黃碧華
(福建省林業(yè)科技試驗中心,福建 南靖 363600)
多花黃精(Polygonatumcyrtonema)系百合科黃精屬多年生草本植物,集食用、藥用、觀賞于一身。黃精屬的種和品種很多,作為中藥使用的有黃精、滇黃精、多花黃精,以多花黃精品質(zhì)最佳。黃精主要含多糖、低聚糖、黃酮、蒽醌、皂苷、木脂素等化合物,性平、味甘,為滋補上品,具有滋陰潤燥、補腎益精、提高人體免疫力、抗衰老等功效[1-3]。隨著黃精市場需求量的增長,規(guī)范化人工栽培勢在必行,但黃精種苗問題成為限制人工大面積栽培的瓶頸,多年來,人工栽培黃精塊莖繁殖生長慢、成活率低,限制了黃精的生產(chǎn)規(guī)模,而傳統(tǒng)的種子繁殖,萌芽能力低且容易變異。因此,組培技術(shù)成為生產(chǎn)黃精優(yōu)良種苗的有效途徑,有關(guān)黃精包括多花黃精的組培快繁技術(shù)已有較多的文獻報道[1-10],但是已有研究結(jié)果得出的組培過程各種培養(yǎng)基的配置方案相差較大,在快繁生產(chǎn)上有的生根效果差甚至不可用,可能與外植體的種質(zhì)材料及其取材部位、組培室條件等有關(guān)。為此,借鑒已有黃精組培快繁中各種培養(yǎng)基植物生長調(diào)節(jié)劑如6-BA、NAA、2,4-D、GA,TDZ 、kT等不同濃度配比的可行性和局限性,針對福建省多花黃精的種質(zhì)資源及其藥用特性以及組培室條件等因素,針對性開展外植體消毒及組培各個環(huán)節(jié)的培養(yǎng)基配置改進與優(yōu)化試驗,建立優(yōu)化組培技術(shù)體系,為多花黃精種苗工廠化育苗生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。
于2020年,在福建省林業(yè)科技試驗中心南靖縣五板橋試驗基地,選取2年生多花黃精芽眼飽滿的地下莖塊為外植體材料。
各基本培養(yǎng)基均加入蔗糖25 g·L-1、瓊脂7 g·L-1,pH值5.5~5.8。培養(yǎng)環(huán)境溫度(25±2) ℃,前7 d進行弱光培養(yǎng),7 d后進行光照培養(yǎng),光照強度3000~5000 lx,光照時間10~16 h·d-1。
1.2.1 外植體污染控制方案優(yōu)化試驗 采用雙因素完全隨機區(qū)組設(shè)計,設(shè)置因素A:0.1%氯化汞、0.15%氯化汞2個水平,因素B:浸泡消毒外植體時間2、4、6、8、10、12 min共6個水平,組成12個處理組合,每處理共30個塊莖。
將多花黃精地下塊莖去除泥土和根系及葉片,用清水刷洗干凈,切取當年生長較嫩且?guī)а垦鄣膲K莖長約3~5 cm,按組培常規(guī)方法用70%~75%的酒精浸泡20 s,無菌水沖洗后[1-2],按試驗方案投入相應的氯化汞溶液消毒處理。之后,將消毒后的外植體轉(zhuǎn)接到誘導培養(yǎng)基(MS+6-BA 0.8 mg·L-1+NAA 0.6 mg·L-1+2,4-D 0.5 mg·L-1)上進行初代誘導培養(yǎng),30 d后調(diào)查記錄各處理的污染、死亡情況。
1.2.2 誘導培養(yǎng)基優(yōu)化試驗 采用L9(34)正交試驗設(shè)計,設(shè)因素A(基本培養(yǎng)基):B5、1/2 MS和MS,因素B(6-BA):0.5、0.8、1.6 mg·L-1,因素C(NAA):0.3、0.6、0.9 mg·L-1,因素D(2,4-D):0.2、0.5、1.0 mg·L-1,共9個處理組合,每處理30瓶,每瓶1個小塊莖。誘導培養(yǎng)40 d后調(diào)查記錄不定芽萌芽數(shù)。
1.2.3 增殖培養(yǎng)基優(yōu)化試驗 試驗采用L9(34)正交設(shè)計,設(shè)因素A:基本培養(yǎng)基WPM、1/2 MS和MS 3個水平;因素B:6-BA 0.6、1.2、2.4 mg·L-13個水平;因素C:GA 1、2、3 mg·L-13個水平;因素D:NAA 0、0.2、0.8 mg·L-13個水平,共9個處理組合,每處理30個帶芽小塊莖。培養(yǎng)環(huán)境溫度(25±2)℃,光照強度4000~6000 lx,光照時間12~14 h·d-1。培養(yǎng)50 d后,觀察并統(tǒng)計不定芽的增殖生長數(shù)[3-4]。
1.2.4 生根培養(yǎng)植物生長調(diào)節(jié)劑配比優(yōu)化試驗 采用L9(34)正交設(shè)計,設(shè)因素A:IBA 0.2、0.4、0.8 mg·L-13個水平;因素B:NAA 0.2、0.5、1.0 mg·L-1;因素C:AC 0、0.3、0.6 mg·L-1,共9個處理組合,每處理30個不定芽(有3~4片葉)進行生根培養(yǎng)試驗?;九囵B(yǎng)基均為1/2 MS,培養(yǎng)40 d后,記錄各處理的根長情況。
按公式:萌發(fā)率(%)=萌芽數(shù)量(個)/樣本數(shù)量(個)×100%[1-2],計算外植體萌發(fā)率。采用Excel 2003軟件整理數(shù)據(jù),SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析和多重比較。
由表1可知,外植體不同消毒處理方法,污染數(shù)量、萌芽率相差較大。方差分析結(jié)果表明,氯化汞質(zhì)量分數(shù)0.10%與0.15%的消毒效果沒差異(f=2.6650,P=0.1156),即0.10%和0.15%的氯化汞都可以用來外植體消毒,但是不同消毒時間(f=22.8970**,P=0.0001)以及氯化汞濃度與消毒時間的互作效應(f=32.6630**,P=0.0001)差異達極顯著水平。從消毒時間看,在氯化汞質(zhì)量分數(shù)0.10%或0.15%下,外植體消毒時間在6~10 min較適宜,當消毒時間5 min時,真菌污染較嚴重;而無論質(zhì)量分數(shù)0.1%或0.15%的氯化汞,若處理時間超過12 min,則外植體出現(xiàn)發(fā)黑死苗的現(xiàn)象嚴重。整體趨勢是氯化汞濃度高則消毒時間短些;濃度低則消毒時間相應長些。對各處理組合的萌芽率進行差異性LSD多重比較表明,第5組和第10組的消毒效果最佳,即0.10%氯化汞消毒10 min或0.15%氯化汞消毒8 min,萌芽率達到40.0%~46.67%,極顯著高于其它處理組合。該優(yōu)化消毒方案,在誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)20 d后,可以看到基部膨大鼓起,綠色愈傷膨大明顯;在培養(yǎng)時間延長至40 d,可觀察到基部小芽點已經(jīng)開始萌動,并分化出不定芽。
表1 外植體消毒處理試驗結(jié)果
從表2看出,不同處理組合的萌芽率相差較大,其中誘導不定芽數(shù)量最多的是處理2,平均17個,平均萌芽率56.67%;其次是處理3,平均萌芽率46.67%;其余處理誘導的不定芽數(shù)均較少。方差分析及多重比較結(jié)果表明,各因素對誘導培養(yǎng)均有顯著或極顯著的影響(F基本培養(yǎng)基=4.1836*,P=0.0483;F6-BA=10.6127**,P=0.00053;FNAA=11.9501**,P=0.0041;F2,4-D=6.1902*,P=0.0101),各因素均以2水平的萌芽率最高且顯著或極顯著高于相應因素的其它水平。結(jié)合極差值大小判斷,4個因素對多花黃精誘導萌芽的影響力的大小順序為:6-BA>NAA>2,4-D>基本培養(yǎng)基,即6-BA和NAA在誘導不定芽萌芽中起了主要作用。綜合上述分析結(jié)果,不定芽誘導數(shù)以處理2為最佳,即多花黃精誘導初代的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.8 mg·L-1+NAA 0.6 mg·L-1+2,4-D 0.5 mg·L-1。
表2 不同基本培養(yǎng)基及植物生長調(diào)節(jié)劑配比對誘導培養(yǎng)的影響
由表3可知,9種處理組合都能使黃精塊莖發(fā)芽生長,在細胞分裂素(6-BA)較低的情況下,以8號處理不定芽長勢最好,增殖倍數(shù)達5.3,基部愈傷膨大明顯、叢芽多、苗綠、健壯;在細胞分裂素(6-BA)較高的情況,3號和6號處理的平均增殖倍數(shù)比7號、8號低;在低濃度的NAA生長素情況下,1號、5號處理的增殖效果較差。經(jīng)方差分析及多重比較結(jié)果表明,8號處理,即MS+6-BA 1.2 mg·L-1+GA31.0 mg·L-1+NAA 0.8 mg·L-1的增殖效果最佳,增殖倍數(shù)顯著或極顯著高于其它處理組合。相比之下該組合更適合多花黃精的繼代增殖培養(yǎng),即在適當?shù)募毎至阉?6-BA)和生長素(GA+NAA)的配置下,誘導的愈傷組織可分化出嫩芽,而過高的6-BA分裂素誘導的愈傷組織無法分化出不定芽,這與有關(guān)報道[11-13]一致。
表3 不同基本培養(yǎng)基及植物生長調(diào)節(jié)劑配比對增殖倍數(shù)的影響
由表4看出,不同處理組合的生根數(shù)和生根率相差較大。以生根率為指標,方差分析及其多重比較結(jié)果表明,IBA不同水平間的生根率沒有差異(FIBA=1.1312,P=0.3445);即IBA在0.2~0.8 mg·L-1范圍內(nèi)對生根沒有影響。而NAA、AC在不同水平間的生根率均達顯著或極顯著差異水平(FNAA=20.7384,P=0.0001;FAC=4.1902,P=0.0321),NAA為1.0 mg·L-1時生根率最高;AC為0.3、0.6 mg·L-1時生根率最高,且兩水平間的生根率沒有差異。不同處理組合間,以處理7,即1/2 MS+NAA 1.0 mg·L-1+IBA 0.2 mg·L-1+AC 0.3 mg·L-1的生根數(shù)和生根率最高,分別為5.62條和97.62%,顯著或極顯著高于其它組合,是多花黃精誘導生根的最佳培養(yǎng)基配方。
表4 不同植物生長調(diào)節(jié)劑及濃度對生根的影響
通過多花黃精組培優(yōu)化試驗,建立了組培快繁技術(shù)體系:多花黃精外植體的優(yōu)化消毒方案為0.15% HgCl2消毒8 min或0.10% HgCl2消毒10 min;啟動誘導的優(yōu)化培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.8 mg·L-1+NAA 0.6 mg·L-1+2,4-D 0.5 mg·L-1;最佳的增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.2 mg·L-1+GA31.0 mg·L-1+NAA 0.8 mg·L-1,繼代增殖倍數(shù)達到5.3以上;最佳的生根培養(yǎng)基為1/2 MS+NAA 1.0 mg·L-1+IBA 0.2 mg·L-1+AC 0.3 mg·L-1,生根率達97.62%,平均根數(shù)為5.62條。
細胞分裂素6-BA對黃精組培苗生長具有顯著影響,已有研究表明6-BA的最佳濃度為1.0~4.0 mg·L-1之間[10,15],本研究得出多花黃精的增值培養(yǎng)基添加6-BA的最佳濃度為1.2 mg·L-1,與劉芳源等[11]認為6-BA最佳濃度為1.0 mg·L-1比較接近。此外,本試驗認為啟動誘導培養(yǎng)基同時添加適量的6-BA與NAA、2,4-D配合效果比劉紅美等[9-12]認為6-BA與2,4-D配比以及周建金等[5、13-15]認為6-BA與NAA配比的更優(yōu),更有利于多花黃精組培苗的誘導、增值培養(yǎng)。
另外,在本試驗及前期組培過程中還發(fā)現(xiàn)在生根時加入適量配比的萘乙酸和活性炭,基部的莖塊明顯,根系都從莖塊發(fā)根,后期可以嘗試在組培試驗室直接把生根苗基部的莖塊培養(yǎng)到2~3 cm,這有利于種植的成活率和節(jié)省戶外的管理時間,從而降低種植養(yǎng)護的成本,也就是說如果能使黃精在生根的過程中地下莖同時生長,那么得到的種苗在來年的春季就可移栽入大田使其直接生長。