方 堅， 阮 梅， 夏 磊， 黃 倩， 陳豐穗， 張志強， 張 霞， 賴彥華， 李 懿， 吳志賢， 周麗麗

肝移植術是部分肝癌患者及終末期肝病患者最佳治療選擇之一，我國每年肝移植數(shù)量達5 000余例[1]。得益于免疫抑制治療藥物的進步等原因，患者肝移植術后的生存期顯著提升[2]。2015—2020年我國大陸公民逝世后器官捐獻肝移植受者術后1年、3年的累計生存率分別為83.6%、74.9%[3]。移植術后肝癌復發(fā)是影響患者生存的主要原因之一[4]。我國大陸移植患者中，肝癌受者比例為36.8%[5]，而20%～57%的患者在術后出現(xiàn)復發(fā)[5-6]，中位生存期通常不足1年[2，7]。因此，尋找可靠的指標評估肝癌患者移植術后復發(fā)的風險因素具有重要的價值。著絲粒蛋白L(centromere protein L,CENPL)是著絲粒蛋白家族的成員。著絲粒蛋白可結合紡錘體微管，細胞分裂時調控染色體分離[8]。CENPL的突變會影響著絲粒相關網(wǎng)絡蛋白的相互作用，從而阻礙著絲粒組裝和染色體排列[9]。本研究團隊的前期研究發(fā)現(xiàn)，CENPL可能在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[10]。然而，目前鮮有文獻報道CENPL在移植術后肝癌復發(fā)中的作用。鑒此，本研究旨在探討肝移植術后肝癌復發(fā)患者CENPL表達情況及其與臨床病理參數(shù)和復發(fā)的關聯(lián)性。

1 對象與方法

1.1研究對象 選擇2014年1月至2020年6月在福建中醫(yī)藥大學附屬第三人民醫(yī)院、聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院和廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院行肝移植術并在術后發(fā)生肝細胞癌復發(fā)的患者93例(復發(fā)組)。經(jīng)性別與年齡匹配，選擇同期行肝移植手術但術后未復發(fā)的肝細胞癌患者46例(未復發(fā)組)。

1.2納入與排除標準 納入標準：(1)肝移植術前經(jīng)病理檢查明確診斷為肝細胞癌；(2)年齡>18歲；(3)病歷資料及隨訪資料完整。排除標準：(1)有其他器官移植史者；(2)合并膽管細胞癌，或其他惡性腫瘤者；(3)隨訪依從性不佳者。

1.3肝移植方法 供體符合我國腦死亡捐贈規(guī)范[11]，手術方法均為原位肝移植。所有患者簽署知情同意書。肝癌肝移植的米蘭標準[12]：單個腫瘤直徑≤5 cm，或腫瘤數(shù)目≤3個，每個直徑≤3 cm，并且無大血管侵犯和遠處轉移。肝癌肝移植的杭州標準[11]：(1)無大血管侵犯和肝外轉移；(2)腫瘤直徑之和小于或等于8 cm，或腫瘤直徑之和大于8 cm，但滿足術前甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)≤400 μg/L，且組織學分級為高、中分化。

1.4資料收集 通過醫(yī)院電子病歷系統(tǒng)收集患者肝移植前的臨床資料，包括年齡、性別、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染、肝硬化、Child-Pugh分級、白細胞(white blood cell,WBC)、血小板(platelet,PLT)、谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、γ-谷氨酰轉肽酶(γ-glutamyl transpeptidase,γ-GGT)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、白蛋白(albumin,ALB)、總膽紅素(total bilirubin,TBil)、血細胞計數(shù)、腫瘤大小、腫瘤包膜、中國肝癌分期(China Liver Cancer Staging，CNLC)、AFP、免疫抑制劑方案、腫瘤復發(fā)時間、隨訪時間等。

1.5隨訪方法 隨訪間隔為1～3個月：對于術后早期指標不穩(wěn)定的患者隨訪間隔為1個月；對于半年后狀態(tài)穩(wěn)定患者，隨訪間隔可延長至3個月。隨訪內容包括生化檢查和影像學檢查?；灆z查內容包括肝腎功能、電解質、血脂、AFP水平及常見腫瘤指標、血細胞分析、凝血功能、乙肝病毒DNA和乙肝五項，以及他克莫司、西羅莫司血藥濃度。影像學檢查包括腹部彩超、腹部或胸部CT或腹部MR。觀察患者肝癌復發(fā)情況，原發(fā)性肝癌復發(fā)診斷主要依據(jù)增強腹部和胸部CT或MR，并結合AFP水平，影像學報告均由有經(jīng)驗的高年資影像學?？漆t(yī)師出具。

1.6免疫組織化學染色 標本來源于患者移植術前自身的病肝組織。常規(guī)二甲苯、酒精脫水?？乖迯停褐蠓?95 ℃，15～20 min)，自然冷卻20 min以上，再用冷水沖洗罐子，加快冷卻至室溫，磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution，PBS)(pH 7.2)沖洗5 min，重復沖洗3次。阻斷滅活內源性過氧化物酶：3% H2O2室溫下孵育10 min，PBS(pH 7.2)沖洗5 min，重復沖洗3次。稀釋一抗，滴加50 μl稀釋好的一抗(用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照)，37 ℃孵育60 min，PBS沖洗5 min，重復沖洗3次。擦干后滴加30 μl聚合物增強劑(二抗試劑A)室溫25 ℃孵育20 min，PBS沖洗5 min，重復沖洗3次。加生物素化抗兔二抗室溫下孵育30 min，PBS沖洗5 min，重復沖洗3次。滴加100 μl新鮮配制的二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色液，顯微鏡下觀察5～20 min。自來水沖洗后，蘇木素復染，PBS液返藍。常規(guī)95%酒精脫水，干燥，封片。對染色程度進行半定量評分。評分標準[13]：切片在400倍顯微鏡下，隨機選取5個視野，每個視野計數(shù)200個細胞，根據(jù)染色細胞所占百分率評分。無明顯細胞著色為0分，1%～10%著色為1分，10%<著色≤30%為2分，>30%著色為3分。再根據(jù)染色強度評分：未顯色或顯色不清為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，深褐色為3分。每張切片最終得分為染色百分率和染色強度平均分數(shù)的乘積，得分≥3分者為高表達，得分<3分者為低表達[13]。免疫組化的一抗購自福州中杉金橋，二抗購自Abcam公司。

2 結果

2.1肝癌組織和癌旁組織免疫組織化學染色結果 光鏡下可見癌組織CENPL染色呈陽性，主要表達在細胞核部位，少量在細胞質表達。癌旁組織未見CENPL染色。見圖1。

?肝癌組織CENPL高表達；?癌旁組織CENPL表達不明顯圖1 肝癌組織和癌旁組織免疫組織化學染色所見(×200)

2.2兩組臨床資料比較 復發(fā)組CNLC為Ⅱ期、CENPL高表達的人數(shù)比例大于未復發(fā)組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其余指標比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組臨床資料比較

2.3肝移植后肝癌復發(fā)的影響因素分析結果 以復發(fā)情況為因變量，將表1中有統(tǒng)計學意義的指標(CNLC、CENPL表達情況)作為自變量納入多因素Cox回歸模型。結果顯示，以CNLC Ⅱ期為參照，CNLC Ⅰ期是肝移植后肝癌復發(fā)的抑制因素[HR(95%CI)=0.46(0.13～0.91)，P=0.013]；以CENPL低表達為參照，CENPL高表達是肝移植后肝癌復發(fā)的促進因素[HR(95%CI)=1.68(1.41～2.99)，P=0.003]。

2.4肝癌復發(fā)患者CENPL高表達組與低表達組的生存預后比較 CENPL高表達組的中位無復發(fā)生存期(recurrence-free survival,RFS)為5(3～22)個月，低表達組中位RFS為8(5～26)個月，兩組差異有統(tǒng)計學意義(log-rank檢驗：χ2=9.269，P=0.002)。CENPL高表達組中位總生存期(overall survival,OS)為14(8～40)個月，低表達組中位OS為22(9～37)個月，兩組差異有統(tǒng)計學意義(log-rank檢驗：χ2=4.406，P=0.031)。見圖2。

?兩組RFS比較；?兩組OS比較圖2 肝癌復發(fā)患者CENPL高表達組與低表達組生存預后情況的Kaplan-Meier生存曲線比較圖

2.5肝癌復發(fā)患者CENPL高表達組與低表達組臨床資料比較 兩組年齡、性別、HBV感染、HCV感染、肝功能、肝硬化、腫瘤包膜、大血管侵犯、遠處轉移等情況比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 肝癌復發(fā)患者CENPL高表達組與低表達組臨床資料比較

3 討論

3.1肝細胞癌復發(fā)導致患者在肝移植后的生存率下降。研究表明，肝移植后肝細胞癌復發(fā)的原因可能包括[14-17]:(1)移植前癌細胞已發(fā)生微轉移；(2)手術操作導致腫瘤破裂，從而引起腫瘤轉移；(3)免疫抑制劑的使用促進了腫瘤細胞的增殖和侵襲。也有研究表明，腫瘤細胞及腫瘤微環(huán)境表達的多種生物分子在腫瘤的復發(fā)中發(fā)揮了重要作用[18]。術前檢測這些分子標志物，術后定量檢測分泌性標志物的相應抗體，可預測肝移植后腫瘤復發(fā)。但目前尚未有公認和廣泛應用的標志物，因此進一步尋找具有應用價值的標志物具有重要的臨床意義。

3.2CENPL是著絲粒蛋白H-著絲粒蛋白I(centromere protein H-centromere protein I,CENPH-CENPI)相關的著絲粒復合體的一個亞基，是正常著絲粒功能和有絲分裂過程不可缺少的蛋白[19]。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)與CENPL相關的疾病包括染色體22Q11.2缺失綜合征、染色體17p13.3重復綜合征。目前關于CENPL在腫瘤中的研究報道較少。有文獻報道CENPL mRNA在肝細胞癌中過表達，其水平與患者的臨床病理參數(shù)密切相關[10]。CENPL mRNA高表達者的生存預后情況較差。在沒有肝炎病毒感染的白種人和黃種人男性肝癌患者中，更高水平的CENPL mRNA與較差的OS相關。通過整合多個數(shù)據(jù)庫，Zeng等[20]研究發(fā)現(xiàn)，CENPL在多種癌癥類型中都呈高表達，且與不良臨床病理學特征顯著相關；基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)結果發(fā)現(xiàn)CENPL可能通過細胞周期、DNA復制、p53信號通路和卵母細胞減數(shù)分裂等途徑參與肝細胞癌的發(fā)生和進展。此外，有研究發(fā)現(xiàn)CENPL的表達與多種免疫細胞標志物呈正相關，其中與M1巨噬細胞標志物干擾素調節(jié)因子5(interferon regulatory factors，IRF5)、Treg細胞標志物趨化因子受體8(chemokine receptor 8，CCR8)以及信號轉導和轉錄激活因子5B(signal transduction and activator of transcription 5B，STAT5B)的相關性最高。CENPL與T細胞衰竭標志物也存在正相關，包括程序性死亡受體1(programmed death 1，PD-1)、細胞毒T淋巴細胞相關抗原-4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA4)、淋巴細胞活化基因-3(lymphocyte activation gene-3,LAG3)、胸腺細胞選擇相關高遷移率群盒蛋白(thymocyte selection-related high mobility group box protein，TOX)、T細胞免疫球蛋白和ITIM結構域蛋白(T cell immunoglobulin and ITIM domain protein，TIGIT)、重組人顆粒酶-B(recombinant human granzyme-B，GZMB)和T細胞免疫球蛋白黏蛋白-3(T cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein-3，Tim-3)，特別是與Tim-3的相關性最高[21]。本研究免疫組化結果也顯示CENPL在肝細胞癌組織中呈高表達，這與Feng等[22]的研究結果相似。也有研究發(fā)現(xiàn)在肝細胞癌患者中，CENPL的表達水平與B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、中性粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞等免疫指標呈正相關[23-24]。這解釋了CENPL高表達預測不良預后的結果，也為新的免疫治療方法提供了參考。

3.3目前關于CENPL在肝移植術后肝癌復發(fā)中的機制尚不明確。本研究結果顯示，復發(fā)組的CENPL表達水平顯著高于未復發(fā)組。進一步分析發(fā)現(xiàn)，在肝癌復發(fā)患者中，CENPL高表達組的RFS、OS較低表達組更差，提示CENPL與肝移植術后肝細胞癌復發(fā)有關聯(lián)。另外，高表達CENPL組發(fā)生血管侵犯和遠處轉移的人數(shù)比例較低表達組更高，但結果未顯示出統(tǒng)計學意義，這可能與本研究病例數(shù)不足有關。近年來有一些研究者嘗試研究肝移植術后肝細胞癌復發(fā)的預測標志物。王超[25]研究了供肝移植物單碳代謝基因多態(tài)性與肝移植后肝細胞癌復發(fā)風險之間的關系，結果發(fā)現(xiàn)單碳代謝基因多態(tài)性在肝移植后肝細胞癌復發(fā)中具有重要作用，供體的rs1801394和rs1127717多態(tài)性可作為肝移植受者肝細胞癌復發(fā)的生物標志物。有學者認為腫瘤內肥大細胞(mast cells within the tumor，iMC)可能參與肝癌的抗腫瘤免疫作用[26]，其可預測移植后腫瘤復發(fā)。值得注意的是，對于超出了米蘭標準的患者，iMC可以識別低風險患者；而在低AFP患者中，iMC可以識別高?；颊?。

綜上所述，CENPL表達與肝移植術后肝細胞癌復發(fā)具有關聯(lián)性，高水平CENPL與患者不良預后有關。但本研究為回顧性研究，且樣本量較小，所得結論有待進一步驗證。另外，CENPL為非分泌性蛋白，難以在血清中便捷檢測，故其在臨床中的應用價值也有待開發(fā)，相關具體機制值得深入探索。