展巧稚， 閻文軍

作者單位：750004 銀川，寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院(展巧稚)；730000 蘭州，甘肅省人民醫(yī)院麻醉科(閻文軍)

目前，隨著人口老齡化的進展，接受麻醉和手術(shù)的老年人數(shù)大幅增加。圍手術(shù)期神經(jīng)認(rèn)知障礙(perioperative neurocognitive disorder，PND)是手術(shù)和麻醉過程中常發(fā)生的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，包括術(shù)前已經(jīng)存在的認(rèn)知功能障礙、術(shù)后1周內(nèi)出現(xiàn)的術(shù)后譫妄以及術(shù)后30 d內(nèi)存在的認(rèn)知功能減退[1]，可表現(xiàn)為認(rèn)知能力、記憶力、語言及社交能力的損傷。PND的發(fā)生率隨著年齡的增長而顯著增加，尤其是在>65歲的患者中，非心臟手術(shù)后3個月的PND發(fā)生率達(dá)12%～21%，是年輕患者的2～10倍[2]。而>75歲患者的PND發(fā)病率更是65～75歲患者的3倍[3]。PND可導(dǎo)致患者生活質(zhì)量下降，并會造成其他生理和心理疾病，給社會和家庭帶來負(fù)擔(dān)。Ghrelin是由28個氨基酸組成的多肽，主要由胃黏膜分泌，是調(diào)節(jié)垂體生長激素分泌的內(nèi)源性激素，具有增進食欲和促進胃酸分泌、胃蠕動等功能。Ghrelin廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，與海馬空間學(xué)習(xí)記憶能力密切相關(guān)[4]。有研究顯示，Ghrelin可以抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)，減少氧化應(yīng)激的損害，從而發(fā)揮器官保護作用[4-5]。但Ghrelin對手術(shù)造成的學(xué)習(xí)記憶障礙是否有保護作用尚鮮見相關(guān)研究報道。鑒此，本研究通過觀察Ghrelin預(yù)處理對PND的保護作用，探討其對PND老齡小鼠氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥反應(yīng)的影響，為PND發(fā)病機制的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級健康雄性C57BL/6J小鼠，購自斯貝福北京生物技術(shù)有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(京)2019-0010。體質(zhì)量35～45 g，14月齡，分籠飼養(yǎng)，每籠4只。在甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心飼養(yǎng)至16月齡后開始進行實驗。飼養(yǎng)環(huán)境：濕度40%～60%，恒溫20 ℃。

1.2實驗試劑 Ghrelin購自美國Sigma公司；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、總超氧化物氣化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)檢測試劑盒購自南京建成公司；環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)、高遷移族率蛋白B1(high-mobility group box-1，HMGB1)檢測試劑盒購自武漢云克隆公司。

1.3實驗方法 實驗前連續(xù)5 d對小鼠進行水迷宮定位航行訓(xùn)練，檢測小鼠學(xué)習(xí)能力。這一方面可以訓(xùn)練小鼠對隱藏在水下平臺的位置形成記憶，另一方面可據(jù)此剔除在規(guī)定時間內(nèi)找不到隱藏在水下平臺的小鼠。Ghrelin溶于雙蒸水(1 mg/ml)，使用之前用0.9%生理鹽水再次稀釋至0.05 mg/ml。將經(jīng)挑選合格的小鼠隨機分為Sham組、PND組、PND+Vehicle組和PND+Ghrelin組，每組12只。干預(yù)方法：(1)Sham組小鼠予腹腔注射5%水合氯醛麻醉，充分消毒，切開小腿脛骨側(cè)皮膚后縫合，不做任何手術(shù)和治療措施，術(shù)畢，創(chuàng)面應(yīng)用利多卡因膠漿鎮(zhèn)痛。(2)PND組小鼠予腹腔注射5%水合氯醛麻醉，充分消毒，行脛骨骨折髓內(nèi)固定術(shù)，術(shù)畢予利多卡因膠漿進行術(shù)后鎮(zhèn)痛，不行任何治療。(3)PND+Ghrelin組小鼠行脛骨骨折髓內(nèi)固定術(shù)，操作方式同PND組。麻醉前2 h和蘇醒后予腹腔注射Ghrelin 80 μg/kg，1次/d，連續(xù)7 d。(4)PND+Vehicle組小鼠在麻醉前2 h和蘇醒后予腹腔注射0.9%生理鹽水(1.6 ml/kg)作為安慰劑進行對照，1次/d，連續(xù)7 d，其余干預(yù)措施同PND+Ghrelin組。若實驗過程中有動物死亡，隨即增補相應(yīng)的只數(shù)到各組，直至滿足各組小鼠數(shù)達(dá)12只。

1.4PND模型制備 參照相關(guān)文獻[6]對小鼠進行脛骨骨折髓內(nèi)固定術(shù)。具體操作為：小鼠術(shù)前8 h禁食禁水，予5%水合氯醛(0.5 ml/100 g)進行麻醉，待小鼠翻正反射消失后進行手術(shù)。小鼠取仰臥位，備皮，使用碘伏棉簽對手術(shù)部位以及周圍1 cm處的皮膚進行消毒。于右側(cè)后肢膝下脛骨側(cè)切開皮膚約0.5 cm，逐層分離皮下組織暴露脛骨，取0.3 mm的鋼針插入脛骨髓腔中，待充分固定后用眼科剪于脛骨中下1/3處橫形部分?jǐn)嗔?不完全骨折)，清創(chuàng)后縫合傷口，手術(shù)切口周圍予0.2%利多卡因膠漿局部浸潤鎮(zhèn)痛。術(shù)中室溫維持在24～26 ℃，維持直腸溫度36.5～37.5 ℃。待小鼠蘇醒后繼續(xù)放回籠內(nèi)飼養(yǎng)。

1.5水迷宮實驗 水迷宮是測試依賴于海馬的空間學(xué)習(xí)和記憶能力的常用方法，主要由定位航行實驗和空間探索實驗兩部分組成。定位航行實驗需連續(xù)訓(xùn)練5 d，小鼠在第1次游泳時，因沒有探索的記憶，一般不會找到水下隱藏的平臺，但隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加會形成固定的記憶，小鼠可在很短的時間內(nèi)到達(dá)平臺的位置。開始實驗時，事先將小鼠放置在平臺上停留30 s，讓其熟悉周圍環(huán)境后，將小鼠頭朝池壁放入水中，記錄小鼠找到水下隱藏平臺的時間，如果超過60 s，則引導(dǎo)動物至平臺并停留30 s，四個象限依次重復(fù)，每天訓(xùn)練4次，連續(xù)訓(xùn)練6 d，剔除在規(guī)定時間內(nèi)找不到水下隱藏平臺的小鼠。在行脛骨骨折髓內(nèi)固定術(shù)后第7天進行空間探索實驗，撤除水下的平臺，在經(jīng)過連續(xù)5 d的訓(xùn)練后，小鼠已形成固定的記憶，當(dāng)撤除水下隱藏的平臺，小鼠會憑已經(jīng)形成的記憶探索原來的平臺，在平臺所在位置的停留時間會比其他任何位置久。將小鼠由原始平臺所在位置的對側(cè)象限頭朝下放入水中，開始實驗，記錄、分析小鼠逃避潛伏期(入水后第1次成功找到平臺所需要的時間)、逃逸平臺進入次數(shù)、目標(biāo)象限停留時間百分比，作為空間記憶的檢測指標(biāo)。

1.6氧化應(yīng)激及炎癥指標(biāo)檢測方法 術(shù)后第7天空間探索實驗結(jié)束，采用5%水合氯醛麻醉小鼠，經(jīng)心臟采血后翻正小鼠立即斷頭取腦，在冰上迅速分離左右兩側(cè)海馬組織，分別置于兩個2 ml凍存管中，-80 ℃保存。一側(cè)海馬組織用于COX-2、HMGB1蛋白檢測，另一側(cè)用于MDA、SOD蛋白檢測。將經(jīng)心臟采得血液置于1.5 ml離心管中，靜置后離心(3 000 r/min，10 min)，留取上清液，-80 ℃保存，用于COX-2、HMGB1的檢測。

1.6.1 血清COX-2、HMGB1水平檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測血清中COX-2、HMGB1濃度，具體步驟方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。

1.6.2 海馬組織中MDA、T-SOD、COX-2、HMGB1水平檢測 從-80 ℃冰箱中取所需的海馬組織，按質(zhì)量體積比1∶10加入預(yù)冷的裂解液，通過勻漿器充分研磨海馬組織，離心后提取上清液，采用BCA法檢測蛋白濃度。通過ELISA檢測海馬組織中MDA、T-SOD表達(dá)水平。通過Western blot實驗檢測海馬組織中COX-2、HMGB1的表達(dá)水平。加入相應(yīng)體積的蛋白上樣緩沖液，100 ℃水浴5 min。通過凝膠電泳后采用濕轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)膜，以5%脫脂奶粉封閉處理2 h，4 ℃條件下予一抗[anti-HMGB1(1∶4 000)、anti-COX-2(1∶2 000)、anti-GAPDH(1∶4 000)]孵育過夜。次日，將膜置于TBST液中清洗3次，8 min/次，以辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶2 000)在室溫下孵育1 h，TBST液清洗3次，8 min/次，超敏ECL化學(xué)發(fā)光液(BeyoECL Plus)顯影；采用Bio Rad化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀(C500 Western blot，美國Azure)進行掃描，應(yīng)用Image J軟件對蛋白條帶進行定量分析。

2 結(jié)果

2.1四組小鼠空間探索實驗結(jié)果比較 與Sham組比較，PND組、PND+Vehicle組和PND+Ghrelin組的逃避潛伏期更長，60 s內(nèi)逃逸平臺進入次數(shù)、目標(biāo)象限停留時間占比降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與PND組比較，PND+Ghrelin組的逃避潛伏期顯著縮短，60 s內(nèi)逃逸平臺進入次數(shù)、目標(biāo)象限停留時間占比升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 四組小鼠空間探索實驗結(jié)果比較

2.2四組小鼠血清COX-2和HMGB1水平比較 與Sham組比較，PND組、PND+Vehicle組、PND+Ghrelin組血清COX-2、HMGB1水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與PND組相比，PND+Ghrelin組血清COX-2、HMGB1水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 四組小鼠血清COX-2、HMGB1水平比較

2.3四組小鼠海馬組織的MDA、T-SOD水平比較 與Sham組比較，PND組、PND+Vehicle組、PND+Ghrelin組海馬組織的MDA水平升高、T-SOD水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與PND組比較，PND+Ghrelin組海馬組織的MDA水平降低、T-SOD水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 四組小鼠海馬組織的MDA、T-SOD水平比較

2.4四組小鼠海馬組織的HMGB1、COX-2表達(dá)水平比較 與Sham組比較，PND組、PND+Vehicle組、PND+Ghrelin組海馬組織的HMGB1、COX-2表達(dá)水平均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與PND組比較，PND+Ghrelin組海馬組織的HMGB1、COX-2表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1～2。

?Western blot實驗結(jié)果圖；?四組海馬組織HMGB1相對表達(dá)量柱形圖，與Sham組比較，*P<0.05；與PND組比較，#P<0.05圖1 四組小鼠海馬組織HMGB1表達(dá)水平比較圖

?Western blot實驗結(jié)果圖；?四組海馬組織COX-2相對表達(dá)量柱形圖，與Sham組比較，*P<0.05；與PND組比較，#P<0.05圖2 四組小鼠海馬組織COX-2表達(dá)水平比較圖

3 討論

3.1本研究探討了Ghrelin在改善手術(shù)麻醉引起的老齡小鼠認(rèn)知功能障礙、海馬組織氧化應(yīng)激反應(yīng)以及中樞系統(tǒng)神經(jīng)炎癥和全身外周炎癥反應(yīng)中的神經(jīng)保護作用和潛在機制，通過水迷宮行為學(xué)實驗來檢測老齡小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力。結(jié)果表明，PND組老齡小鼠逃避潛伏期顯著延長，目標(biāo)象限停留時間占比、逃逸平臺進入次數(shù)顯著減少，說明脛骨骨折髓內(nèi)固定術(shù)可誘導(dǎo)PND。本課題組的前期研究也證實了脛骨骨折髓內(nèi)固定術(shù)模型能穩(wěn)定誘導(dǎo)PND發(fā)生[7]。與PND組相比，PND+Ghrelin組老齡小鼠逃避潛伏期顯著縮短，目標(biāo)象限停留時間占比、逃逸平臺進入次數(shù)顯著升高，說明給予Ghrelin處理可使PND老齡小鼠學(xué)習(xí)記憶能力得到改善。

3.2為進一步分析Ghrelin保護PND老齡小鼠學(xué)習(xí)、記憶的可能機制，本課題組分析了Ghrelin處理對海馬組織的影響。有研究表明，手術(shù)及其愈合過程中機體會發(fā)生氧化應(yīng)激[8]，氧自由基通過對細(xì)胞中脂質(zhì)的過度氧化引起細(xì)胞內(nèi)酶活性改變、蛋白質(zhì)變性、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、功能破壞等，最終導(dǎo)致細(xì)胞變性或壞死，這是神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的主要發(fā)病機制[9]。本實驗中，PND組小鼠術(shù)后海馬組織的MDA水平升高，T-SOD水平降低，而經(jīng)Ghrelin處理后，小鼠海馬組織的MDA和T-SOD的水平變化得到恢復(fù)和改善，提示Ghrelin處理可抑制PND老齡小鼠術(shù)后海馬組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

3.3目前的研究認(rèn)為，手術(shù)應(yīng)激導(dǎo)致的高濃度炎癥因子可能會干擾海馬的正常功能，導(dǎo)致海馬神經(jīng)元的神經(jīng)毒性，最終受損的海馬神經(jīng)元導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙[10]。HMGB1是一種核蛋白，在穩(wěn)定核小體結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄方面起著重要的作用。當(dāng)機體遭受創(chuàng)傷時HMGB1賴氨酸殘基乙?；淖儯瑩p傷或壞死的細(xì)胞釋放大量乙?；疕MGB1到細(xì)胞外，能夠通過活化和轉(zhuǎn)運骨髓來源的巨噬細(xì)胞，與細(xì)胞表面晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor of advanced glycation end products，RAGE)高親和力結(jié)合，介導(dǎo)外周和中樞的炎癥反應(yīng)[11]。細(xì)胞外HMGB1被認(rèn)為是手術(shù)應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵炎癥介質(zhì)[12]，炎癥因子可以破壞血腦屏障的完整性，通過調(diào)節(jié)趨化因子單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)在海馬體中的表達(dá)，使骨髓產(chǎn)生的單核細(xì)胞轉(zhuǎn)移到海馬體中，發(fā)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)，破壞神經(jīng)元，最終導(dǎo)致腦損傷并出現(xiàn)認(rèn)知障礙[13-14]。

3.4環(huán)氧合酶包含三個亞型，即COX-1、COX-2和COX-3。在正常生理條件下，COX-2很少在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)。然而，外部刺激可誘導(dǎo)海馬組織中COX-2表達(dá)上調(diào)。有研究顯示，COX-2過表達(dá)發(fā)生在與中樞炎癥反應(yīng)相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病中[15-16]。在哺乳動物腦組織中，COX-2主要分布在海馬神經(jīng)元中，參與基本的腦功能，包括神經(jīng)遞質(zhì)釋放，以及學(xué)習(xí)和記憶能力調(diào)節(jié)。COX-2是炎癥相關(guān)疾病的重要調(diào)節(jié)因子之一，在創(chuàng)傷后觸發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)[17-19]。因此，HMGB1、COX-2是常見的促炎因子，在PND的發(fā)病中起著重要作用。本研究結(jié)果顯示，PND組小鼠海馬和血清中COX-2和HMGB1的表達(dá)升高，而Ghrelin處理可下調(diào)PND小鼠海馬組織和外周血清中COX-2和HMGB1的蛋白表達(dá)，提示Ghrelin可通過調(diào)節(jié)炎癥因子COX-2和HMGB1的表達(dá)從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

綜上所述，Ghrelin可以改善脛骨骨折手術(shù)引起的PND小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，其作用可能與Ghrelin抑制中樞神經(jīng)炎癥、氧化產(chǎn)物過度生成有關(guān)。本研究結(jié)果提示Ghrelin可能會成為治療PND老齡小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的一種有效藥物，但結(jié)論仍需進一步驗證。