樓津圻 王媛 蔡玲斐 康艷華

杭州師范大學(xué)，浙江 杭州 311121

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是一種臨床常見的呼吸系統(tǒng)疾病，主要以肺水腫、肺上皮和內(nèi)皮細(xì)胞損傷為病理特征［1］。細(xì)菌感染是造成ALI/急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）的主要誘因［2-3］。金黃色葡萄球菌，尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA）感染引起的ALI由于缺乏有效的藥物與干預(yù)措施，其死亡率居高不下，已成為危重癥患者死亡的主要原因［4］。耐藥菌感染是危重病領(lǐng)域面臨的棘手難題，給臨床抗感染治療帶來巨大挑戰(zhàn)。近年來，從MRSA感染的致病機(jī)制和機(jī)體免疫防御角度探尋新的治療靶標(biāo)頗受關(guān)注，但其確切機(jī)制仍有待闡明。在研究過程中感染模型的構(gòu)建、組織器官的細(xì)菌載量以及固有免疫細(xì)胞對細(xì)菌的吞噬殺傷功能的檢測等都是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定、可靠的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。而準(zhǔn)確的細(xì)菌定量在此環(huán)節(jié)中起著決定性作用。

細(xì)菌定量主要通過測定活菌數(shù)來實(shí)現(xiàn)。目前國內(nèi)外使用較為普遍的活菌計(jì)數(shù)方法是平板菌落計(jì)數(shù)法，然而該方法在實(shí)際操作過程以及結(jié)果統(tǒng)計(jì)方面存在著很大爭議。國內(nèi)學(xué)者不斷的探索新方法、新策略來排除各種影響及干擾因素，比如改進(jìn)試驗(yàn)樣本的稀釋方式、菌種的繁殖方式、接種方式以及計(jì)數(shù)方法等［5-9］。本研究采用傾注法和微量法培養(yǎng)細(xì)菌，比較兩種不同接種方式對活菌總量的影響；同時(shí)應(yīng)用可見光分光光度計(jì)檢測菌懸液的吸光度，探討微量法接種培養(yǎng)的細(xì)菌總量與菌液吸光度之間關(guān)系，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，以便快捷穩(wěn)定的計(jì)算細(xì)菌濃度，提高工作效率。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 自控手提式壓力蒸汽滅菌器、霉菌培養(yǎng)箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；數(shù)顯恒溫浴鍋（上海碩光電子科技有限公司）；生物安全柜（Thermo公司）；721型可見分光光度計(jì)（上海菁華科技有限公司）；營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（杭州濱和微生物試劑有限公司）；哥倫比亞血瓊脂平板（杭州怡丹生物技術(shù)有限公司）。

1.2 菌種MRSA USA300菌株由杭州師范大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫與病原生物系實(shí)驗(yàn)室分離并保存。

1.3 菌種復(fù)蘇與培養(yǎng) 取出-80℃冰箱中保存的MRSA USA300菌株甘油管，冰上自然溶解，挑取少量菌液劃線接種于血瓊脂平板上，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。次日挑取具有透明溶血環(huán)的單克隆菌落再次接種血瓊脂平板上，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24h后，備用。

1.4 菌懸液的配制 刮取血平板上的菌苔置于10mL無菌生理鹽水中，吹打混勻配成菌懸液。

1.5 細(xì)菌的接種與計(jì)數(shù)

1.5.1 傾注平板接種法。在試管中將菌懸液進(jìn)行10倍系列稀釋。取稀釋度為10-5、10-6、10-7、10-8的菌液各1mL接種于無菌培養(yǎng)皿中，將10mL冷卻至45℃左右的普通瓊脂培養(yǎng)基倒于已加入菌液的培養(yǎng)皿中，并輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)使其與菌液均勻混合，待凝固后置37℃培養(yǎng)18～24h后，觀察菌落生長狀態(tài)，拍照并用ImageJ軟件對平板上的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)［10］。見圖1。每個(gè)稀釋度接種3個(gè)平板，并計(jì)算同一稀釋度的平均菌落數(shù)。

圖1 ImageJ軟件統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的示意圖

1.5.2 微量滴注接種法。使用96孔板將原液進(jìn)行10倍系列稀釋。取同樣稀釋度的菌液各0.01mL滴注于普通瓊脂平板表面，每個(gè)梯度點(diǎn)種3個(gè)重復(fù)，待菌液被完全吸收后，倒置放于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h。次日，觀察平板上的菌落生長狀態(tài)，并采用傳統(tǒng)的人工計(jì)數(shù)。

1.6 微量滴注接種培養(yǎng)平板計(jì)數(shù)法與菌懸液吸光度值之間的相關(guān)性 取稀釋度為10-6的菌懸液作1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5稀釋，以無菌生理鹽水作對照，分光光度計(jì)測定波長600nm處的吸光度（OD600）值，同時(shí)取0.01mL菌懸液采用滴注接種培養(yǎng)法進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù)。記錄OD600值，稀釋倍數(shù)和相應(yīng)菌落數(shù)，并建立金黃色葡萄球菌菌懸液與吸光度值間的線性關(guān)系。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 7軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，通過Ordinary one-way ANOVA進(jìn)行組內(nèi)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種接種方法菌落特征的比較 培養(yǎng)相同時(shí)間后，傾注法接種培養(yǎng)的平板上菌落大小不一，位于瓊脂深層的菌落小且形態(tài)不規(guī)則，瓊脂表層的菌落大小一致，呈圓形凸起且色素明顯；菌落分布不均勻，部分菌落生長在培養(yǎng)基邊緣的深層（圖2A）。相比之下，微量法接種培養(yǎng)的平板上菌落大小一致，呈金黃色的圓形凸起且均勻分布于接種區(qū)域的瓊脂表面（圖2B）。

圖2 兩種接種方法培養(yǎng)細(xì)菌菌落形態(tài)

2.2 兩種接種方法培養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)的比較 細(xì)菌總數(shù)的計(jì)算公式分別按：N×稀釋倍數(shù)（傾注法）和N×稀釋倍數(shù)×100（微量法）計(jì)算，N為菌落個(gè)數(shù)。結(jié)果表明，隨著稀釋倍數(shù)的增加，兩種接種方法在10-6，10-7稀釋度時(shí)所統(tǒng)計(jì)的菌落個(gè)數(shù)呈遞減關(guān)系，10-8時(shí)的菌落數(shù)與10-7相比僅呈減少趨勢。而從不同稀釋度的細(xì)菌總數(shù)層面來講，微量接種法三個(gè)不同稀釋度所得的細(xì)菌總數(shù)在同一數(shù)量級，組內(nèi)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），傾注接種法記錄的三個(gè)不同稀釋度的細(xì)菌總數(shù)呈遞減趨勢且組內(nèi)統(tǒng)計(jì)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示與微量接種法相比，傾注接種法對細(xì)菌總數(shù)具有不穩(wěn)定性，這可能與菌落形態(tài)形成有一定關(guān)系。見表1。

表1 不同接種方式培養(yǎng)的細(xì)菌總數(shù)

2.3 菌懸液在600nm處的吸光度值與活菌數(shù)量之間的相關(guān)性 用GraphPad Prism 7軟件對獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，以微量法接種培養(yǎng)的計(jì)數(shù)結(jié)果為縱坐標(biāo)（Y，×108cfu/mL），對應(yīng)的菌液在600nm處的光密度值為橫坐標(biāo)（X），得出細(xì)菌濃度的線性回歸方程為Y＝7.996X+0.183，Pearson相關(guān)系數(shù)的平方為0.995，線性范圍為0.233～6.433（×108cfu/mL）。見圖3。

圖3 MRSA濃度與OD600值的線性關(guān)系

3 討論

近年來，MRSA引起院內(nèi)感染日益增多，由于MR－SA 的廣泛耐藥性，其感染后的治療問題已成為當(dāng)前臨床以及科學(xué)研究中的難題。在開展相關(guān)研究的實(shí)驗(yàn)（如造模時(shí)的攻毒劑量、感染模型中組織器官的細(xì)菌載量、固有免疫細(xì)胞中細(xì)菌的存活率等）中，需要進(jìn)行準(zhǔn)確細(xì)菌計(jì)數(shù)才能得到穩(wěn)定和可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。目前，平板菌落計(jì)數(shù)是微生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)、科研以及生產(chǎn)實(shí)踐中最常用的活菌總數(shù)測定方法，然而計(jì)數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確性與接種方法之間的關(guān)系一直備受關(guān)注［11-12］。此外，本實(shí)驗(yàn)以MRSA 為待測菌株，采用傾注法與微量法接種培養(yǎng)，從菌落形態(tài)、計(jì)數(shù)測定方式、計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性方面比較了兩種方法的差異，并使用光密度法探討了菌懸液的吸光度與細(xì)菌總量之間的相關(guān)性。

本研究對兩種接種方法培養(yǎng)的菌落形態(tài)進(jìn)行了比較。培養(yǎng)相同時(shí)間后，相比傾注法培養(yǎng)的菌落，微量法接種培養(yǎng)的菌落大小一致，形態(tài)均一，色素明顯，極易判斷是金黃色葡萄球菌。對于來源于肺泡灌洗液或肺組織勻漿液等標(biāo)本，如果采用傾注接種法培養(yǎng)細(xì)菌，很難從形態(tài)上判斷出感染細(xì)菌的類型，而微量滴注接種則具有顯著的優(yōu)勢。

本研究對細(xì)菌總數(shù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明微量法接種培養(yǎng)的細(xì)菌總數(shù)高于傾注法，盡管兩者在同一數(shù)量級，但具有兩倍的差異。在統(tǒng)計(jì)細(xì)菌總數(shù)時(shí)，借鑒并改進(jìn)了黃曉輝等［10］報(bào)道的方法。不僅使數(shù)據(jù)來源更加科學(xué)、可信，而且節(jié)省大量的人力、物力與時(shí)間［9］，拍照取樣只能統(tǒng)計(jì)平板底部的菌落，忽略了平板邊緣深層或深層與底部重疊的菌落，這可能是導(dǎo)致總數(shù)偏低的原因；另外，傾注法對瓊脂培養(yǎng)基溫度的控制是個(gè)難點(diǎn)，如果培養(yǎng)基溫度過高會影響細(xì)菌的存活，這也是導(dǎo)致細(xì)菌總數(shù)偏低的另一原因，因此該方法對操作者的技術(shù)要求相對較高。微量法接種培養(yǎng)的細(xì)菌，由于菌落生長在瓊脂的表面，在適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)下能清楚地?cái)?shù)出菌落個(gè)數(shù)，菌落粘連程度不大，計(jì)數(shù)結(jié)果比較穩(wěn)定，但是該接種方法對稀釋比例要求較高，如果稀釋倍數(shù)過低，會導(dǎo)致菌落粘連在一起，不易計(jì)數(shù)，如果稀釋倍數(shù)過高，有可能長不出菌落。在試劑和耗材的消耗方面，微量法優(yōu)于傾注接種法。一個(gè)瓊脂平板上，微量法可以同時(shí)檢測出6～9 個(gè)稀釋梯度的菌落數(shù)，節(jié)省了大量的培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿，減少了工作量，節(jié)省大量的時(shí)間，尤其是樣本量較大時(shí)。

有不少研究者通過光電比色法、酶聯(lián)免疫檢測儀、紫外－可見光分光光度［13-16，17］測定法對菌懸液的光密度值與細(xì)菌的數(shù)量之間的關(guān)系進(jìn)行了探討，發(fā)現(xiàn)兩者之間存在線性相關(guān)，然而這種相關(guān)性可能受細(xì)菌的種類、大小、色素等因素的影響。本研究結(jié)合微量法培養(yǎng)的細(xì)菌計(jì)數(shù)分析了MRSA 在OD600處的光密度值和活菌數(shù)量之間的線性關(guān)系。研究顯示，菌懸液的光密度值與細(xì)菌總數(shù)之間呈良好的線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)平方值為0.995。由此，可以通過線性回歸方程準(zhǔn)確地進(jìn)行細(xì)菌定量，提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。

本研究通過分析兩種不同的接種方法比較了對金黃色葡萄球菌活菌計(jì)數(shù)的差異。微量滴注法具有操作簡便，省時(shí)省力、上樣量少、節(jié)省實(shí)驗(yàn)耗材，且計(jì)數(shù)結(jié)果準(zhǔn)確性高和重現(xiàn)性好等優(yōu)勢。同時(shí)可采用相應(yīng)的回歸方程精確地進(jìn)行細(xì)菌定量，縮短實(shí)驗(yàn)周期，增加實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性。