劉舒恒(綜述)， 柳美蘭(審校)

心肌梗死是一種危及生命的疾病，可以造成心肌細(xì)胞的永久喪失和瘢痕組織的產(chǎn)生，導(dǎo)致心臟功能不可逆轉(zhuǎn)的損害[1]。盡管心肌梗死的再灌注治療和藥物治療取得了進(jìn)展，但由于進(jìn)行性左心室重構(gòu)，仍有部分患者發(fā)展為頑固性心力衰竭[2]。研究證實(shí)了不同類型干細(xì)胞，如骨骼肌母細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞和內(nèi)源性心臟干細(xì)胞在心血管疾病中的治療潛力。其中，間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有分化為中胚層和非中胚層組織的能力，免疫調(diào)節(jié)特性以及釋放營養(yǎng)因子[3]。目前對MSCs移植治療心肌梗死的生物學(xué)特性、作用機(jī)制取得了較大進(jìn)展。MSCs具有自我更新與多向分化潛能、免疫原性低、趨化歸巢等特性以及治療心肌梗死的關(guān)鍵作用機(jī)制——旁分泌途徑。但MSCs移植后歸巢數(shù)量少，生存率低，移植途徑及能否分化為心肌細(xì)胞限制了其治療發(fā)展。外泌體(exosomes，Exo)是一種納米顆粒，從質(zhì)膜中以多泡體的形式釋放出來，CD9、CD63和CD81呈陽性[4]。它被認(rèn)為是細(xì)胞間通訊、免疫調(diào)節(jié)、增殖、細(xì)胞衰老和分化的重要介質(zhì)，通過將各種生物活性物質(zhì)(如mRNA、microRNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì))從一個細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個細(xì)胞，因其高生物相容性和低免疫原性而顯示出巨大的前景。它具有誘導(dǎo)血運(yùn)重建、增加供氧、抑制心肌細(xì)胞凋亡和減少心肌纖維化的能力[5]。研究發(fā)現(xiàn)，MSCs分泌的Exo表現(xiàn)出與MSCs相似的功能。因此，MSCs分泌的Exo可能作為治療心肌梗死的一種新方法[6]。但Exo由于其細(xì)胞培養(yǎng)物的低產(chǎn)量加上復(fù)雜的純化過程，其主要障礙仍然存在，用于治療心肌梗死的機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究[7]。

1 MSCs的生物學(xué)特性

1.1MSCs的增殖與分化潛能 MSCs可以從多種組織中獲得，包括骨髓、脂肪組織、臍帶組織、胎盤、臍帶血、羊水、外周血、肝、肺、牙髓、骨骼肌和毛囊[8]，具有較強(qiáng)的增殖能力與分化潛能。在急性缺血的心臟中，波形蛋白誘導(dǎo)的心臟內(nèi)源性MSCs似乎是增殖的第一反應(yīng)[9]。心肌梗死后心肌內(nèi)可檢測到心肌MSCs的細(xì)胞群，其特征是波形蛋白、CD29、CD44、CD90、CD105、PDGFFRα和DDR2呈陽性表達(dá)，這些MSCs具有典型的克隆原性，具有集落形成單位-成纖維細(xì)胞以及成脂、成軟骨和成骨分化特性。研究證明c-kit+MSCs來源的骨髓是一種新的c-kit+細(xì)胞群，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)是轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-beta,TGF-β)超家族中的一員，可誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞、心肌前體細(xì)胞和c-kit+/SCA-1+骨髓來源細(xì)胞向功能性心肌細(xì)胞分化，改善心肌梗死后心功能[10]。研究表明miRNAs在調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的增殖、分化和功能方面起著至關(guān)重要的作用，在miRNAs中，miR-19a/19b能促進(jìn)離體心肌細(xì)胞的增殖，在心臟再生和功能保護(hù)中發(fā)揮重要作用。MSCs可通過不同的化學(xué)培養(yǎng)方法在體外誘導(dǎo)轉(zhuǎn)分化為心肌細(xì)胞[3]。5-氮雜胞苷、BMP-2、血管緊張素Ⅱ、二甲基亞砜、成纖維細(xì)胞生長因子-4是常用的誘導(dǎo)心肌細(xì)胞分化的化學(xué)物質(zhì)。5-氮雜胞苷是胚胎和成體干細(xì)胞向心肌分化的有效誘導(dǎo)劑，在體外可誘導(dǎo)成年大鼠骨髓MSCs分化為心肌樣細(xì)胞，誘導(dǎo)后的細(xì)胞表現(xiàn)出與心肌細(xì)胞相似的形態(tài)特征，并表達(dá)心肌特異性標(biāo)志物。然而，它們在培養(yǎng)超過8周后的長期存活顯示并沒有導(dǎo)致分化的改善。因此，不建議延長5-氮雜胞苷誘導(dǎo)的骨髓MSCs在培養(yǎng)中的維持時間，5-氮雜胞苷進(jìn)一步促進(jìn)心肌細(xì)胞分化的機(jī)制仍有待闡明[11]。綜上，MSCs的增殖與分化潛能在缺血心臟中發(fā)揮著重要作用，為心肌梗死后心肌細(xì)胞再生提供了可能性。

1.2MSCs的免疫調(diào)節(jié)特性 MSCs的優(yōu)點(diǎn)在于它們的免疫調(diào)節(jié)特性使得其可以作為供體細(xì)胞的普遍儲備。研究表明，MSCs的表面抗原表型不是單一的，表面標(biāo)志物CD105、CD73和CD90呈陽性(>95%)，而CD45、CD34、CD14/CD11b、CD79α/CD19呈陰性(≤2%)，這些獨(dú)特的表面標(biāo)記分布，使它們能夠逃脫免疫細(xì)胞的檢測[12]。骨髓MSCs的另一個重要特點(diǎn)是免疫原性低，它們低表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類蛋白，不表達(dá)共刺激分子CD40、CD80和CD86等[13]。MSCs的免疫調(diào)節(jié)有旁分泌效應(yīng)和細(xì)胞間直接接觸兩種方式。前者是通過分泌TGF-β、肝細(xì)胞生長因子、一氧化氮、血紅素加氧酶、白介素(interleukin,IL)-6、前列腺素E2和吲哚胺2，3雙加氧酶、白血病抑制因子、CCL-2、半凝集素1，3和信號素-3a來實(shí)現(xiàn)的。MSCs還可以分泌Exo，這是一種包含特定亞群的mRNA、miRNA和蛋白質(zhì)的小泡，調(diào)節(jié)各種生物過程。Exo是免疫細(xì)胞之間重要的交互作用的連接平臺。因此，MSCs來源的Exo被認(rèn)為可以調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)并幫助心臟保護(hù)[14]。MSCs也是免疫調(diào)節(jié)劑能抑制中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的激活，同時促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增殖和抗炎巨噬細(xì)胞極化，研究顯示NES+cMSCs的修復(fù)功能部分是通過巨噬細(xì)胞對M2亞型的極化來實(shí)現(xiàn)的[15]。此外，MSCs影響B(tài)細(xì)胞對CXCL12和CXCL13的趨化能力，從而阻斷B細(xì)胞向炎癥區(qū)域的遷移[16]。MSCs具有通過抑制促炎反應(yīng)和刺激抗炎活性來調(diào)節(jié)先天免疫反應(yīng)和獲得性免疫反應(yīng)的能力，但其免疫調(diào)節(jié)特性是多方面復(fù)雜的過程，需要不斷探索其調(diào)節(jié)機(jī)制。

1.3MSCs的歸巢能力 心肌梗死后，干細(xì)胞可以通過趨化因子的趨化作用自發(fā)地歸巢到受損的心肌上，并參與生理性修復(fù)。此外，歸巢干細(xì)胞的數(shù)量受基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α(stromal cell-derived factor-1α,SDF-1α)表達(dá)水平的控制[17]。目前研究顯示SDF-1/趨化因子受體4(CXCR4)軸是干/祖細(xì)胞歸巢、趨化、植入和滯留到缺血組織中最重要的因素之一[18]。已有研究表明，超聲介導(dǎo)的微泡破壞(ultrasound targeted microbubble destruction,UTMD)可以在毛細(xì)血管壁上形成孔隙，改變局部心肌微環(huán)境，促進(jìn)移植干細(xì)胞從血管到缺血心肌組織的歸巢[19]。目前研究結(jié)果顯示提高M(jìn)SCs歸巢能力能顯著改善受損心肌，具體調(diào)控機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

2 MSCs移植治療心肌梗死的作用機(jī)制

2.1促血管生成 MSCs能分泌多種細(xì)胞因子，在缺血組織中發(fā)揮有益的血管生成作用，血小板生成素和血管生成素這些因素都參與了MSCs的動員、遷移、歸巢、黏附和滯留以及內(nèi)皮細(xì)胞的分化等新生血管形成過程[3]。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示BMP-2預(yù)誘導(dǎo)的細(xì)胞促進(jìn)移植后的心肌發(fā)生、血管生成和心臟功能的改善[10]。研究表明，在衰老的人骨髓MSCs中過表達(dá)miR-10a通過抑制KLF4可激活A(yù)kt，刺激血管生成因子的表達(dá)，使老化的人骨髓MSCs恢復(fù)活力，改善受損小鼠心臟的血管生成和心功能[20]。有結(jié)果表明，在心肌梗死大鼠模型中，CD73+脂肪組織(adipose derived,AD)-MSCs通過促進(jìn)血管生成，比混合的AD-MSCs和CD73-AD-MSCs更有效地促進(jìn)了心臟恢復(fù)功能。此外，在AD-MSCs中表達(dá)CD73后，可促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子、生長因子-1α和肝細(xì)胞生長因子的分泌[21]。MSCs通過分泌多種細(xì)胞因子促進(jìn)缺血組織的血管生成，可能為心肌梗死后血管重建起到重要作用。

2.2免疫抑制 研究已證明目前使用MSCs的意義在于分泌多種免疫抑制可溶性因子、細(xì)胞因子和趨化因子，抑制宿主免疫細(xì)胞增殖。急性心肌梗死的炎性微環(huán)境對受損心肌再生的干細(xì)胞潛能有抑制作用，各種細(xì)胞因子表現(xiàn)出其免疫抑制特性，抑制過度炎癥反應(yīng)，改善心肌微環(huán)境。腫瘤壞死因子-β(tumor necrosis factor-β,TNF-β)、IL-1、IL-6等具有促炎作用的關(guān)鍵細(xì)胞因子的分泌，誘導(dǎo)缺氧狀態(tài)，最終形成細(xì)胞毒成分，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，阻礙干細(xì)胞的增殖和分化[22]。研究表明，MSCs來源的Exo通過將炎癥巨噬細(xì)胞極化到心臟內(nèi)的抗炎巨噬細(xì)胞群體來減輕心肌損傷。miR-182作用在MSCs來源的Exo中，通過靶向TLR4/NF-κB/PI3K/Akt信號級聯(lián)參與巨噬細(xì)胞極化的調(diào)節(jié)[23]。CTRP9是一種新的心臟因子，現(xiàn)有研究結(jié)果提示，保留CTRP9產(chǎn)生或外源性CTRP9補(bǔ)充的分子干預(yù)可能會創(chuàng)造一個健康的微環(huán)境，促進(jìn)干細(xì)胞存活，優(yōu)化其對缺血性心臟損傷的心臟保護(hù)作用[10]。胰島素樣生長因子-1是MSCs重要的旁分泌生長因子，研究表明過表達(dá)胰島素樣生長因子-1在缺氧條件下具有較高的細(xì)胞增殖率、遷移能力和干性，并具有較強(qiáng)的抗凋亡能力[24]。多項研究結(jié)果表明，阿托伐他汀能提高心肌梗死模型中植入MSCs的存活率，并與MSCs聯(lián)合，通過減少炎癥細(xì)胞浸潤、髓過氧化物酶活性和心肌纖維化，改善心肌環(huán)境[25]。MSCs通過細(xì)胞分泌多種免疫抑制因子、促進(jìn)心臟保護(hù)因子的增殖以及聯(lián)合藥物等多種機(jī)制來發(fā)揮其治療心肌梗死的作用，但具體臨床實(shí)際應(yīng)用還有待進(jìn)一步探討。

2.3旁分泌機(jī)制 MSCs發(fā)揮治療作用的主要機(jī)制是旁分泌作用，分化為心肌細(xì)胞系、促血管生成、抗纖維化、抗炎、抗凋亡和免疫調(diào)節(jié)作用是心臟修復(fù)過程中MSCs功能的主要驅(qū)動因素。越來越多的證據(jù)表明，MSCs的分泌體和(或)其胞外小泡在介導(dǎo)這些功能的同時，以旁分泌的方式發(fā)揮著重要作用[3]。心肌梗死后，浸潤的巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞表達(dá)的基質(zhì)金屬蛋白酶，特別是基質(zhì)金屬蛋白酶-2和基質(zhì)金屬蛋白酶-9，通過基質(zhì)金屬蛋白酶/基質(zhì)金屬蛋白酶-9軸觸發(fā)再生信號，介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白降解、細(xì)胞增殖和遷移[26]。MSCs衍生的Exo對促進(jìn)血管生成、抗細(xì)胞凋亡及抗炎方面發(fā)揮心臟保護(hù)作用，缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)增強(qiáng)的血管生成在介導(dǎo)心臟保護(hù)中起著關(guān)鍵作用，Exo-HIF-1α對缺血性心臟的促血管生成和心臟保護(hù)作用是通過血管內(nèi)皮生長因子和血小板源性生長因子介導(dǎo)的。此外，Exo-HIF-1α可以挽救缺氧損傷的血管生成、增殖和遷移[5]。研究結(jié)果表明，SDF1可通過激活PI3K信號通路抑制心肌細(xì)胞自噬，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞微血管再生，保護(hù)心肌梗死小鼠的心臟功能，因此，SDF可以作為心肌梗死的治療劑。但該研究尚處于臨床前階段，作用機(jī)制尚不充分。提高SDF1治療心肌梗死的效率和安全性可能是關(guān)鍵[27]。研究顯示，Exo通過抑制心肌細(xì)胞凋亡和促進(jìn)血管生成和細(xì)胞基質(zhì)重構(gòu)來修復(fù)缺血心肌[28]。MSCs發(fā)揮心臟修復(fù)的功能主要是由旁分泌途徑介導(dǎo)的，因此深入研究旁分泌機(jī)制將成為MSCs治療心肌梗死的前景。

3 MSCs移植治療心肌梗死面臨的問題及未來展望

MSCs衍生的Exo與MSCs相比，保留了親代細(xì)胞的功能，具有長期穩(wěn)定性和最少的免疫排斥，是一種有前途的無細(xì)胞治療方法[29]。近年來，已經(jīng)設(shè)計和研究了各種新策略來增強(qiáng)基于干細(xì)胞的Exo療法，包括細(xì)胞預(yù)處理、生物材料方法等。缺氧處理可增強(qiáng)MSCs的旁分泌作用，研究表明缺氧在增強(qiáng)MSCs治療心血管適應(yīng)證方面的有益作用在很大程度上可歸因于缺氧對增強(qiáng)Exo中miR-210中性鞘磷脂酶2的活性，這些作用可能部分由HIF-1α介導(dǎo)[30]。研究發(fā)現(xiàn)，Exo通過NF-κB信號通路和Nrf2/HO-1軸發(fā)揮抗炎作用并促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞極化，有望成為心肌梗死的無細(xì)胞治療方法[31]。生物材料方法近年來有較好的發(fā)展。實(shí)驗(yàn)顯示具有高生物相容性和轉(zhuǎn)染效率的基于Exo模擬納米復(fù)合物的miRNA遞送系統(tǒng)為miRNA治療心肌梗死提供了廣闊的前景[7]。單核細(xì)胞模擬物對受損心肌表現(xiàn)出更高的靶向效率，從而有助于單核細(xì)胞模擬物上的獨(dú)特的黏附分子互動。與MSCs-Exo生物功能一致，以改善小鼠心肌缺血再灌注損傷治療過程中干細(xì)胞-EVs的歸巢[32]，開發(fā)了源自氧化鐵納米顆粒的Exo模擬細(xì)胞外納米囊泡，減少細(xì)胞凋亡和纖維化，增強(qiáng)血管生成和心臟功能恢復(fù)[33]。Exo主要成分微小RNA(miRNA)在心肌梗死后的凋亡、血管生成和纖維化中起作用[29]。最高度表達(dá)的miRNA是miR-21a-5p，被認(rèn)為是通過下調(diào)促細(xì)胞死亡靶基因來保護(hù)心臟的。此外，鑒定了幾種具有高Exo表達(dá)的心臟保護(hù)性miRNA。如MSCs-Exo中的miR-22-3p顯示通過下調(diào)甲基CpG結(jié)合蛋白2來保護(hù)小鼠心肌，在缺血再灌注損傷后升高；miR-451a已被證明在缺血預(yù)處理后增加，并通過下調(diào)Rac-1在心臟中發(fā)揮保護(hù)作用，從而減少氧化應(yīng)激；miR-126-3p具有血管生成性，從而支持心臟修復(fù)。有研究證實(shí)，通過下調(diào)miR-21的靶標(biāo)具有心臟保護(hù)作用[34]。其他研究顯示miRNA-133具有抗凋亡和抗纖維化作用；miRNA-1具有特定的抗氧化作用；miRNA-499具有抗凋亡特性。在另一項研究中，在心肌梗死模型中存在水平升高的miR-210、miR-132和miR-146a-3p，誘導(dǎo)持續(xù)的抗凋亡和促血管生成反應(yīng)[35]。隨著對Exo的深入研究，其有可能改善MSCs增殖分化、免疫調(diào)節(jié)、促血管生成及抗細(xì)胞凋亡等生物學(xué)功能，從而提高M(jìn)SCs移植的存活率，增加歸巢數(shù)量，最終達(dá)到修復(fù)心臟結(jié)構(gòu)和功能的效果，促進(jìn)MSCs在臨床研究中的應(yīng)用。