楊峰，李瑩瑩，王守偉，劉文婷，李石磊

（中國肉類食品綜合研究中心 北京食品科學(xué)研究院 北京 100068）

細(xì)胞培育肉也被稱作培養(yǎng)肉、人造肉、清潔肉等[1-2]，是利用動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)的方式控制其快速增殖、定向分化，收集加工而成的一種新型肉類食品[3-4]，是基于生物工程技術(shù)生產(chǎn)的肉類產(chǎn)品。該類肉品因可以繞開動(dòng)物飼喂而可持續(xù)地為人類供應(yīng)真實(shí)動(dòng)物蛋白，被認(rèn)為是最有可能解決未來人類肉品生產(chǎn)和消費(fèi)困境的方案[5]。相對于植物蛋白素肉，培育肉以其可為人類提供真實(shí)動(dòng)物蛋白而被廣泛看作是最具商業(yè)價(jià)值潛力的肉類替代物[6]，在生產(chǎn)技術(shù)、發(fā)展理念和存在意義等方面具有較強(qiáng)的先進(jìn)性。與傳統(tǒng)肉類生產(chǎn)方式相比，細(xì)胞培育肉生產(chǎn)占用的土地面積將減少95%，水消耗量將減少75%，溫室氣體排放量將減少87%，能源消耗將減少45%，這將從技術(shù)層面助力肉類產(chǎn)業(yè)實(shí)現(xiàn)“雙碳目標(biāo)”[7-8]，推動(dòng)肉類食品產(chǎn)業(yè)綠色可持續(xù)發(fā)展。

目前細(xì)胞培育肉的生產(chǎn)主要包括細(xì)胞選擇和細(xì)胞庫建立、規(guī)模化增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞收獲、終產(chǎn)品加工[9]。種類豐富、高活力的種子細(xì)胞是生產(chǎn)細(xì)胞培育肉的源頭，種子細(xì)胞的獲取也是生產(chǎn)細(xì)胞培育肉的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[10]。目前開展的細(xì)胞培育肉研究，種子細(xì)胞主要通過從牛[11-13]等動(dòng)物中提取、分離獲得高純度的肌肉干細(xì)胞，然而，這些細(xì)胞活化后分化為成肌細(xì)胞即失去干性，無法永久性持續(xù)增長，細(xì)胞傳代能力仍然面臨著諸多挑戰(zhàn)[14-15]。另外，持續(xù)從動(dòng)物機(jī)體獲取細(xì)胞也違背了動(dòng)物福利[16]。細(xì)胞培育肉技術(shù)的快速發(fā)展推動(dòng)了細(xì)胞培育肉的工業(yè)化進(jìn)程，也面臨著大量種子細(xì)胞制備的需求，因此亟待構(gòu)建高效、可持續(xù)的種子細(xì)胞的制備方法。

細(xì)胞永生化技術(shù)[17]可以使得細(xì)胞獲得持續(xù)生長的增殖能力，長期傳代，并具有無限增殖的生長特性，克服一般原代細(xì)胞有限次傳代后即發(fā)生衰老和死亡的情況。成體細(xì)胞的永生化，包括端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)染[18-19]、基因敲除類恢復(fù)性誘導(dǎo)[20]、四小吉奎琳氧化法以及黃曲霉素刺激法[21-22]，然而，目前僅限于基礎(chǔ)研究，現(xiàn)存的永生化細(xì)胞系多為小鼠或人源細(xì)胞，無法直接應(yīng)用于細(xì)胞培育肉體系，更不能用于食品科學(xué)的研究。本研究利用豬成肌細(xì)胞，通過端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行誘導(dǎo)載體的構(gòu)建，核轉(zhuǎn)染到細(xì)胞后分別通過免疫熒光標(biāo)記、定量PCR、染色體核型分析等方法進(jìn)行細(xì)胞誘導(dǎo)驗(yàn)證，以期實(shí)現(xiàn)豬源永生化成肌細(xì)胞的誘導(dǎo)，構(gòu)建穩(wěn)定性強(qiáng)的豬成肌細(xì)胞永生化誘導(dǎo)載體，為細(xì)胞培育肉種子細(xì)胞制備提供更高效的技術(shù)手段，為細(xì)胞培育肉工業(yè)化生產(chǎn)種子細(xì)胞獲取打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肌衛(wèi)星細(xì)胞取自新生豬胎兒大腿肌肉，通過組織貼壁法進(jìn)行培養(yǎng)傳代；GatewayBP Clonase II Enzyme Mix，GatewayLR ClonaseTMII Plus Enzyme Mix，Lipofectamine 2000 Reagent，Taq DNA Polymerase，100 bp DNA Ladder，dNTP Mix，GeneRuler，GeneRuler TM 1 kb DNA Ladder，美國賽默飛世爾科技有限公司；PrimeSTAR HS DNA Polymerase，日本Takara 公司；Sanprep 柱式膠回收試劑盒，生工生物工程（上海）股份有限公司；RNA 提取試劑盒，質(zhì)粒小提試劑盒，DH5α 感受態(tài)細(xì)胞、無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司；DMEM 培養(yǎng)基，Ampicillin LB瓊脂平板，云舟生物科技（廣州）股份有限公司；限制性內(nèi)切酶，胰酶，美國NEB 公司；胎牛血清，細(xì)胞培養(yǎng)皿，美國康寧公司；Lenti-X p24 Rapid Titer Kit，美國Clontech 公司；EP 管，美國Axygen公司；Triton X-100，牛血清白蛋白，山羊血清，嘌呤霉素，北京索萊寶科技有限公司；其它試劑為國產(chǎn)分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

PCR 儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad 公司；水平電泳槽，北京六一生物科技有限公司；倒置熒光顯微鏡，日本奧林巴斯公司；流式細(xì)胞儀，美國貝克曼公司；NanoDrop8000，美國賽默飛世爾科技有限公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、冰箱（-80 ℃）、CO2培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；臺(tái)式冷凍離心機(jī)，美國艾本德有限公司；渦旋混合器，德國IKA 公司；恒溫水浴鍋，上海比朗儀器；震蕩培養(yǎng)箱，上海旻泉儀器有限公司；冰箱（-20 ℃），中科美菱低溫科技股份有限公司；超純水儀，美國Millipore 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 永生化誘導(dǎo)載體的構(gòu)建 豬成肌細(xì)胞永生化誘導(dǎo)載體構(gòu)建流程如下：

引物設(shè)計(jì)，PCR 克隆目的片段→目的片段切膠回收→BP 反應(yīng)構(gòu)建中間載體→中間載體測序鑒定→LR 反應(yīng)，轉(zhuǎn)化及終載體陽性克隆鑒定。

1.3.1.1 BP 反應(yīng)構(gòu)建pDown-TERT[NM_198253.3]中間載體 根據(jù)BP 反應(yīng)原理，設(shè)計(jì)引物序列：attB site+特異性引物序 列：TERT BP-F：5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGC CGCGCGCTCCCCTERT；BP-R：5 -GGGGACCAC TTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCAGTCCAGGATG GTCTTGAAGTCTG。PCR 反應(yīng)體系：5×Primer STARTM Buffer，10 μL；dNTP Mixture（10 μmol/L），4 μL；引物-F（10 μmol/L ）、引物-R（10 μmol/L）、模板DNA，各1 μL；Primer STARTMHS DNA Polymerase，0.5 μL；總體積50 μL。PCR 反應(yīng)程序：98 ℃，3 min；98 ℃10 s，60 ℃10 s，72 ℃60 s，循環(huán)次數(shù)均為30 次；72 ℃5 min。PCR 反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，從瓊脂糖凝膠切下含目標(biāo)片段的膠塊，通過Sanprep 柱式膠回收試劑盒進(jìn)行DNA 回收，將DNA 置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

參考質(zhì)粒小提試劑盒說明書，制備該載體構(gòu)建過程中使用到的各種骨架載體DNA。BP 反應(yīng)體系：attB-PCR 產(chǎn)物，75 ng；pDONR 221 骨架載體，75 ng；BP ClonaseTMII Enzyme Mix，1 μL；TE Buffer，pH 8.0，加至4 μL。BP 反應(yīng)條件：25 ℃孵育1 h；反應(yīng)后，加1 μL 蛋白酶K，37 ℃孵育15 min 終止BP 反應(yīng)。

從-80 ℃中取出感受態(tài)細(xì)胞，冰上解凍；在超凈工作臺(tái)中，取5 μL BP 反應(yīng)產(chǎn)物加入100 μL感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈混勻；冰浴30 min；42 ℃熱激90 s；冰浴2～3 min；加入250 μL LB 培養(yǎng)基；250 r/min，37 ℃，搖菌培養(yǎng)（復(fù)蘇）1 h 左右；將復(fù)蘇的菌液涂布到含有Kana 抗生素的平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜。隨機(jī)挑取3～6 個(gè)單菌落，將菌體涮洗在無菌0.2 mL 的無菌EP 管中，取1 μL 做菌落PCR的模板，剩余作為接種培養(yǎng)細(xì)菌抽提質(zhì)粒DNA 的菌種。

菌落PCR 反應(yīng)體系：模板1 μL，dNTP Mixture（2.1 mmol/L）0.8 μL，測序引物-F1（10 μmol/L）0.5 μL，測序引物-R（10 μmol/L）0.5 μL，10 ×Buffer 1 μL，Taq DNA Polymerase 0.5 μL。菌落PCR 反應(yīng)程序：94 ℃3 min；94 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃1 min/1～2 kb，循環(huán)次數(shù)均為25 次；72 ℃5～10 min。菌落PCR 結(jié)束之后，加入6×loading buffer 后電泳，參照DNA Ladder 挑選出能擴(kuò)增出目標(biāo)長度的克隆，接種到LB 培養(yǎng)基中，37 ℃250 r/min 培養(yǎng)過夜，隨后抽提小提質(zhì)粒DNA 送測序，采用Sequencher 軟件比對返還的測序結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)序列，測序正確的入門載體可以進(jìn)入下一步LR反應(yīng)構(gòu)建最終載體。

1.3.1.2 LR 反應(yīng)構(gòu)建pLV [Exp]-EGFP：T2A：Puro-CMV>TERT[NM_198253.3]最終載體 通過LR 反應(yīng)將目的序列重組到最終骨架載體，獲得含有目的序列的重組表達(dá)載體。首先進(jìn)行LR 反應(yīng)。LR 反應(yīng)體系：pUP-CMV 10 ng，pDown-TERT[NM_198253.3] 10 ng，pLV[Exp]-EGFP：T2A：Puro 50 ng，LR clonase 1 μL，TE buffer 加至5 μL 終體系。LR 反應(yīng)條件：25 ℃孵育3 h。反應(yīng)結(jié)束后加入1 μL 蛋白酶K 37 ℃孵育15 min 終止反應(yīng)。之后對反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR，瓊脂糖凝膠電泳，接種培養(yǎng)細(xì)菌并抽提質(zhì)粒DNA（方法同1.3.1.1 節(jié)）。采用NEB 的限制性內(nèi)切酶對最終載體的質(zhì)粒DNA 進(jìn)行酶切，酶切反應(yīng)結(jié)束后，瓊脂糖凝膠電泳并參照DNA Ladder 進(jìn)行分析，能且僅能切出特定長度的DNA 條帶的載體ApaLI+EcoRV：936，660，3 985，1 246，5 356，即為正確的最終載體。

1.3.1.3 慢病毒包裝 對終載體進(jìn)行質(zhì)粒DNA大提（方法參照質(zhì)粒提取試劑盒說明書），通過脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HEK293T 細(xì)胞及收毒，即：將HEK293T 細(xì)胞培養(yǎng)至融合度為80%～90%；更換新培養(yǎng)基1 h 后加入Opti-MEMI 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；分別混合A、B 液，其中A 液為1.5 mL Opti-MEM 與4 μg DNA（分別為包裝質(zhì)粒SL3、SL4、SL5 以及目的基因質(zhì)粒），將質(zhì)粒加入Opti-MEM中，然后用槍頭吹打混勻；B 液為1.5 mL Opti-MEM 與40 μL Lipofectamine 2000，用槍頭吹打混勻，室溫靜置孵育5 min；將A 液加入B 液中，用槍頭吹打混勻，室溫靜置孵育20 min；將孵育后的轉(zhuǎn)染復(fù)合物緩慢逐滴加入培養(yǎng)細(xì)胞的100 mm培養(yǎng)皿中，水平輕微晃動(dòng)使其分布均勻，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染6 h 后更換培養(yǎng)基為含10% FBS的DMEM 培養(yǎng)基，繼續(xù)37 ℃，5%CO2培養(yǎng)；轉(zhuǎn)染48 h 后收集培養(yǎng)基上清存放于4 ℃，添加同體積新鮮的含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，過24 h 再收集1 次培養(yǎng)基上清；將兩次收集的培養(yǎng)基上清一起進(jìn)行濃縮，4 ℃，1 000×g 離心30 min，離心所得上清用0.45 μm 濾器過濾去除細(xì)胞碎片；將濾液加入離心管中，4 ℃50 000×g 離心2 h，棄上清，每管沉淀用200 μL HBSS 緩沖液重懸慢病毒顆粒，分裝后置于-80 ℃保存，得到的病毒可用于轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。

慢病毒純化：將200 μL 病毒濃縮液加入離心管中，上層加入1.5 mL 20%蔗糖溶液，平衡后4℃50 000×g 離心2 h；離心去上清，收集沉淀病毒顆粒，每管沉淀用200 μL HBSS 緩沖液重懸，分裝后凍存于-80 ℃，然后，采用ELISA 法測定慢病毒滴度。

1.3.1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo) 轉(zhuǎn)導(dǎo)前1 d，將一定數(shù)量的靶細(xì)胞接種至新的培養(yǎng)皿中（轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)靶細(xì)胞的融合度在30%～50%），置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～20 h；轉(zhuǎn)導(dǎo)當(dāng)天，在冰上溶解凍結(jié)的病毒液，溶解后輕柔吹打混合病毒顆粒，去適量病毒至培養(yǎng)基中，輕柔混勻，盡可能地減少培養(yǎng)基使用量（100 μL/cm2），將培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)；3～4 h 后取出培養(yǎng)基，換液，洗出含有病毒的培養(yǎng)基，加入新鮮的完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)；每24 h 換液1次，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達(dá)情況。

將表達(dá)熒光的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，藥篩之前進(jìn)行細(xì)胞致死試驗(yàn)。分別在24 孔板中加入終質(zhì)量濃度為0，1，2 μg/mL 和3 μg/mL 的嘌呤霉素，每組6個(gè)平行樣本，連續(xù)培養(yǎng)3～7 d，測試細(xì)胞致死狀態(tài)，制作致死曲線。選擇細(xì)胞致死時(shí)間4～5 d 的嘌呤霉素濃度，加入表達(dá)病毒載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中，連續(xù)培養(yǎng)4～5 d，直到培養(yǎng)過程中沒有死細(xì)胞產(chǎn)生為止，觀察載體表達(dá)情況。

1.3.1.5 細(xì)胞核型分析 在5 mL 培養(yǎng)液中加入50 μL 10 μg/mL 秋水仙素，抑制中期分裂的細(xì)胞，在37 ℃、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)3～4 h，直至細(xì)胞核中有圓形發(fā)亮的球形為止。將細(xì)胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到15 mL 離心管中，然后，用PBS（37 ℃溫?。┫礈炫囵B(yǎng)瓶中的貼壁細(xì)胞，洗滌2 次。加入0.25%胰酶+0.02%EDTA 消化，3 min 左右，加入細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，用彎頭吸管輕輕吹打細(xì)胞生長面，然后，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到上述15 mL 離心管中，1 000 r/min 離心10 min，棄上清液，留約0.5 mL。加入預(yù)熱（37 ℃）的0.075 mol/L KCl 溶液至5 mL，于37℃水浴低滲處理25 min；低滲結(jié)束后加入0.5 mL固定液（V甲醇∶V冰乙酸=3∶1，現(xiàn)用現(xiàn)配），混勻后，迅速離心（1 000 r/min，10 min），棄上清液，留少許液體。加入4 mL 固定液，室溫固定20 min，1 000 r/min 離心8 min，棄上清液，留少許液體，重復(fù)2次。將離心后的細(xì)胞懸浮開，以10～30 cm 高度滴到冰水（0～4 ℃）預(yù)冷、傾斜45°的載玻片上，并迅速將滴上的細(xì)胞吹開，在酒精燈上輕輕過2～3 遍，細(xì)胞面朝上，吸水紙吸去多余液體，室溫下晾干，約10～15 min；細(xì)胞面朝下，扣在染色玻璃板上，打入PBS（1 ∶10）稀釋的吉姆薩染色液，避免打入氣泡，染色15 min，蒸餾水沖洗，吸水紙吸去多余液體，10～15 min 后顯微鏡下觀察。

1.3.2 細(xì)胞端粒免疫熒光染色 PBST：含0.5%Triton X-100 的PBS 溶液。封閉液：含10%山羊血清的PBST 溶液。二抗稀釋液：稱取1 g 牛血清白蛋白（BSA），溶于100 mL PBS 中，即1% BSA 的PBS 溶液。取出備用細(xì)胞，棄培養(yǎng)基，PBS 洗2 次。加入4%固定液室溫固定15min。PBS 洗3 次，每次5 min。用PBST 溶液進(jìn)行透化，室溫10 min。PBS 洗1 次，5 min 加入封閉液，室溫封閉30～60 min。棄封閉液，加入一抗（1 ∶200）稀釋于封閉液中，37 ℃孵育2 h，1% BSA 的PBS 洗3 次，每次5 min 加入二抗（1∶400）稀釋于二抗稀釋液中，37 ℃避光放置1 h。PBS 洗3 次，每次5 min。加入終濃度的DAPI（1 ∶10 000）/Hoechst（1 ∶5 000），室溫放置5 min。PBS 洗3 次，每次5 min。加入500 μL PBS，在熒光顯微鏡下拍照或避光保存。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)鑒定陽性細(xì)胞 將單細(xì)胞懸液加入2 mL 圓底離心管中，離心，1 500 r/min，5 min，棄上清液。用1 mL 1×PBS 洗滌1 次，離心。4%PFA 1 mL，4 ℃固定30 min。用1×PBS 1 mL 洗滌1 次，離心。1% Triton-100 1 mL，室溫10 min。用1 mL 1×PBS 洗滌1 次，離心。加入用PBA稀釋的熒光素標(biāo)記的抗體200 μL，用移液器輕輕吹打混勻，置冰上孵育30～60 min。離心，棄上清液。加入1 mL 冷PBS，離心洗滌2 次，除去未結(jié)合的抗體成分。向細(xì)胞中加入500 μL 冷PBS，吹打混勻，置流式管中，4 ℃避光保存，上流式細(xì)胞儀。

1.3.4 RNA 提取及熒光定量PCR 用細(xì)胞刮刮取細(xì)胞，在4 ℃離心機(jī)中離心，棄上清，采用RNA提取試劑盒提取RNA，將RNA 洗脫后轉(zhuǎn)入-80 ℃保存，備用。以2 μg 體系逆轉(zhuǎn)錄RNA 為單鏈的cDNA。根據(jù)RNA 濃度，構(gòu)建反應(yīng)體系，即：RNA，2 μg；oligo DT，1 μL；dNTP，1 μL；總體系15 μL。65 ℃金屬浴加熱5 min，轉(zhuǎn)至冰上冷卻降溫。冷卻后加入以下反應(yīng)體系：M-MLV，0.5 μL；RRI，0.5 μL；5×Buffer，4 μL。37 ℃金屬浴50 min，70 ℃金屬浴10 min。置于-20 ℃保存，備用。通過NCBI Gene bank 查詢基因TERT（Gene ID：492280）、Hnrnpc（Gene ID：100626496）、β-actin（Gene ID：414396）序列信息。通過NCBI Primer-BLAST 在線設(shè)計(jì)引物，所設(shè)計(jì)引物信息如下：

表1 目的基因引物序列Table 1 Target gene primer sequence

以逆轉(zhuǎn)錄后得到的cDNA 為模板，稀釋10倍，以20 μL 體系進(jìn)行RT-PCR 試驗(yàn)。反應(yīng)體系：2 ×SYBR Green PCR Master Mix，10 μL；PCR Forward Prime，PCR Reverse Prime，各0.6 μL；cDNA，2 μL；DEPC 水，6.8 μL，總體積20 μL。每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)置3 個(gè)平行試驗(yàn)。冰上操作，依次加入18 μL MIX 溶液，2 μL cDNA。程序如下：第1 階段，95 ℃10 min；第2 階段，95 ℃15 s，60 ℃30 s；第3階段，95 ℃ 5 min；65 ℃ 5 min；95 ℃ 5 min。

采用2-ΔΔCt法處理、分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

式中，R——基因相對表達(dá)量；Ct0（GOT）——對照組基因的Ct；Ct0（ref gene）——對照組內(nèi)參基因的Ct；Ct（GOT）——樣品組基因的Ct；Ct0（ref gene）——樣品組內(nèi)參基因的Ct。

2 結(jié)果

2.1 端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶過表達(dá)載體構(gòu)建結(jié)果分析

為了探索細(xì)胞培育肉用細(xì)胞的永生化誘導(dǎo)，通過脫毒的慢病毒進(jìn)行過表達(dá)載體的構(gòu)建，將TERT 端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶CDs 序列進(jìn)行PCR 全長克隆。結(jié)果顯示（圖1）：TERT 序列CDs 區(qū)全長為4 801 bp，載體類型為哺乳動(dòng)物基因表達(dá)載體，啟動(dòng)子為CMV，ORG 開放閱讀框?yàn)楸狙芯磕康幕颉Ｍ瑫r(shí)設(shè)置EGFP 熒光表達(dá)載體和嘌呤霉素藥篩原件，載體抗性為氨芐。載體中設(shè)置酶切位點(diǎn)有HpaI、ApaLI、DraIII、ApaLI+XhoI、ApaLI+NdeI、ApaLI+HpaI、ApaLI+DraIII。構(gòu)建完成的載體通過多引物PCR 驗(yàn)證和測序驗(yàn)證，結(jié)果良好，序列無突變發(fā)生。

圖1 永生化誘導(dǎo)過表達(dá)載體圖譜及突變檢測Fig.1 Immortalization-induced overexpression vector map and mutation detection

2.2 體轉(zhuǎn)導(dǎo)最佳滴度及表達(dá)時(shí)序驗(yàn)證

為了測定細(xì)胞轉(zhuǎn)染最佳轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度，首先進(jìn)行空載體轉(zhuǎn)導(dǎo)試驗(yàn)。分別通過10，20，30 滴度對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，明確20 滴度的轉(zhuǎn)導(dǎo)優(yōu)勢后，通過15，20 和25 3 個(gè)滴度進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)驗(yàn)證，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度為25 時(shí)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞效率最高，進(jìn)而將病毒載體通過25 滴度的濃度轉(zhuǎn)導(dǎo)到豬成肌細(xì)胞中，在48 h 端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶載體開始表達(dá)，96 h 后表達(dá)量開始升高，轉(zhuǎn)導(dǎo)180 h 后，端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的載體表達(dá)達(dá)到最高值（圖2）。細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較高，可進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖2 細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)后載體表達(dá)時(shí)序分析Fig.2 Time series analysis of vector expression after cell transduction

2.3 嘌呤霉素篩選陽性細(xì)胞藥篩及細(xì)胞活力檢測

為了去除假陽性細(xì)胞，通過嘌呤霉素進(jìn)行陽性細(xì)胞的篩選。首先進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞貼壁24 h 時(shí)，以0，1，2 μg/mL 和3 μg/mL 的質(zhì)量濃度對普通細(xì)胞做致死試驗(yàn)，繪制致死曲線。結(jié)果表明（圖3a）：空白對照組中的細(xì)胞正常增殖，生長曲線呈現(xiàn)S 型，證實(shí)細(xì)胞的狀態(tài)和增殖能力處于正常水平。在添加1 μg/mL 嘌呤霉素的組別中，前3 d細(xì)胞致死趨勢較為平緩，從第3 天開始細(xì)胞致死速度加快，而相對2 μg/mL 和3 μg/mL 質(zhì)量濃度細(xì)胞致死效率仍較低，截止第6 天細(xì)胞仍未全部死亡，因此，該質(zhì)量濃度的藥篩試驗(yàn)較為漫長，不適合陽性細(xì)胞的篩選。在2 μg/mL 組別中，前5 d的細(xì)胞致死率趨于一致，到第6 天細(xì)胞完全致死，致死速度較為緩和；同時(shí)，在5～6 d 細(xì)胞全部死亡，符合本研究中細(xì)胞的藥篩試驗(yàn)。當(dāng)添加量為3 μg/mL 時(shí)，細(xì)胞第3 天就全部死亡，說明藥篩濃度過高，不利于陽性細(xì)胞的增殖。

陽性細(xì)胞篩選完成后進(jìn)行細(xì)胞連續(xù)傳代驗(yàn)證，結(jié)果顯示：誘導(dǎo)后的第1 代細(xì)胞（圖3b）的增殖能力顯著低于常規(guī)同代次的細(xì)胞（細(xì)胞為豬細(xì)胞傳代5 代，將凍存1 年的細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)處理），表明此時(shí)誘導(dǎo)的細(xì)胞尚未從細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中恢復(fù)過來，細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞活力相對較差。空白組細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)期時(shí)，誘導(dǎo)組的細(xì)胞尚處于潛伏期，對比空白組，誘導(dǎo)組的細(xì)胞沒有明確的潛伏期和指數(shù)期，同時(shí)指數(shù)期極不顯著，空白組的細(xì)胞在第5 天進(jìn)入平臺(tái)期后，誘導(dǎo)組的細(xì)胞尚未進(jìn)入指數(shù)期。當(dāng)傳代至20 代時(shí)（圖3c），誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖能力及活力已經(jīng)顯著恢復(fù)，細(xì)胞增殖曲線與空白組細(xì)胞沒有顯著差異。當(dāng)誘導(dǎo)組細(xì)胞傳代至180 代時(shí)（圖3d），細(xì)胞活力和增殖能力呈下降趨勢，差異不顯著，同傳代20 代的空白對照組細(xì)胞相比（常規(guī)細(xì)胞無法傳代至180 代，不能單一變量對比），細(xì)胞的增殖能力雖然比空白組差，但是差異不顯著。此時(shí)誘導(dǎo)組的細(xì)胞已經(jīng)突破生理極限，突破了“Hay flick”界限（細(xì)胞最大分裂次數(shù)）。由此證明本研究中的細(xì)胞永生化誘導(dǎo)取得初步成功。

圖3 細(xì)胞凋亡及增殖曲線Fig.3 Apoptosis and proliferation curves

2.4 流式細(xì)胞術(shù)純化陽性細(xì)胞及細(xì)胞陽性率鑒定

為了檢測陽性細(xì)胞的藥篩效率，分別在誘導(dǎo)細(xì)胞加入嘌呤霉素的第2，4，6 天時(shí)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)的細(xì)胞鑒定。由于有誘導(dǎo)陽性的細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白，因此通過PI 對所有細(xì)胞進(jìn)行染色，通過綠色熒光通道進(jìn)行細(xì)胞分群（圖4），結(jié)果顯示：第2 天時(shí)，細(xì)胞明顯產(chǎn)生分群效應(yīng)，直方圖峰值有兩個(gè)。同時(shí)對細(xì)胞進(jìn)行十字門分群，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，62.11%的細(xì)胞為表達(dá)綠色熒光蛋白的陽性細(xì)胞，36.23%的細(xì)胞為未被嘌呤霉素殺死的陰性細(xì)胞。當(dāng)藥篩進(jìn)行到第4 天，直方圖結(jié)果顯示第1 峰值顯著降低。對細(xì)胞進(jìn)行圈門，十字門分群后陽性細(xì)胞比例為78.92%，顯著高于第2 天的62.11%，同時(shí)陰性細(xì)胞的比例為21.08%，較第2 天顯著降低；第6 天時(shí)，細(xì)胞直方圖顯示為單峰，陽性細(xì)胞比例為100%（存在極少數(shù)的陰性細(xì)胞在圈門外，比例接近于0），陰性細(xì)胞已通過嘌呤霉素全部篩除。通過流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞藥篩效率，一方面可以精準(zhǔn)判斷陰性細(xì)胞的去除效率，減少后期陽性細(xì)胞增殖過程中的細(xì)胞混合污染問題，另一方面，在篩選過程中當(dāng)陰性細(xì)胞致死后及時(shí)更換培養(yǎng)基，避免藥篩試驗(yàn)對陽性細(xì)胞產(chǎn)生過多的干擾或不確定的影響。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)鑒定陽性細(xì)胞純化程度Fig.4 Purification degree of positive cells identified by flow cytometry

2.5 永生化誘導(dǎo)細(xì)胞株遺傳穩(wěn)定性鑒定

為了驗(yàn)證成肌細(xì)胞永生化誘導(dǎo)后是否產(chǎn)生染色體異變情況，對誘導(dǎo)后傳代50 代的細(xì)胞進(jìn)行染色體核型分析（圖5）。參照國際家養(yǎng)動(dòng)物分帶核型標(biāo)準(zhǔn)化會(huì)議提出的家豬染色體核型分類標(biāo)準(zhǔn)，將豬染色體分為A、B、C、D 組。按照組內(nèi)染色體相對長度排列，分別標(biāo)記以1～18 的標(biāo)號(hào)。A 組為第1～5號(hào)染色體，亞中著絲粒染色體（sm），其中1 號(hào)染色體最長；B 組為6，7 號(hào)染色體，亞端著絲粒染色體（st）；C 組為第8～12 對染色體，中著絲粒染色體（M），X 染色體為中著絲粒染色體，屬于C 組；Y 染色體為所有染色體中最小的，同樣是中作私立染色體；D 組為第13～18 號(hào)染色體，端著絲粒染色體（T），其中13 號(hào)染色體相對長度僅次于1 號(hào)染色體。結(jié)果顯示：1 號(hào)染色體中央著絲粒和次縊痕染色深，2 號(hào)染色體短臂有4 條深帶，長臂有6～7 條深帶，分3 個(gè)區(qū)；3 號(hào)染色體著絲粒染色濃，在短臂和長臂的中端各有1 條明顯寬闊的淺帶；其它染色體從形態(tài)、長度和臂比上看均為產(chǎn)生顯著的異變，揭示了本研究中永生化誘導(dǎo)未對染色體產(chǎn)生不可預(yù)測的異變。

圖5 細(xì)胞核型分析Fig.5 Karyotype analysis

2.6 端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶及端粒四聚體表達(dá)鑒定

在染色體復(fù)制過程中，細(xì)胞每進(jìn)行一次染色體復(fù)制，末端DNA 都會(huì)發(fā)生丟失。端粒是短的多重復(fù)的非轉(zhuǎn)錄序列（TTAGGG）及一些結(jié)合蛋白組成特殊結(jié)構(gòu)，除了提供非轉(zhuǎn)錄DNA 的緩沖物外，它還能保護(hù)染色體末端免于融合和退化，在染色體定位、復(fù)制、保護(hù)和控制細(xì)胞生長及壽命方面具有重要作用，并與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞轉(zhuǎn)化和永生化密切相關(guān)。當(dāng)細(xì)胞分裂1 次，每條染色體的端粒就會(huì)逐次變短一些。構(gòu)成端粒的一部分基因約50～200個(gè)核苷酸，會(huì)因多次細(xì)胞分裂而不能達(dá)到完全復(fù)制（丟失），以至細(xì)胞終止其功能，不再分裂。嚴(yán)重縮短的端粒是細(xì)胞老化的信號(hào)。在某些需要無限復(fù)制循環(huán)的細(xì)胞中，端粒的長度在每次細(xì)胞分裂后，被能合成端粒的特殊性DNA 聚合酶-端粒酶所保留。

hnRNPA2 蛋白可與端粒DNA 和端粒酶發(fā)生作用，主動(dòng)打開端粒G-四鏈體接頭，將端粒3` 短的5 個(gè)堿基暴露出來，促進(jìn)其和端粒酶的RNA 模板配對，從而增強(qiáng)端粒酶的催化活性和進(jìn)行性，可以調(diào)控端粒長度平衡，維持細(xì)胞分裂和增殖能力。本研究中細(xì)胞的永生化誘導(dǎo)方案即通過端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶過表達(dá)實(shí)現(xiàn)。為進(jìn)一步驗(yàn)證細(xì)胞誘導(dǎo)效果，對端粒酶和A2 蛋白進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記，結(jié)果顯示（圖6）：在永生化誘導(dǎo)的細(xì)胞中hnRNP A2 蛋白的表達(dá)與端粒酶活性呈正相關(guān)，兩個(gè)蛋白共定位于卡佳爾體和端粒，hnRAP A2 的表達(dá)促進(jìn)了端粒的延長。此外，在成體細(xì)胞中，端粒酶是無法被檢測到的，而在本誘導(dǎo)細(xì)胞株中，可以檢測到端粒酶的表達(dá)，證明細(xì)胞的誘導(dǎo)成效顯著。另外，hn-RNP A2 蛋白的表達(dá)促進(jìn)端粒DNA 的延長，進(jìn)一步說明細(xì)胞端粒長度縮短機(jī)制被打破，端粒開始延長或者延緩縮短，獲得細(xì)胞永生化誘導(dǎo)細(xì)胞株。

圖6 hnRNPa2 及TERF2 免疫熒光染色Fig.6 hnRNPa2 and TERF2 immunofluorescence staining

2.7 端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶及hnRAP 蛋白表達(dá)活性鑒定

端粒作為短的多重復(fù)非轉(zhuǎn)錄序列，與細(xì)胞老化和機(jī)體衰老存在最直接的關(guān)系，相較于端粒的長短，端粒變短的速度具有更重要的意義。本研究中通過定量PCR 對永生化誘導(dǎo)細(xì)胞株（傳代180代）和常規(guī)細(xì)胞株（傳代30 代）對比，檢測端粒長度和變短的速率，以期驗(yàn)證永生化細(xì)胞誘導(dǎo)效率。結(jié)果表明：在正常培養(yǎng)狀態(tài)下，細(xì)胞無法傳代至180 代，而對照組中的細(xì)胞為30 代細(xì)胞，對比結(jié)果顯示：永生化誘導(dǎo)的細(xì)胞相對端粒酶長度顯著高于對照組（圖7a），從側(cè)面揭示細(xì)胞永生化誘導(dǎo)的效率高，細(xì)胞傳代能力和細(xì)胞活力顯著高于對照組。此外，hnRAPC 蛋白活化對端粒酶活性具有激活作用。本研究中對hnRAPC 基因表達(dá)量進(jìn)行定量PCR（圖7b），結(jié)果顯示永生化誘導(dǎo)組的表達(dá)量顯著高于對照組，揭示該蛋白在端粒中的活化功能，以及誘導(dǎo)組細(xì)胞蛋白活性顯著高于對照組，表明永生化細(xì)胞誘導(dǎo)獲得成功，細(xì)胞傳代能力得到顯著提升。

圖7 端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶及四聚體表達(dá)量分析Fig.7 Analysis of expression of telomerase reverse transcriptase and tetramer

3 討論

細(xì)胞培育肉作為一門新興科學(xué)技術(shù)，雖然研究時(shí)間相對較短，但是其作為細(xì)胞生物學(xué)、組織工程學(xué)及食品科學(xué)等多學(xué)科交叉融合的技術(shù)已經(jīng)具備深厚的研究基礎(chǔ)[23]，尤其是細(xì)胞培育肉種子細(xì)胞的使用方面，可供細(xì)胞培育肉種子細(xì)胞使用的細(xì)胞類型主要有胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞等多能干細(xì)胞以及包括肌衛(wèi)星干細(xì)胞、脂肪前體細(xì)胞等單能干細(xì)胞[24-26]。值得注意的是多能干細(xì)胞的優(yōu)勢在于其具有干細(xì)胞特性，可以無限增殖和定向分化，而多能干細(xì)胞在增殖過程中的干性維持尚未完全闡明，在細(xì)胞定向分化過程中，存在批量性和統(tǒng)一性的問題，容易產(chǎn)生不定向分化，同時(shí)其培養(yǎng)成本相對較高，不適合于細(xì)胞培育肉的規(guī)?；圃靃27]；而單能干細(xì)胞在使用過程中，一旦活化，細(xì)胞便發(fā)生不可逆的分化過程，并且隨著干性的消失，細(xì)胞傳代次數(shù)受到限制，制約著細(xì)胞的規(guī)?；鲋砙28]。因此，在細(xì)胞培育肉研發(fā)過程中，獲得相應(yīng)的可以無限增殖的成體細(xì)胞，是解決其工業(yè)化過程中細(xì)胞來源的重要保障。

在基因水平層面，細(xì)胞永生化的方法目前主要有SV40 大T 抗原法[29]、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶法[30]、HPV16 E6 法[31]、原癌基因以及抑癌基因[32]等方法。SV40 主要通過SV40 抗原片段整合到靶細(xì)胞的細(xì)胞核中并表達(dá)，從而構(gòu)建永生化細(xì)胞系。端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶法則是基于端粒酶蛋白部分的催化亞基編碼基因調(diào)控端粒酶的活性，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞永生化。HPV16 E6 是通過病毒編碼蛋白與宿主細(xì)胞的調(diào)節(jié)蛋白形成復(fù)合物，破壞細(xì)胞有絲分裂和DNA 修復(fù)過程，進(jìn)而激活端粒酶而實(shí)現(xiàn)正常細(xì)胞的永生化。諸如c-Myc、RAS、c-fos、Bmi1 及CDK4等原癌基因可以激活端粒酶的活性，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞向永生化過渡；相反的，p53、p21、pRb 等抑癌基因則是通過基因的干擾或者敲除，從而抑制細(xì)胞老化，反向協(xié)同端粒酶的激活，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的永生化。這些細(xì)胞永生化的方法各有利弊，作為食品科學(xué)研究，細(xì)胞培育肉使用的種子細(xì)胞首先需要排除人源因素，同時(shí)保證細(xì)胞的活性及各項(xiàng)功能，更重要的是細(xì)胞永生化的誘導(dǎo)不能干擾各類種子細(xì)胞的正常使用，即不能引入不確定因素。

本研究通過端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶載體法誘導(dǎo)細(xì)胞永生化，端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶導(dǎo)入細(xì)胞后隨著細(xì)胞分裂過程，同步表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄酶的催化亞基，調(diào)節(jié)端粒酶的活性[33]。同時(shí)與hnRNPA2 蛋白發(fā)生作用，打開端粒G-四鏈體結(jié)構(gòu)，暴露端粒3` 端堿基，促進(jìn)其與端粒酶RNA 模板配對，從而增強(qiáng)端粒酶的催化活性及進(jìn)行性，有效維持端粒酶的長度，其意義在于減低（負(fù)調(diào)控）端?？s短的速度，使端粒維持一定的長度，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的永生化[34]。本研究中永生化細(xì)胞的特點(diǎn)是：除了端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶，不再引入新的影響基因，以保證細(xì)胞的正常表達(dá)水平和功能。細(xì)胞在傳代180 代后仍具有較高的增殖和分化效率。通過定量PCR、免疫熒光標(biāo)記等手段驗(yàn)證誘導(dǎo)細(xì)胞株結(jié)果，可以推測細(xì)胞穩(wěn)定性較高，沒有發(fā)生不可預(yù)測的突變現(xiàn)象。綜上所述，建立了一株可以穩(wěn)定表達(dá)、高效傳代的豬成肌細(xì)胞永生化細(xì)胞系。

4 結(jié)論

本研究構(gòu)建豬成肌細(xì)胞永生化誘導(dǎo)載體，探索細(xì)胞永生化誘導(dǎo)方案和研究材料；通過細(xì)胞核轉(zhuǎn)染、陽性細(xì)胞流式細(xì)胞儀篩選獲取陽性細(xì)胞株；通過定量PCR、免疫熒光標(biāo)記、核型分析等驗(yàn)證細(xì)胞的穩(wěn)定性；對陽性細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)，驗(yàn)證細(xì)胞可傳代超過200 代。本研究的實(shí)施為細(xì)胞培育肉種子細(xì)胞的開發(fā)探索了理論基礎(chǔ)，提供了工業(yè)化生產(chǎn)的細(xì)胞材料，為培育肉工業(yè)化生產(chǎn)提供先導(dǎo)條件。