳液表面有很清晰的綠色界面層（DGMO 吸附層）?？傊瑔为歂aCas 和DGMO 乳化O/W 納米乳液的穩(wěn)定性均有限，與前面粒徑和PDI 表征結(jié)果一致。相反，DGMO 與NaCas 復(fù)配后的乳液穩(wěn)定性得到很大改善（圖8c），一方面彌補了蛋白質(zhì)覆蓋量的不足，另一方面表面活性劑更好的乳化能力改善了乳化油相的效果。同時，圖8f 表明油滴表面具有明顯的界面層（FITC 染色的NaCas-DGMO 復(fù)合物）穩(wěn)定O/W 乳液，在放置30 d 后體系依舊穩(wěn)定（圖8f）。

圖8 O/W 乳液儲存0 d 和30 d 后CLSM 圖NaCas（a、d）、DGMO（b、e）、NaCas-DGMO 復(fù)合物（c、f）Fig.8 CLSM of NaCas (a,d),DGMO (b,e),NaCas-DGMO complex (c,f) after O/W emulsion storage for 0 and 30 days

2.10 負載檸檬醛米糠油乳液的表征

檸檬醛是一種具有濃烈檸檬香氣的天然香精，應(yīng)用遍及飲料、食品、醫(yī)藥業(yè)等[31,32]。但是，檸檬醛易因氧化反應(yīng)而變質(zhì)，是需要克服的主要障礙。在NaCas-DGMO 復(fù)合物穩(wěn)定的米糠油乳液體系基礎(chǔ)上，我們進一步研究了米糠油乳液對檸檬醛的負載效應(yīng)。負載檸檬醛后，米糠油乳液的粒徑和PDI 與檸檬醛的載量相關(guān)性不大（p＞0.05），在28 d 的儲存中保持著較為穩(wěn)定的存在。Kanafusa 等[33]將β-胡蘿卜素溶解于三油酸甘油酯中，并在含有NaCas 的水相中進行微流態(tài)化。在140 MPa 下微流化制得平均液滴直徑約為120 nm 的O/W 乳狀液，但可惜的是該乳液在4 ℃下的穩(wěn)定性僅為2 周。值得指出的是，所有乳液都具有較高的Zeta-電位絕對值（＞30 mV），說明乳液液滴之間的靜電斥力為穩(wěn)定的粒徑和PDI 提供了充足的保證。

表2 負載檸檬醛米糠油乳液的粒徑、PDI 和Zeta-電勢Table 2 Particle size,PDI,and Zeta-potential of citral-loaded rice bran oil emulsion

2.11 乳液中檸檬醛的穩(wěn)定性

檸檬醛存在孤立的C=C、C=O 雙鍵，容易發(fā)生氧化反應(yīng)，表3 顯示了乳液包封檸檬醛對其穩(wěn)定性的影響。在28 d 儲藏期，檸檬醛在第7 天的保留率基本一致，隨著時間延長，不同負載量的檸檬醛開始出現(xiàn)穩(wěn)定性差異，基本規(guī)律是檸檬醛占油相比例越高，保留率越高。與對照相比（NaCas 穩(wěn)定乳液），檸檬醛第28天的保留率為70.66%，顯著低于NaCas-DGMO 復(fù)合物穩(wěn)定的米糠油乳液77.61%，說明DGMO 的加入能提高乳液對檸檬醛的保護作用。檸檬醛的分解主要發(fā)生于乳液中油水界面處，NaCas-DGMO 復(fù)合物在米糠油表面形成更好的界面保護層，降低了檸檬醛向水相遷移的量，從而具有更高的保留率。與文獻報道的固體脂質(zhì)納米粒包封檸檬醛相比[34]（12 d 的保留率為67%），基于NaCas-DGMO復(fù)合物穩(wěn)定性的米糠油乳液對檸檬醛的保護作用更顯著。根據(jù)前述的NaCas-DGMO 復(fù)合物具有耐酸、耐鹽離子的特點，本文構(gòu)建的負載檸檬醛米糠油O/W 乳液可作為檸檬醛良好的遞送載體用于食品體系。

表3 檸檬醛在米糠油乳液中保留率變化Fig.3 Changes in the retention rate of citral in rice bran oil emulsion

3 結(jié)論

本研究利用DGMO與NaCas形成復(fù)合物顯著改善了NaCas 的水分散性，NaCas-DGMO 復(fù)合物的最佳制備條件為：質(zhì)量比為1:2（m/m），反應(yīng)溫度80 ℃，反應(yīng)時間1 h，此時復(fù)合物具有較低粒徑（238.10 nm）和很好分散性（0.27）。熒光光譜法和FT-IR 研究證明了復(fù)合物的形成，且復(fù)合體系顯著增強了NaCas 表面疏水性，由319.46 增長到596.46。與NaCas 相比，NaCas-DGMO 復(fù)合物在pH 值2、3、5、6、7 均具有更好的穩(wěn)定性和分散性，但在pH 值4 時不穩(wěn)定；在0.05～0.30 mol/L 的鹽離子濃度下，鹽離子對復(fù)合物穩(wěn)定性影響較小，而對NaCas 的影響很大，表明復(fù)合物顯著改善了NaCas 的離子穩(wěn)定性。NaCas-DGMO 復(fù)合物明顯改善了NaCas 穩(wěn)定O/W 乳液能力，負載檸檬醛的O/W 乳液仍具有很好穩(wěn)定性（粒徑為208～225 nm，PDI 為0.18～0.27）和對檸檬醛的保護作用（儲存28 d檸檬醛保留率達78.83%）。NaCas-DGMO 復(fù)合物體系有望用于穩(wěn)定乳液和脂溶性功能活性物質(zhì)的納米遞送。