詹思佳，蘇蔚瑩，王道梁，陳文嵩，蘭曉曄，孫雅倩，劉志彬，倪莉

（福州大學食品科學技術研究所 福建省食品生物技術創(chuàng)新技術研究中心 福州 350108）

武夷巖茶屬于半發(fā)酵茶，是烏龍茶的典型代表。它可細分為肉桂、水仙、大紅袍、白雞冠等。其中，肉桂是武夷巖茶的主要品種，其風味特征是香氣馥郁清長，帶乳香或桂皮香或花果香[1-2]。

武夷肉桂的香氣是評價其品質優(yōu)、劣的重要指標。揮發(fā)性成分的萃取是分析茶葉香氣成分核心環(huán)節(jié)。常用的揮發(fā)性成分萃取方法有同時蒸餾萃取法（Simultaneous Distillation Extraction，SDE）、減壓蒸餾萃?。╒acuum Distillation Extraction，VDE）、攪拌棒吸附萃?。⊿tir Bar Sorptive Extraction，SBSE）、溶劑輔助香氣萃取（Solvent Assisted Flavor Evaporation，SAFE）、超臨界流體萃?。⊿upercritical Fluid Extraction，SFE）、頂空固相微萃取法（Head Space Solid Phase Microextraction，HS-SPME）等[3-4]。其中，HS-SPME 和SDE 是目前應用最廣泛的揮發(fā)性成分萃取方法。張麗等[5]采用HS-SPME 萃取武夷巖茶的揮發(fā)性成分，結果表明該茶中醇類、含氮化合物和醛類所占比例較大。Liao 等[6]采用HS-SPME 萃取“烤玉米”香型綠茶的揮發(fā)性成分，其主要為醇類、醛類和酯類，同時發(fā)現HS-SPME 法所捕集到的主要是易揮發(fā)及中等揮發(fā)性的成分。周春娟等[7]發(fā)現SDE 法提取的鳳凰單樅茶的揮發(fā)性成分以醇類、烷烴、萜烯等高沸點的揮發(fā)性成分居多。Song 等[8]比較了SDE 法和VDE 對南非紅葉茶揮發(fā)性成分的影響，結果表明：SDE 法可以有效萃取低揮發(fā)性和高分子量的成分。不同的揮發(fā)性成分提取方法各有優(yōu)、缺點。HS-SPME 法是一種集樣品采集、萃取、濃縮、進樣、解析為一體的萃取方法，操作簡便、快速，不需要添加溶劑，能夠體現樣品的真實香氣，然而，HS-SPME 不利于萃取揮發(fā)性弱的成分，同時其提取效率與試驗條件的選取密切相關[3，9-10]。SDE 法將蒸餾與萃取合二為一，通過反復的萃取濃縮得到揮發(fā)性成分，然而，長時間的高溫萃取易導致樣品香氣失真[11]。目前的研究大多采用單一的揮發(fā)性成分提取方法，而單獨使用SDE 或HS-SPME 可能無法充分反映肉桂茶的香氣成分。

為了充分提取肉桂茶的揮發(fā)性成分，獲得較為完整的香氣組分輪廓，本文采用HS-SPME 和SDE 兩種方法萃取肉桂茶的揮發(fā)性成分，并對HS-SPME 的萃取條件，包括萃取纖維材料、萃取時間和溫度、鹽添加量進行優(yōu)化，為肉桂茶特征香氣成分的研究提高參考數據。

1 材料與方法

1.1 材料

茶葉樣品，福建省公泰茶葉有限公司武夷山制茶廠提供。氯化鈉、無水硫酸鈉、乙醚（分析純），國藥基團化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設備

7890-B/5977A 氣相色譜-質譜聯用儀（GCMS），美國Agilent 公司；手動固相微萃取裝置和固相微萃取頭（含有50/30 μm CAR/DVB/PDMS、100 μm PDMS、65 μm PDMS/DVB 和75 μm CAR/DVB/PDMS 萃取頭），美國Supelco 公司；BL150 電子天平，德國賽多利斯公司；DC-12 氮吹儀，上海安譜科學儀器有限公司；DF-1 集熱式磁力攪拌器，金壇市鑫渃實驗儀器廠；同時蒸餾萃取裝置，福州科翰實驗儀器貿易有限公司；QYSW-10B 超純水機，重慶前沿水處理設備有限公司；電熱套；HH-1 數字恒溫水浴鍋，常州普天儀器制造有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 茶香氣的萃取

1.3.1.1 頂空-固相微萃取條件優(yōu)化 稱取0.1 g茶粉、5 mL 沸騰去離子水與磁力轉子一同置于15 mL 頂空瓶中，浸提5 min。使用SPME 萃取樣品中的揮發(fā)性成分，比較4 種纖維頭（100 μm PDMS、65 μm PDMS/DVB、75 μm CAR/PDMS 和50/30 μm DVB/CAR/PDMS）、5 個萃取溫度（40，50，60，70，80 ℃）、5 個萃取時間（30，40，45，50，60 min）和5 個鹽添加量（10%，20%，30%，40%，50%）對揮發(fā)性成分的提取效果。SPME 在GC-MS 上的解吸附條件為250 ℃，5 min。

1.3.1.2 同時蒸餾萃取 依照文獻[11]報道的優(yōu)化的同時蒸餾萃取條件提取武夷肉桂的揮發(fā)性成分。得到的萃取液經氮氣濃縮除去大部分乙醚溶劑至1 mL，移入棕色小瓶中密封，于-20 ℃冰箱保存，待GC-MS 分析。

1.3.2 GC-MS 分析條件 色譜條件：色譜柱HPINNOWAX 毛細管柱（30 m × 0.25 μm ×0.25 mm）；升溫程序：初始溫度40 ℃，保持5 min，以5 ℃/min 升至120 ℃，再以10 ℃/min 升至240 ℃，保留5 min；后運行溫度240 ℃，后運行時間5 min；進樣口溫度250 ℃；進樣方式：不分流進樣。載氣為高純He，純度99.999%。

質譜條件：離子源溫度230 ℃；四級桿溫度150 ℃；掃描模式：全掃描；質量掃描范圍：m/z 35-450。

1.4 數據分析

結合NIST11 譜庫檢索和保留指數RI，根據參考文獻[12]，[13]共同定性。揮發(fā)性成分定量采用面積歸一化法。

2 結果與討論

2.1 優(yōu)化的頂空-固相微萃取條件

2.1.1 萃取纖維 選擇合適的萃取纖維對茶香氣的萃取非常重要。萃取纖維是基于揮發(fā)性成分在涂有極性或非極性固定性薄層的熔融石英纖維上吸附和解吸，PDMS 為非極性萃取頭，主要吸附非極性揮發(fā)性成分；CAR/PDMS 和PDMS/DVB 具有雙極性特性；DVB/CAR/PDMS 包含3 種涂層，主要吸附C3～C20 揮發(fā)性和半揮發(fā)性成分[14]。本試驗對4 種常見的萃取纖維（DVB/CAR/PDMS、CAR/PDMS、PMDS/DVB 和PDMS）在50 ℃下萃取45 min，并添加40% NaCl，進行比較分析，結果見圖1。不同萃取纖維所得揮發(fā)性成分的總量（總峰面積）有顯著差異（P＜0.05）。其中，DVB/CAR/PDMS 纖維所萃取的揮發(fā)性成分總峰面積和數量最多，而PDMS 最少，可能是因為DVB/CAR/PDMS是一種具極性和非極性復合涂層的萃取纖維，它對揮發(fā)性成分的萃取效果最好。同時，這4 種常見的萃取纖維對不同種類揮發(fā)性成分的萃取也存在較大的差異（圖2）。CAR/PDMS/DVB 對醇類、酚類、呋喃類、含氮化合物、酮類和酯類的萃取效果好，CAR/PDMS 對含氮化合物和烴類萃取效果好，PMDS/DVB 適合萃取酯類成分。綜上，CAR/PDMS/DVB 對武夷肉桂揮發(fā)性成分的萃取效果最好。

圖1 萃取纖維對總峰面積（a）和峰數（b）的影響Fig.1 Effect of fibers on total peak area and total peak number

圖2 萃取纖維對不同揮發(fā)性成分類別的影響Fig.2 Effect of fibers on the classes of volatile components

2.1.2 萃取溫度 在確定最佳萃取纖維材料（CAR/PDMS/DVB）后，探究萃取溫度（40，50，60，70，80 ℃）對肉桂揮發(fā)性成分的影響，結果如圖3所示。當萃取溫度為50 ℃時，揮發(fā)性成分的總峰面積和數量達到峰值，隨后，隨著溫度的上升，揮發(fā)性成分的總峰面積顯著下降。提高萃取溫度有利于加速揮發(fā)性成分的擴散速率，而HS-SPME過高的萃取溫度會降低其的分配系數，導致揮發(fā)性成分的萃取效率降低[15]。綜上，選擇50 ℃作為最佳的萃取溫度。

圖3 萃取溫度對總峰面積（a）和峰數（b）的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on total peak area and total peak number

2.1.3 萃取時間 萃取纖維需暴露在頂空一段時間，以萃取茶葉中的揮發(fā)性成分。探究5 個萃取時間（30，40，45，50，60 min）對揮發(fā)性成分的影響。結果表明，揮發(fā)性成分的總峰面積和數量隨著萃取時間的延長而顯著增加，在60 min 時顯著降低（圖4）。這一變化趨勢與Du 等[14]的研究結果一致，HS-SPME 的萃取時間在低于60 min 時，揮發(fā)性成分總峰面積顯著上升，而高于60 min 時顯著降低。樣品萃取時間過短，頂空、萃取纖維和茶湯之間無法達到平衡；萃取時間過長，會引起揮發(fā)性成分在萃取纖維吸附相上發(fā)生位點競爭，導致香氣成分總量降低[16]。選擇最佳萃取時間50 min。

圖4 萃取時間對總峰面積（a）和峰數（b）的影響Fig.4 Effect of extraction times on total peak area and total peak number

2.1.4 鹽添加量 選擇加鹽量10%，20%，30%，40%，50%，研究鹽添加量對揮發(fā)性成分的影響。茶葉萃取過程中加鹽有利于降低揮發(fā)性成分的水溶性，促進擴散速率，結果見圖5。揮發(fā)性成分的總峰面積在統計學上無顯著差異。當鹽添加量為20%時，收集的揮發(fā)性成分種類最多。這可能是因為鹽含量過高，存在溶液黏度增大的風險，導致萃取效率降低[17]。選取最佳鹽添加量20%。

圖5 鹽添加量對總峰面積（a）和峰數（b）的影響Fig.5 Effect of salt contents on total peak area and total peak number

2.2 HS-SPME 和SDE 兩種提取方法所得揮發(fā)性成分

采用優(yōu)化后的HS-SPME 條件和文獻報道的SDE 條件[11]提取武夷肉桂揮發(fā)性成分，采用GCMS 進行定性、定量分析，所得總離子流圖見圖6。采用兩種萃取方法共鑒定出93 種揮發(fā)性成分，各成分的定性與定量結果見表1。其中，采用HSSPME 法共鑒定出84 種揮發(fā)性成分，SDE 法為40種。兩種方法共同檢出的成分有26 種。綜合兩種提取方法可知，武夷肉桂中的主要的揮發(fā)性成分有雜環(huán)類化合物、醇類、烯烴類和酯類等。兩種方法對這些物質的萃取效率有一定差異。

圖6 HS-SPME（a）與SDE（b）提取武夷肉桂茶揮發(fā)性成分總離子流圖Fig.6 Total ion current chromatograms of volatile compounds from Wuyi rougui extracted by HS-SPME and SDE

雜環(huán)類化合物，如吡嗪、吡咯、吲哚、呋喃等[18]，主要是茶葉在加工過程中發(fā)生美拉德反應而形成的香氣成分。從表1 可知，2-甲基吡嗪、2-乙基吡嗪、2，5-二甲基吡嗪、2，6-二甲基吡嗪、2-乙基-5-甲基吡嗪和吲哚在兩種提取方法中均有檢出。吡嗪、吡咯和呋喃是美拉德反應形成的關鍵產物，其中吡嗪是具有強烈的焙烤香、堅果香的揮發(fā)性成分，并且有較低的感官閾值[19]。吲哚也是烏龍茶的重要香氣成分，在低濃度下呈現濃郁的花香。對比兩種提取方法發(fā)現，HS-SMPE 對吡嗪、吡咯和呋喃的提取效率更高，例如用HS-SPME 法所得2，5-二甲基吡嗪含量為1.39%，而SDE 法為0.60%；HS-SPME 法檢出茶吡咯為15.13%，而SDE 法中未被檢出；在HS-SPME 法得到的糠醛含量為2.22%，而SDE 法為1.39%。然而，SDE 有利于吲哚的萃取，其含量為1.24%，而HS-SPME法僅為0.47%。

表1 經HS-SPME 和SDE 萃取后武夷肉桂的揮發(fā)性成分Table 1 The volatile compounds of Wuyi rougui by HS-SPME and SDE

（續(xù)表1）

（續(xù)表1）

醇類在肉桂中所占比例較大，僅次于雜環(huán)類化合物。其中芳樟醇、苯甲醇、苯乙醇和橙花叔醇在兩種提取方式下均有檢出。芳樟醇是茶葉中呈現花香的萜烯醇類。在磷酸甲基赤蘚糖醇途徑中生成的香葉焦磷酸是生成芳樟醇的重要前體物質[20]。苯甲醇和苯乙醇是茶葉中呈現“果香”的重要成分，可以通過苯丙氨酸轉化形成[21]。橙花叔醇具有玫瑰、水果香氣，是衡量肉桂品質的重要香氣成分。兩種提取方法對醇類的提取效率存在很大的差異，HS-SPME 法適合提取中、低沸點的脂肪族醇類，如己醇、反-3-己烯醇、庚醇和1-辛烯-3-醇等，它們在SDE 法均未檢出，可能因為SDE 法的長時間高溫萃取導致中、低沸點脂肪族醇類的損失。SDE 法有利于提取揮發(fā)性較低的醇類，如葉醇和異植醇，它們僅在SDE 法中被檢出，主要呈現清香和花香，然而，它們的氣味閾值高不易被感知，雖然含量較高，但是這兩種化合物的揮發(fā)性較低[14，22]，對武夷肉桂的香氣貢獻不大。

烯烴類也是構成武夷肉桂揮發(fā)性成分的重要一部分。王鵬杰等[23]發(fā)現武夷巖茶香氣成分以醇、烯、酯類化合物居多，橙花叔醇、α-法尼烯、吲哚、（Z）-己酸-3-己烯酯是巖茶的特征香氣成分。兩種提取方法均檢出α-法尼烯、對二甲苯。α-法尼烯主要呈花香，可通過類胡蘿卜素非酶促氧化而形成[24]，其在HS-SPME 和SDE 法的含量分別為0.48%和1.07%，是武夷肉桂較為重要的香氣成分。HSSPME 法檢出對二甲苯為4.52%，SDE 法僅為0.16%。

酯類通常被認為是茶葉中一類具有花果香特征的香氣成分，是肉桂重要的一類揮發(fā)性成分。2-糠酸甲酯、己酸己酯、水楊酸甲酯和棕櫚酸甲酯在兩種提取方法中均有檢出，僅含量存在差異。如2-糠酸甲酯在茶葉中主要呈現焦糖香，它在SDE法的含量為1.60%，HS-SPME 法為0.66%。棕櫚酸甲酯是一類高沸點、高分子量的成分，主要呈現蠟香，氣味強度極低，在SDE 法檢出為2.44%，而在HS-SPME 法僅為0.04%。水楊酸甲酯是茶葉中重要的甜香、薄荷香風味的貢獻者，HS-SPME 的萃取效率較高，為2.82%，而SDE 法僅為0.28%。茉莉內酯、己酸葉醇酯、乙酸芐酯、苯乙酸甲酯等僅在HS-SPME 中被檢出，亞麻酸甲酯、鄰苯二甲酸二丁酯等僅在SDE 法被檢出。

HS-SPME 較SDE 法更適合提取酮類成分，僅β-紫羅蘭酮在兩種提取方法均有檢出，它是茶葉中一類具有木質味、紫羅蘭香的成分，可通過β-類胡蘿卜素氧化形成[25]，然而，它在肉桂中的含量較低。與SDE 相比，HS-SPME 法檢出的酚類和酸類含量較少，可能是因為酚類和酸類成分一般沸點較高，而HS-SPME 相對于SDE 法而言是一種比較溫和的萃取方式，萃取溫度較低不利于這些成分的萃取。

通過兩種提取方法的對比，發(fā)現HS-SPME法和SDE 法所得揮發(fā)性成分含量和種類存在明顯差異。相比于SDE，HS-SPME 法對雜環(huán)類化合物、中低沸點脂肪族醇類、烯烴類、酮類的萃取效率高；而SDE 法適合萃取分子量大和揮發(fā)性弱的成分，如沸點較高的醇類（葉醇和異植醇）、酚類和酸類。兩者對于酯類的萃取效果相當。HS-SPME法相對于SDE 法萃取條件較為溫和，有利于萃取揮發(fā)性強和熱敏性的成分，然而，限制了揮發(fā)性較弱成分的提取。SDE 法需在長時間高溫條件下反復萃取濃縮，易造成低沸點和熱不穩(wěn)定性揮發(fā)性成分的損失，然而，有利于萃取分子量較高、揮發(fā)性弱的成分。這兩種萃取方法各具特點，可相互補充。使用兩種萃取方法可更全面反映肉桂的揮發(fā)性成分。

3 結論

本文優(yōu)化了HS-SPME 提取武夷肉桂揮發(fā)性成分的方法，結果表明最優(yōu)的提取條件為：采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取纖維，萃取溫度50 ℃，萃取時間50 min，NaCl 添加量30%，在該條件下共獲得84 種揮發(fā)性成分。對比了優(yōu)化的HSSPME 與文獻報道的SDE 兩種萃取方法對武夷肉桂揮發(fā)性成分的提取效果，結果發(fā)現二者對肉桂揮發(fā)性成分的提取效果存在明顯差異，對于酯類的萃取效率相當。HS-SPME 在提取雜環(huán)類化合物、中、低沸點脂肪族醇類、烯烴類、酮類的效率高于SDE；而SDE 因提取時間長，提取溫度高，更有利于萃取高分子量、高沸點的揮發(fā)性成分提取，同時會造成低沸點揮發(fā)性成分的損失。綜上，結合兩種提取方法可全面反映肉桂的香氣成分。