王藝潼，王萍，徐飛，張彥軍*

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040） （2.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所，國(guó)家重要熱帶作物工程技術(shù)研究中心，海南省特色熱帶作物適宜性加工與品質(zhì)控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南省熱帶香料飲料作物工程技術(shù)研究中心，海南萬(wàn)寧 571533）

可可豆是可可作物（Theobroma cacaoL.）的種子，高含量的多酚類和黃酮類化合物使其具有抗氧化、預(yù)防心腦血管疾病等功能[1]?？煽啥怪泻胸S富的脂類物質(zhì)，約占種子干重的50%。油脂作為可可豆的主要經(jīng)濟(jì)產(chǎn)物，具有獨(dú)特的理化性質(zhì)，其熔點(diǎn)約為35～37 ℃。前期研究表明，通過(guò)超臨界CO2從可可豆油脂中提取的可可精油主要含飽和脂肪酸，棕櫚酸、硬脂酸及油酸含量較多[2]。可可油可以作為一種天然抗氧化劑，并對(duì)人體炎癥細(xì)胞產(chǎn)生影響，同時(shí)還對(duì)牙周病原菌、李斯特菌等有抑制作用[3]，而利用超臨界CO2提取可可精油的功能活性研究較少。

精油因其豐富的功效已被廣泛應(yīng)用各個(gè)行業(yè)，但因其自身性質(zhì)，存在著易揮發(fā)、水溶性差、化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定、氣味強(qiáng)烈、不便于貯藏和運(yùn)輸?shù)热毕?，在?yīng)用過(guò)程中往往達(dá)不到預(yù)期的效果[4]?？煽删秃推渌鸵粯樱资芸諝?、溫度、光線等因素的影響發(fā)生氧化變質(zhì)，精油的疏水性同樣導(dǎo)致其在應(yīng)用上存在很多限制。Pickering 乳液制備技術(shù)可以有效保護(hù)精油，很好地彌補(bǔ)植物精油的缺陷，并緩慢發(fā)揮精油自身功能作用。纖維素、大豆蛋白及乳清蛋白等作為天然大分子顆粒乳化劑雖然有良好的包埋性及水溶性，但是由于自身性質(zhì)不穩(wěn)定限制了這些穩(wěn)定劑的使用。辛烯基琥珀酸淀粉酯（Octenyl Succiniate Anhydrate Starch，簡(jiǎn)稱OSA 淀粉）作為一種最常見(jiàn)的改性淀粉顆粒被較多應(yīng)用為穩(wěn)定劑，淀粉進(jìn)行酯化改性后具有疏水性，可以吸附在油水界面，提高乳液穩(wěn)定性，乳化性、成膜性和水溶性極佳，應(yīng)用范圍較廣。Shah 等[5]以殼聚糖-三聚磷酸納米顆粒為乳化劑，制備以玉米油為油相的Pickering 乳液并負(fù)載姜黃素，對(duì)乳液體系抗氧化特性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素Pickering 乳液抗氧化能力高于姜黃素自身。Sun 等[6]以辛烯基琥珀酸淀粉鈉為顆粒乳化劑，穩(wěn)定肉桂精油制備Pickering 乳液，表明其對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸桿菌以及金黃色葡萄球菌均有抑制作用。

因此，本研究選取可可精油為原料，通過(guò)HS-SPME-GC-MS 聯(lián)用分析精油成分，測(cè)定油脂理化特性值。利用OSA 淀粉包裹可可精油制備Pickering 乳液后，通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察其形態(tài)。研究乳液對(duì)精油香氣釋放保護(hù)作用。以DPPH·和ABTS+·的清除能力評(píng)價(jià)其抗氧化活性；選取大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為研究對(duì)象，探究可可精油及其Pickering 乳液抑菌活性，以期為可可資源的開(kāi)發(fā)與利用提供理論依據(jù)，為可可精油的功能性應(yīng)用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

可可，中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所（2020年3 月）；辛烯基琥珀酸淀粉，源葉生物科技有限公司；DPPH 試劑、ABTS 試劑、奎諾二甲基丙烯酸酯，美國(guó)Sigma 公司；大腸桿菌（ATTCC8739）、金黃色葡萄球菌（ATTCC6538），廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

7890B-5977B 型氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國(guó)安捷倫；DK-98-ILA 型電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；FJ200-SH 型數(shù)顯高速分散均質(zhì)機(jī)，上海標(biāo)本模型廠；JY92-2D 型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；MasterSizer 3000 型粒徑分析儀，英國(guó)Malvern 公司；UV-2700 型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，蘇州島津公司；HR50-IIA2 型生物安全柜，中國(guó)青島海爾；DNP-9162BS-III 型電熱恒溫保溫箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 可可精油的HS-SPME-GC-MS 分析

1.3.1.1 萃取頭老化

使用萃取頭萃取三種熱帶特色作物精油揮發(fā)性成分前，先將萃取頭老化。老化條件為：250 ℃老化5 min。

1.3.1.2 頂空固相微萃取條件

參考文獻(xiàn)[7]的方法，稍作修改。取5 mL 精油，放入15 mL 帶有聚四氟乙烯硅膠墊的萃取瓶中，蓋緊瓶蓋后，放入70 ℃水浴震蕩加熱20 min 至溫度平衡。然后將SPME 針管穿過(guò)樣品瓶墊，伸出纖維頭，頂空萃取。當(dāng)氣相色譜儀達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)后，將SPME 穿過(guò)進(jìn)樣口隔墊40 mm，伸出纖維頭解析5 min。

1.3.1.3 GC-MS 條件

GC條件：色譜柱DB-WAX毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）彈性石英毛細(xì)管柱；起始溫度40 ℃，保持2 min，以3 ℃/min 的速率升至75 ℃，再以1.5 ℃/min的速率升至140 ℃，最后以10 ℃/min 的速率升到230 ℃，保持15 min；載氣為氦氣；流速為1 mL/min。

MS 條件：電子轟擊離子源（EI）；電子能量為70 eV；離子源溫度為230 ℃；四級(jí)桿溫度為150 ℃；檢測(cè)模式：30～450 u。按照GC-MS 譜庫(kù)（NIST 14，Mainlib，Replib）進(jìn)行檢索，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行分析。

1.3.2 可可精油理化特性

可可精油的酸價(jià)、碘值、過(guò)氧化值和皂化值分別參照GB/T 5009.229-2016[8]、GB/T 5532-2008[9]、GB/T 5009227-2016[10]和GB/T 5534-2008[11]。

1.3.3 可可精油Pickering 乳液制備

準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的OSA 淀粉，按照一定比例加入去離子水，在85 ℃下充分?jǐn)嚢?.5 h 后，冷卻降溫至50 ℃，制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%淀粉溶液。取體積分?jǐn)?shù)5%的可可精油逐滴加入到淀粉乳液中，使最終體積為10 mL。在相同溫度下，利用高壓剪切攪拌機(jī)攪拌3 min，轉(zhuǎn)速為10 000 r/min 條件下制備初乳液。在超聲功率300 W 條件下超聲7 min，得到Pickering 乳液。評(píng)價(jià)指標(biāo)為乳液粒徑D[4,3]（μm）。

1.3.4 可可精油Pickering 乳液粒徑測(cè)定

取適量的Pickering 乳液，用蒸餾水稀釋100 倍后室溫（25±1）℃下，通過(guò)馬爾文激光粒度儀測(cè)定乳液平均粒徑D[4,3]（μm）。折射率為1.46 和1.33，測(cè)粒徑時(shí)每個(gè)樣品測(cè)定9 次，每次間隔10 s[12]。

1.3.5 光學(xué)顯微鏡觀察

取10 μL 乳液滴至載玻片，蓋上蓋玻片，使用正立熒光顯微鏡放大100 倍進(jìn)行觀察，以評(píng)估液滴大小以及聚集狀態(tài)。

1.3.6 Pickering 乳液緩釋性

樣品貯藏于常溫常壓下，通過(guò)EN 測(cè)定貯藏過(guò)程中精油及其乳液香氣強(qiáng)度的變化。實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[13]所描述方法測(cè)定。檢測(cè)條件：載氣為純凈空氣；流速150 mL/min；樣品量50 μL；容器體積10 mL；加熱溫度50 ℃；加熱時(shí)間300 s；進(jìn)樣溫度60 ℃；進(jìn)樣體積1 500 μL；數(shù)據(jù)延遲時(shí)間180 s；數(shù)據(jù)采集時(shí)間90 s。每個(gè)樣品均進(jìn)行5次平行試驗(yàn)，電子鼻傳感器特性如表1 所示。

表1 電子鼻傳感器特性Table 1 Electronic nose sensor characteristics

1.3.7 可可精油及其Pickering 乳液抗氧化活性

1.3.7.1 可可精油及其乳液DPPH·清除能力

DPPH·清除能力參考文獻(xiàn)[14]，略作改動(dòng)。將2 mL不同濃度精油及等含油量Pickering 乳液添加到2 mL 0.2 mmol/L DPPH·-乙醇溶液中并立即攪拌。將混合物在室溫下避光，靜置30 min；將同濃度乳液試管中放置24 h 進(jìn)行釋放后，再添加DPPH·-乙醇溶液靜置30 min，用紫外分光光度計(jì)記錄517 nm（Ai）處的吸光度；對(duì)照組（Aj）用4 mL 無(wú)水乙醇代替0.2 mmol/L DPPH·，空白組（Ak）用2 mL 正己烷（精油）或相同濃度淀粉乳（Pickering 乳液）代替樣品，測(cè)定吸光值，每組樣品平行測(cè)定3 次取平均值。Trolox 用作陽(yáng)性對(duì)照。根據(jù)公式（1）計(jì)算清除率（B，%）：

1.3.7.2 可可精油及其乳液ABTS+·清除能力測(cè)定

參考文獻(xiàn)[15]測(cè)定ABTS+·清除率，有修改。通過(guò)將ABTS（7.4 mmol/L）與過(guò)硫酸鉀（2.6 mmol/L）混合，并在室溫下黑暗中靜置12～16 h 產(chǎn)生ABTS+·，獲得儲(chǔ)備液。使用前將ABTS+·儲(chǔ)備液用乙醇稀釋至在734 nm波長(zhǎng)下吸光度為0.70±0.02。將100 μL 不同濃度的精油及等含油量Pickering 乳液等分試樣加入ABTS+·乙醇混合液中放置6 min；將同濃度乳液試管中放置12 h 進(jìn)行釋放后，再添加ABTS+·乙醇混合液靜置6 min 后于734 nm 處測(cè)量其吸光度A1。正己烷代替精油或蒸餾水代替Pickering 乳液測(cè)得A0，無(wú)水乙醇代替ABTS+·工作液測(cè)得A2，每組樣品平行測(cè)定3 次取平均值。Trolox用作陽(yáng)性對(duì)照。根據(jù)公式（2）計(jì)算清除率（C，%）：

1.3.8 可可精油及其Pickering乳液抑菌活性測(cè)定

選取兩種食源性致病菌為研究對(duì)象，分別為大腸桿菌（革蘭氏陰性菌）和金黃色葡萄球菌（革蘭氏陽(yáng)性菌）。

1.3.8.1 濾紙片法測(cè)定抑菌活性

濾紙用打孔器制成直徑6 mm 的小圓紙片，高壓滅菌后備用。在超凈臺(tái)中將培養(yǎng)皿滅菌后倒入10～15 mL培養(yǎng)基，冷卻凝固后備用。無(wú)菌移液槍吸取100 μL 106CFU/mL 菌懸液與培養(yǎng)基表面，涂布均勻。用無(wú)菌鑷子夾取浸透精油及等含油量Pickering 乳液10 min 的濾紙片，每個(gè)固體平板均勻貼三片，其中一片為生理鹽水做空白對(duì)照。濾紙片之間保持一定距離，放置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑，結(jié)果取平均值。

1.3.8.2 抑菌率測(cè)定

采用二倍稀釋法[16]，將精油溶解于吐溫80 的水溶液中，配制濃度10 mg/mL 精油溶液后進(jìn)行倍比稀釋，等含油量Pickering 乳液用水稀釋，二者作為實(shí)驗(yàn)組，相同濃度吐溫80 和水（替代精油）或蒸餾水（替代乳液）的溶液作為空白組，不添加樣品作為對(duì)照組。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌在斜面培養(yǎng)基上活化后，用生理鹽水將菌種配成106CFU/mL的菌懸液，震蕩均勻。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)組中用無(wú)菌移液槍接菌懸液100 μL，37 ℃恒溫培養(yǎng)2 h。通過(guò)紫外分光光度計(jì)600 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定溶液濁度判斷菌種抑制率。根據(jù)公式（3）計(jì)算抑制率（E，%）：

式中：

OD1——實(shí)驗(yàn)組；

OD0——空白組；

OD2——對(duì)照組。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3 次重復(fù)，數(shù)據(jù)最后以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 21.0.1 中的單因素分析方法對(duì)實(shí)驗(yàn)中數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，p＜0.05 為顯著相關(guān)，采用Origin 2019 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 可可精油成分分析

可可精油CG-MS 化學(xué)成分總離子流圖見(jiàn)圖1，分析結(jié)果見(jiàn)表2。

圖1 可可精油總離子流圖和成分占比圖Fig.1 Total ion current diagram and composition ratio diagram of cocoa essential oil

表2 可可精油成分表Table 2 Analysis of cocoa essential oil components

續(xù)表2

從可可精油中總共分離檢測(cè)到42 種揮發(fā)性化學(xué)成分，利用質(zhì)譜信息與標(biāo)準(zhǔn)庫(kù)NIST14 分別對(duì)各色譜峰進(jìn)行初步檢索及相關(guān)文獻(xiàn)參考進(jìn)行定性分析，確定揮發(fā)性物質(zhì)名稱及相對(duì)含量。可可精油成分定性數(shù)據(jù)顯示，保留時(shí)間在3.27～58.60 min 范圍內(nèi)，萜烯類占23.81%，酯類占20.41%，醇類占11.81%?？煽删椭兄饕煞譃橐宜嵋阴ィ≧C：4.64%）、乙酸（RC：6.64%）、2,3-丁二醇（RC：5.27%），保留時(shí)間分別為RT：3.27 min，RT：28.90 min 和RT：24.95 min。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與劉夢(mèng)婭等[17]研究結(jié)果相似，3-羥基-2-丁酮（奶香）、2-壬酮（杏仁味）、乙酸乙酯（花香氣味）等物質(zhì)存在于加納可可脂中，本實(shí)驗(yàn)所制備可可精油中含有上述物質(zhì)的同時(shí)，還存在吡咯以及苯乙酮等其他物質(zhì)。

2.2 可可精油油脂特性分析

可可精油油脂特性分析結(jié)果如表3 所示。由表3可知，實(shí)驗(yàn)結(jié)果和各項(xiàng)指標(biāo)均符合《NY/T 751-2017 綠色食品食用植物油》。酸價(jià)可作為油脂質(zhì)量劣變的指標(biāo)，其決定了甘油三酯水解產(chǎn)生的游離脂肪酸的數(shù)量。在光、熱或脂肪酶的作用下，脂質(zhì)分子釋放出游離脂肪酸會(huì)影響油脂的穩(wěn)定性[18]。可可精油酸價(jià)最小0.21 mg KOH/g，在食用植物油國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中，植物原油的AV 值須低于4 mg/g。

表3 可可精油油脂特性值Table 3 Characteristic values of cocoa essential oil

過(guò)氧化值是油和脂肪氧化酸敗最廣泛使用的指標(biāo)之一。它是脂質(zhì)氧化初始階段形成的過(guò)氧化物和氫過(guò)氧化物濃度的量度。隨著時(shí)間的推移，油中氧化物含量的增加也會(huì)導(dǎo)致酸值升高?？煽删瓦^(guò)氧化值為0.19 mmol/kg 之間，結(jié)果遠(yuǎn)低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)20 mmol/kg。

碘值用于確定精油的脂肪酸不飽和程度，碘值越高不飽和脂肪酸含量越高，也可以用來(lái)評(píng)估油脂在工業(yè)應(yīng)用中的穩(wěn)定性。可可精油碘值最小為24.01 g/100 g oil，這與之前研究可可精油不飽和脂肪酸結(jié)果一致[2]。

皂化值是評(píng)估油中三酰基甘油脂肪酸鏈長(zhǎng)的效方法，精油的皂化值越高，游離脂肪酸含量越高而相對(duì)分子量越低[19]。較低的皂化值表明低分子量三酰基甘油含量非常高，也可以在一定程度上反應(yīng)油脂的純度?？煽删驮砘禐?75.31 mg KOH/g，與香草蘭精油[20]等其他精油相比，可可精油純度較高且分子量較小。Atolani 等[21]在C.sinensis種子油中也觀察到了精油不飽和脂肪酸的高比例與碘和皂化值的趨勢(shì)相關(guān)，與本研究結(jié)果相似。

2.3 乳液微觀結(jié)構(gòu)觀察

在100×光學(xué)顯微鏡可以明顯觀察到可可精油制備出Pickering 乳液具有較小且均勻的液滴顆粒，如圖2a所示。同時(shí)從粒度分布圖也可以看出，可可精油Pickering 乳液呈正態(tài)分布，分布范圍小且集中，粒徑大小主要集中于0.20～1.06 μm，平均粒徑D[4,3]為0.47 μm。

圖2 可可精油Pickering 乳液顯微鏡圖（a）和粒度分布圖（b）Fig.2 Microscope (a) and particle size distribution (b) of Pickering emulsion of cocoa essential oil

2.4 Pickering 乳液緩釋性分析

Pickering 乳液的緩釋性和穩(wěn)定性直接關(guān)系到精油的釋放效果，因此本實(shí)驗(yàn)用電子鼻分析可可精油以及Pickering 乳液14 d 內(nèi)對(duì)于T30/1 等五種傳感器響應(yīng)值變化，結(jié)果如圖3 所示。

圖3 可可精油及其Pickering 乳液傳感器響應(yīng)雷達(dá)圖Fig.3 Radar plots of cocoa essential oils and Pickering emulsion sensor responses

每一種感應(yīng)器代表一種化學(xué)物質(zhì)氣味，如表1 所示。檢測(cè)值越接近零，說(shuō)明該種氣味越小；檢測(cè)結(jié)果絕對(duì)值越大時(shí)，說(shuō)明氣味越大[22]。對(duì)比圖3a 與圖3b可知，香氣釋放量發(fā)生明顯變化。貯藏期相同的乳液中香氣釋放量為精油的1/10 左右。表明未用OSA 淀粉包裹的精油在14 d 內(nèi)貯藏過(guò)程中不穩(wěn)定，香氣釋放明顯?？煽删驮谫A藏期間香氣變化最大部分對(duì)應(yīng)的傳感器為T30/1、T70/2 和P30/2，而Pickering 乳液變化趨勢(shì)明顯減小，T70/2 傳感器在1～3 d 內(nèi)變化較大，對(duì)比表1 可知，芳香類物質(zhì)變化較為明顯。

將主成分分析（PCA）應(yīng)用于可可精油及其Pickering 乳液樣品貯藏14 d 電子鼻所得數(shù)據(jù)矩陣中，可以簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)從而得到樣品間或樣品與變量之間的關(guān)系，其中PCA 累計(jì)貢獻(xiàn)量越大，越能更好地反應(yīng)各個(gè)指標(biāo)的信息[23]。圖4a 與4b 均顯示，第一主成分（PC1）貢獻(xiàn)率為98.4%，第二主成分（PC2）貢獻(xiàn)率為1.6%，表明待測(cè)樣品各自聚為一類、可較高區(qū)分且量個(gè)主成分包含了揮發(fā)性成分的全部信息，能夠反應(yīng)樣品氣味的整體信息[24]。可可精油貯藏1～3 d 時(shí)，得分多聚集在PC1 負(fù)半軸，與傳感器T30/1、P30/2、T70/2 相關(guān)性較大；可可精油在5～14 d 時(shí)，得分全部為正，與傳感器LY2/gCT 和LY2/AA 相關(guān)?？煽删图捌銹ickering 乳液能夠較好按各自特性聚為一類，說(shuō)明將精油制備成乳液后，二者風(fēng)味相互獨(dú)立，14 d 內(nèi)Pickering 乳液樣品距離較近，并與14 d 內(nèi)貯存精油樣品距離較遠(yuǎn)，說(shuō)明使用OSA 淀粉穩(wěn)定精油制備乳液后對(duì)精油氣味的封閉效果更好，這為精油的貯藏及保護(hù)提供了依據(jù)。

圖4 貯藏期間可可精油及其Pickering 乳液PCA 得分和載荷圖Fig.4 PCA scores and loading diagrams of cocoa essential oil and Pickering emulsions under storage times

2.5 可可精油及其Pickering 抗氧化活性

2.5.1 DPPH·清除能力測(cè)定

可可精油及其Pickering 乳液對(duì)DPPH·清除率變化如圖5 所示?？煽删驮?0 min 對(duì)DPPH·清除率大于其Pickering 乳液，保持隨濃度增加抑制率增大趨勢(shì)。而在24 h 后，觀察到Pickering 乳液DPPH·清除能力顯著高于30 min（p＜0.05），其中可可精油Pickering 乳液在24 h 的DPPH·清除能力顯著高于可可精油和乳液30 min，達(dá)到最大值。當(dāng)可可精油為10 mg/mL 時(shí)，清除率達(dá)最高為23.59%；其等含油量Pickering乳液30 min清除率最高為18.34%，而Pickering 乳液在24 h 后清除率最高可達(dá)74.76%。產(chǎn)生此現(xiàn)象的原因可能是由于經(jīng)OSA 淀粉包裹精油制備Pickering 乳液后有助于提高精油的水溶性，提高精油與自由基接觸作用；30 min 時(shí)乳液抗氧化能力較差是由于此時(shí)精油被淀粉包裹，不能完全釋放，Pickering 乳液呈現(xiàn)隨時(shí)間緩慢釋放效果，從而在24 h 時(shí)，抗氧化能力最強(qiáng)。

圖5 可可精油及Pickering 乳液對(duì)DPPH·清除率Fig.5 Inhibition rate of DPPH· by cocoa essential oils and Pickering emulsion

2.5.2 ABTS+·清除能力

如圖6 所示，可可精油在6 min 對(duì)ABTS+·清除率大于其Pickering 乳液，同樣保持隨濃度增加抑制率增大趨勢(shì)。而在12 h 后，觀察到Pickering 乳液對(duì)ABTS+·清除能力顯著高于乳液6 min（p＜0.05）。其中可可精油Pickering 乳液在12 h 對(duì)ABTS+·清除率顯著高于6 min 且達(dá)到最大值?？煽删蛯?duì)ABTS+·清除能力顯著低于其他兩種精油，可可精油Pickering 乳液在6 min 時(shí)的清除率最低，而當(dāng)12 h 時(shí)，其對(duì)ABTS+·清除率相較于6 min 顯著增加且明顯超過(guò)可可精油（p＜0.05）?？煽删蜐舛葹? mg/mL 時(shí)，對(duì)ABTS+·清除率最高達(dá)24.91%，等含油量Pickering 乳液6 min 時(shí)清除率最高為14.16%；Pickering 乳液在12 h 時(shí)，清除率最高達(dá)44.13%。

圖6 可可精油及Pickering 乳液對(duì)ABTS+·清除率Fig.6 Inhibition rate of ABTS+· by cocoa essential oils and Pickering emulsion

可可中的酚類物質(zhì)和黃酮類物質(zhì)在許多研究中都被報(bào)道為具有抗氧化、抗自由基和抗癌特性的生物活性化合物[25]?？寡趸钚匀Q于酚類化合物中羥基的氫原子的移動(dòng)性。而對(duì)于超臨界CO2萃取出可可精油的抗氧化性未見(jiàn)報(bào)道。提取后的可可精油仍含有多種未被破壞的活性物質(zhì)，占比最多為萜烯類化合物（23.15%），如α-石竹烯（2.65%）和檸檬烯（2.82%）等發(fā)揮抗氧化功效，酚類和萜烯類成分的協(xié)同作用也是可可精油抗氧化性較高的主要原因。王瑩等[26]表明不飽和脂肪酸同樣具有抗氧化能力，根據(jù)之前的研究[18]表明，可可精油中含有35.34%不飽和脂肪酸。

2.6 可可精油及其Pickering 抑菌活性

2.6.1 抑菌圈試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)表4 可知，比較可可精油及其Pickering 乳液的抑菌圈直徑，發(fā)現(xiàn)Pickering 乳液對(duì)兩種供試菌的直徑明顯小于未包埋精油對(duì)兩種菌的直徑，但差異不顯著（p＜0.05）。產(chǎn)生此現(xiàn)象的原因，可能是由于介于兩相之間緊密的固體顆粒界面層阻礙了精油與供試菌的相互作用，從而造成Pickering 乳液抑菌活性相對(duì)較低[13]。對(duì)比兩種致病菌抑制效果，可可精油及其Pickering乳液對(duì)金黃色葡萄球菌菌具有最好的抑菌性，抑菌圈直徑分別為10.86 mm 和8.03 mm。

表4 可可精油及其Pickering乳液的兩種致病菌抑菌圈直徑（mm）Table 4 Diameter (mm) of two pathogenic bacteria inhibition zones of cocoa essential oil and Pickering emulsion

在可可精油中，α-石竹烯、3-蒈烯、D-檸檬烯等發(fā)揮抑菌作用[27]。與大腸桿菌（革蘭氏陰性菌）相比，金黃色葡萄球菌（革蘭氏陽(yáng)性菌）對(duì)可可精油及其Pickering乳液表現(xiàn)出相對(duì)更高的敏感性。根據(jù)Ahmed[28]研究，這可能歸因于微生物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)差異，革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁周圍的脂多糖會(huì)限制疏水化合物的擴(kuò)散，而疏水分子可以通過(guò)厚的肽聚糖層進(jìn)入革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞膜。

2.6.2 抑菌率測(cè)定

由圖7a 可知，隨著可可精油濃度的增加，其對(duì)大腸桿菌的抑制率持續(xù)高于可可精油Pickering 乳液，二者呈現(xiàn)顯著性差異（p＜0.05）。當(dāng)可可精油最高濃度為10 mg/mL 時(shí)，Pickering 乳液對(duì)大腸桿菌抑制率為52.17%，此時(shí)可可精油抑制率為65.07%。對(duì)大腸桿菌來(lái)說(shuō)，可可精油的半抑制濃度即IC50為6.70 mg/mL，Pickering 乳液的IC50為9.46 mg/mL。

圖7 可可精油及其Pickering 乳液對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制Fig.7 Inhibition of E.coil and S.aureus by cocoa essential oils and Pickering emulsion

由圖7b 可知，當(dāng)可可精油濃度為2 mg/mL 時(shí)，Pickering 乳液對(duì)金黃色葡萄球菌抑制率顯著高于精油（p＜0.05），二者抑制率分別為22.35%和29.85%；隨著可可精油濃度增加，Pickering 乳液抑制率逐漸低于可可精油。對(duì)金黃色葡萄球菌來(lái)說(shuō)，可可精油的IC50為7.18 mg/mL，Pickering 乳液的IC50為11.07 mg/mL。根據(jù)Huang[15]研究可知，將精油轉(zhuǎn)化為Pickering 乳液可提高其抑菌活性，可能的原因是純精油的水溶性低，不易與細(xì)胞膜相互作用，但乳液可以攜帶精油中的活性物質(zhì)破壞細(xì)胞膜，進(jìn)一步影響生物活性。由于乳液具有一定緩釋效果，本研究中Pickering 乳液的抑菌效果略小于精油，差異顯著（p＜0.05）。

3 結(jié)論

可可精油中萜烯類占比最高23.81%，同時(shí)還含有較高含量的酯類和醇類；主要成分為乙酸，占比6.64%，乙酸乙酯和2,3-丁二醇相對(duì)含量較高?？煽删陀椭匦灾档母黜?xiàng)指標(biāo)均符合《NY/T 751-2017 綠色食品食用植物油》。以O(shè)SA 淀粉制備Pickering 乳液粒徑最小可達(dá)（0.47±0.01）μm，光學(xué)顯微鏡觀察乳液液滴小且均一，將精油制備乳液后可以有效延緩香氣釋放?？煽删图捌銹ickering 乳液均具有較強(qiáng)清除自由基能力，二者對(duì)DPPH·清除能力高于ABTS+·；相比較于精油，Pickering 乳液放置24 h 后的DPPH·清除能力最高。同時(shí)，可可精油及其Pickering 乳液均具有較強(qiáng)抑菌活性，精油抑菌活性顯著高于Pickering 乳液（p＜0.05），同時(shí)二者均對(duì)金黃色葡萄球菌抑制作用高于大腸桿菌。