沈嘉悅， 唐小其， 周濤聲， 潘登華(綜述)， 李 富(審校)

乳腺癌是嚴(yán)重?fù)p害我國(guó)女性健康的惡性腫瘤[1]。如何在超早期診斷乳腺癌、動(dòng)態(tài)評(píng)估乳腺癌治療療效及精準(zhǔn)監(jiān)測(cè)乳腺癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是臨床實(shí)踐中的難點(diǎn)及熱點(diǎn)。目前乳腺癌診療依賴宏觀的臨床資料，包括影像學(xué)檢查、活檢病理結(jié)果等，難以超早期評(píng)估和診斷病變。傳統(tǒng)的組織活檢方法受限于腫瘤的大小、取材部位的定位等條件。對(duì)于微小的腫瘤病灶發(fā)現(xiàn)不及時(shí)，導(dǎo)致病情延誤甚至腫瘤轉(zhuǎn)移，而侵入式的取材方式也給患者帶來一定的風(fēng)險(xiǎn)(如出血和感染等)。液體活檢作為一種新興的腫瘤檢測(cè)方法，主要通過無創(chuàng)或微創(chuàng)的方式對(duì)患者的血液、尿液、唾液等體液取樣，檢測(cè)所取體液中的腫瘤生物標(biāo)志物，如循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells,CTCs)、循環(huán)腫瘤基因(circulating tumor DNA,ctDNA)、微小RNA(microRNA,miRNA)等來獲得關(guān)于腫瘤的相關(guān)信息，用于腫瘤的超早期診斷及個(gè)體化治療方案的制定、療效的評(píng)估及隨訪。相較于傳統(tǒng)的組織活檢，液體活檢具有采樣風(fēng)險(xiǎn)小、限制少、準(zhǔn)確性高、方便連續(xù)采樣、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。在乳腺癌的診療中，主要通過檢測(cè)患者血液樣本中的CTCs、ctDNA等來實(shí)現(xiàn)對(duì)乳腺癌的精準(zhǔn)診療[2]。

1 CTCs

1.1CTCs的定義 CTCs是指在腫瘤的形成和發(fā)展過程中，從實(shí)體腫瘤病變脫落并進(jìn)入外周血循環(huán)的各類腫瘤細(xì)胞的統(tǒng)稱[3]。CTCs一般由腫瘤的原發(fā)灶或者轉(zhuǎn)移灶脫落，通過血管或淋巴管轉(zhuǎn)移至外周血循環(huán)。它是一類具有完整生物活性的腫瘤細(xì)胞，包含了患者腫瘤的DNA、蛋白質(zhì)組等信息，除了作為腫瘤標(biāo)志物幫助診療外，還可以進(jìn)行體外培養(yǎng)用于藥物敏感度研究。CTCs存在于腫瘤發(fā)展的各個(gè)階段，但由于從腫瘤脫落的細(xì)胞在進(jìn)入到外周血過程中，容易受到機(jī)械因素、免疫系統(tǒng)和藥物的影響而被損傷破壞，導(dǎo)致其進(jìn)入到外周血的數(shù)量極少，且大小、形態(tài)不一，難以被檢測(cè)和計(jì)數(shù)。CTCs的這一特性使其作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)乳腺癌進(jìn)行診斷和預(yù)后評(píng)估時(shí)，需要利用多種技術(shù)對(duì)其進(jìn)行富集和檢測(cè)[4-5]。

1.2CTCs的檢測(cè)方式與技術(shù) 目前用于富集和檢測(cè)CTCs的新技術(shù)是基于CTCs的一種或多種特征，將其與周圍的正常血細(xì)胞區(qū)分開，例如生物學(xué)特征(表面蛋白表達(dá)、突變的存在、特定基因的表達(dá)、生存力)或物理特性(大小、密度、酸堿度、電荷和可變形性)。目前常用的富集方法包括基于形態(tài)學(xué)的富集法及免疫磁珠法，前者價(jià)格低廉但缺乏特異性，免疫磁珠法又包括陽(yáng)性富集法和陰性富集法[6]。由美國(guó)強(qiáng)生公司開發(fā)的CTC檢測(cè)系統(tǒng)Cell Search主要利用腫瘤細(xì)胞表達(dá)上皮細(xì)胞黏附因子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)在上皮起源細(xì)胞表面表達(dá)的一種蛋白質(zhì)標(biāo)記，通過使用EpCAM抗體包被的磁珠對(duì)CTCs進(jìn)行富集[7]。同時(shí)美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局正在對(duì)新型液體活檢技術(shù)Parsortix用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的申請(qǐng)進(jìn)行審查。與Cell Search不同的是，Parsortix利用細(xì)胞分離技術(shù)，盡可能地捕獲所有類型的CTCs以及CTC簇。此外較為常見的還有CTC-iChip的負(fù)濃縮技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)首先使用覆蓋表面蛋白(CD45和CD15)的磁性珠子來識(shí)別免疫細(xì)胞，以標(biāo)記白細(xì)胞，以便當(dāng)CTCs通過微流控芯片時(shí)洗掉紅細(xì)胞、血小板、血漿蛋白和剩余的蛋白[8]。

1.3CTC簇 有學(xué)者發(fā)現(xiàn)外周血中以細(xì)胞簇狀態(tài)聚集存在的CTCs可避免“失巢凋亡”，并且對(duì)細(xì)胞毒性藥物具有更高的耐受性[9]。與孤立的CTCs相比，CTC簇在血液中更為罕見，但它們預(yù)測(cè)的腫瘤轉(zhuǎn)移準(zhǔn)確度是單個(gè)CTC的23～50倍。Wang等[10]對(duì)縱向收集的CTCs和CTC簇進(jìn)行了時(shí)間依賴性分析，CTC簇比單個(gè)CTC增加了額外的預(yù)后價(jià)值，乳腺癌合并癥患者的血液樣本中如果發(fā)現(xiàn)較大的CTC簇則預(yù)示著更高的病死率。有研究通過尿激酶型纖溶酶原激活劑阻止了CTC簇的組裝，成功地提高了乳腺癌小鼠模型的總體存活率，這是CTC簇用于相關(guān)治療的首創(chuàng)[11]。也有研究表明，CTC簇在腫瘤的轉(zhuǎn)移中起到關(guān)鍵的作用，轉(zhuǎn)移的發(fā)展在一定程度上取決于CTC簇的大小和數(shù)量[12]。然而，目前只有少數(shù)設(shè)備能檢測(cè)CTC簇[13-14]。近年來，檢測(cè)CTCs的技術(shù)快速發(fā)展，隨著技術(shù)的進(jìn)步，CTCs的作用機(jī)制將進(jìn)一步闡明。CTCs有望作為評(píng)估轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，對(duì)超早期乳腺癌的診斷及微小病灶的發(fā)現(xiàn)同樣具有重大意義[15-17]。

2 ctDNA

2.1ctDNA的定義 在細(xì)胞的凋亡和壞死過程中，釋放到血液中游離的DNA片段稱為循環(huán)基因(circulating free DNA，cfDNA)[18]。癌癥患者血液中部分cfDNA與腫瘤來源的DNA一致，具有與腫瘤相同的基因和表觀遺傳學(xué)改變[19]，稱之為ctDNA，其主要來自腫瘤壞死。除此之外，腫瘤細(xì)胞凋亡、腫瘤細(xì)胞直接分泌，以及已經(jīng)被巨噬細(xì)胞包裹的壞死性惡性腫瘤細(xì)胞也可以釋放ctDNA。相較于CTCs分析培養(yǎng)可以完整地顯示出具有RNA和DNA大分子及蛋白質(zhì)的整個(gè)癌細(xì)胞，ctDNA包含的信息僅限于基因及其變化，包括基因突變[20]。在腫瘤細(xì)胞的凋亡和壞死過程中，可從ctDNA中獲得腫瘤DNA本身的點(diǎn)突變、重排、擴(kuò)增等信息，因?yàn)閺睦碚撋险f，ctDNA含有與腫瘤DNA完全相同的片段[21]。同時(shí)，ctDNA比CTCs更為敏感，更易被檢測(cè)出來，已經(jīng)證實(shí)在沒有任何CTCs的情況下，ctDNA也可以在血漿中被檢測(cè)出來。

2.2ctDNA與cfDNA ctDNA的半衰期為15 min～2 h，可用作動(dòng)態(tài)的腫瘤標(biāo)志物，以實(shí)時(shí)準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)腫瘤負(fù)荷，評(píng)估乳腺癌新輔助化療療效等。ctDNA片段的大小在70～200 bp，通常大于非腫瘤的cfDNA[3]，并且大約只占cfDNA的0.01%。在健康人群中，cfDNA的血漿濃度范圍為3～15 ng/ml，但在晚期癌癥患者中，cfDNA的血漿濃度范圍上升至10～1 000 ng/ml。ctDNA/cfDNA的比例取決于腫瘤和免疫學(xué)因素，包括腫瘤進(jìn)展、腫瘤負(fù)荷和血液清除機(jī)制等。從外周血提取出ctDNA后，通過檢測(cè)其數(shù)量和基因組成等，可以達(dá)到對(duì)腫瘤進(jìn)行監(jiān)測(cè)。但由于ctDNA的半衰期較短，若機(jī)體處于炎癥或損傷狀態(tài)時(shí)，大量cfDNA將被釋放進(jìn)入外周循環(huán)中，導(dǎo)致血液中的ctDNA/cfDNA比值下降，因此ctDNA受取樣時(shí)間、溫度以及患者體內(nèi)除腫瘤外等因素影響較大[22]，從而要求ctDNA的檢測(cè)方法有極高的靈敏度。

2.3ctDNA的檢測(cè)技術(shù)與手段 ctDNA現(xiàn)有的檢測(cè)技術(shù)未及CTCs成熟，主要有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)技術(shù)和二代測(cè)序技術(shù)。PCR技術(shù)包括突變擴(kuò)增系統(tǒng)(amplification refractory mutation system,ARMS)PCR、肽核酸鉗制PCR、微滴式數(shù)字PCR(digital PCR,dPCR)[23]和BEAMing技術(shù)(基于小珠、乳濁液、擴(kuò)增、磁性、結(jié)合dPCR以及流式技術(shù)的一種檢測(cè)手段)[24]。dPCR只能分析有限數(shù)量的單個(gè)堿基對(duì)變化，并且通量相對(duì)較低，因此只能用于熱點(diǎn)突變檢測(cè)，而不能用于發(fā)現(xiàn)新突變。而ARMS方法目前已獲得中國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于臨床ctDNA檢測(cè)并廣泛應(yīng)用于臨床。二代測(cè)序技術(shù)與PCR技術(shù)不同，二代測(cè)序不專注于檢測(cè)熱點(diǎn)突變，而是掃描更大區(qū)域的基因組變化，它能同時(shí)對(duì)上百萬個(gè)DNA模板的序列進(jìn)行測(cè)序，并且能夠快速識(shí)別ctDNA中腫瘤來源的變異。靈活運(yùn)用這兩項(xiàng)技術(shù)可以同時(shí)在一個(gè)或多個(gè)樣本中研究多個(gè)目的基因。當(dāng)二代測(cè)序已經(jīng)通過分析找到腫瘤特定基因組改變時(shí)，可以運(yùn)用PCR技術(shù)對(duì)該特定基因進(jìn)行熱點(diǎn)突變檢測(cè)，進(jìn)一步提高ctDNA檢測(cè)的效率和準(zhǔn)確率。

2.4ctDNA的臨床應(yīng)用 ctDNA的臨床應(yīng)用包括轉(zhuǎn)移性疾病的早期發(fā)現(xiàn)，治療開始前及治療后評(píng)估預(yù)后的價(jià)值。對(duì)于乳腺癌而言，攜帶ctDNA的體細(xì)胞突變具有潛在的敏感性和特異性，使ctDNA可以作為腫瘤標(biāo)志物用于乳腺癌實(shí)時(shí)檢測(cè)。在晚期及轉(zhuǎn)移性乳腺癌的ctDNA中，檢測(cè)到的突變基因以ESR1、PIK3CA、TP53、REBB2等基因?yàn)橹鱗25]。而對(duì)于無任何宏觀轉(zhuǎn)移證據(jù)的乳腺癌患者來說，ctDNA仍然可以作為評(píng)估乳腺癌是否轉(zhuǎn)移的超早期監(jiān)測(cè)指標(biāo)，并且具有高度的特異性。同樣，通過二代測(cè)序分析乳腺癌原發(fā)灶，以確定是否存在可能的基因組改變。在78%的腫瘤中至少檢測(cè)到一種突變，然后通過單獨(dú)的dPCR在血漿樣品中追蹤鑒定出的突變。在不同時(shí)間點(diǎn)至少可獲得3個(gè)樣本：在新輔助治療之前，手術(shù)后以及隨后每6個(gè)月進(jìn)行一次基線隨訪。在基線隨訪中，69%的血漿樣本中檢測(cè)到ctDNA，與腫瘤分析非常吻合，并且中位數(shù)13.6個(gè)月內(nèi)發(fā)現(xiàn)了殘留疾病。該研究也驗(yàn)證了ctDNA預(yù)測(cè)乳腺癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)方面的價(jià)值。此外，乳腺癌患者的局部淋巴結(jié)中亦可檢出ctDNA，表明對(duì)患者淋巴結(jié)行ctDNA檢測(cè)對(duì)乳腺癌的診斷應(yīng)有所幫助[26]。

3 miRNA

3.1miRNA的定義 miRNA是一種非編碼性微小RNA，通常由21～25個(gè)核苷酸組成，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡等眾多過程中起到了重要作用，影響著腫瘤發(fā)生、發(fā)展[27]。細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)，包括微泡和外泌體，是由脂質(zhì)雙層包圍的納米顆粒，在循環(huán)中不受酶降解的影響。EVs具有異質(zhì)性，而較大的EVs，如凋亡小體(50～5 000 nm)或微泡(100～1 000 nm)大多含有片段DNA，較小的EVs如外泌體(30～150 nm)富含細(xì)胞類型特異性非編碼、調(diào)節(jié)性微小RNA[28]，在細(xì)胞間的信息交流發(fā)揮作用[29]。外泌體釋放RNA是細(xì)胞之間遺傳信息交換的重要機(jī)制，miRNA由外泌體分泌到體液中，而位于循環(huán)中的miRNA非常穩(wěn)定，可以方便地用作復(fù)雜疾病的信息性生物標(biāo)志物。在正常組織和病變組織中，miRNA的表達(dá)譜呈現(xiàn)出很大的差異，并表現(xiàn)出特定環(huán)境下的特征，對(duì)血漿、血清和其他體液中循環(huán)miRNA的研究表明，與健康個(gè)體相比，循環(huán)中的miRNA在口腔鱗癌患者的體液中顯示出不同的水平。外泌體釋放的miRNA約占循環(huán)中無細(xì)胞miRNA總量的3%。由于miRNA的這種特性，因此miRNA可以作為液體活檢中的一種標(biāo)志物，用以乳腺癌的診斷及治療[30]。

3.2miRNA的檢測(cè)技術(shù)與手段 高通量miRNA測(cè)序技術(shù)可用于在外泌體中檢測(cè)miRNA，而目前研究不能提供外泌體中詳細(xì)的miRNA表達(dá)譜，因此只能大概進(jìn)行對(duì)比辨別miRNA的來源及表達(dá)譜[31]。miRNA-195是乳腺癌生物標(biāo)志物研究的miRNA之一。一項(xiàng)研究描述了miRNA在乳腺癌患者的全血中的表達(dá)明顯高于對(duì)照組。來自同一研究組的另一項(xiàng)研究也證實(shí)，與其他類型癌癥組成的隊(duì)列相比，miRNA-195過表達(dá)的準(zhǔn)確性僅能檢測(cè)出乳腺癌患者，而不能檢測(cè)患有其他類型癌癥患者。同樣，另一項(xiàng)研究中證實(shí)了與對(duì)照組相比，乳腺癌患者血清中miRNA-195顯著過表達(dá)。而有研究表明，miRNA-193和miRNA-210在不同分子亞型的乳腺癌中亦有表達(dá)，且miRNA-210在抑制后可對(duì)乳腺惡性腫瘤的增殖，尤其是在侵襲性最強(qiáng)的三陰性人乳腺癌細(xì)胞增殖起調(diào)控作用[32]。還有miRNA-21和miRNA-221/222與新輔助化療和雌激素受體陽(yáng)性患者中的他莫昔芬耐藥程度有關(guān)。miRNA與外泌體可以在基因表達(dá)譜層面上對(duì)乳腺癌進(jìn)行分析，與CTCs及ctDNA通過檢測(cè)數(shù)目及濃度進(jìn)行診療相比，側(cè)重點(diǎn)有所不同，能更精確地反映乳腺癌的個(gè)體化差異。然而，受限于目前基因譜數(shù)據(jù)的挖掘、miRNA檢驗(yàn)方法的選擇、數(shù)據(jù)分析的差異，miRNA應(yīng)用于臨床乳腺癌液體活檢還有很長(zhǎng)的道路[33]。

4 小結(jié)

CTCs在判斷乳腺癌患者預(yù)后方面有著較大的優(yōu)勢(shì)，ctDNA則更利于動(dòng)態(tài)追蹤腫瘤的轉(zhuǎn)移以及復(fù)發(fā)。miRNA作為新興的液體活檢腫瘤標(biāo)志物，雖然還未能應(yīng)用于臨床，但也展現(xiàn)出其在乳腺腫瘤診療中的巨大潛力。目前液體活檢的普及還面臨著許多困難，如難以保持每次檢測(cè)的精確度和靈敏度，檢測(cè)結(jié)果尚缺臨床上的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。隨著生物技術(shù)快速發(fā)展，液體活檢在乳腺癌診療中的優(yōu)勢(shì)將更為明顯，將廣泛用于乳腺癌的超早期診斷、新輔助化療療效評(píng)估、術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的監(jiān)測(cè)以及預(yù)后評(píng)估等。細(xì)胞微粒、血小板等其他腫瘤標(biāo)志物尚待進(jìn)一步研究。