劉 蘭，李 鵬，王 通，黃筱萍

(江西省科學(xué)院微生物研究所，330096 ，南昌)

0 引言

衣康酸學(xué)名為甲叉琥珀酸、亞甲基丁二酸，是世界上第五大有機(jī)酸，并被美國(guó)能源部選為 12 種可從糖平臺(tái)技術(shù)生物制備的最具開發(fā)和應(yīng)用潛力的生物精煉高附加值產(chǎn)品之一[1-2]。衣康酸生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成、檸檬酸分解法及微生物發(fā)酵法，而其中的微生物發(fā)酵法生產(chǎn)衣康酸基本以淀粉糖為發(fā)酵原料，占用了大量的糧食資源，給人類造成了糧食危機(jī)。Mass[3]指出利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)有機(jī)酸等大宗化學(xué)品是未來的主要發(fā)展方向。我國(guó)每年產(chǎn)生大量農(nóng)業(yè)秸稈，農(nóng)業(yè)秸桿中的纖維素和半纖維素，水解產(chǎn)物主要是葡萄糖和木糖，木糖在水解液中含量?jī)H次于葡萄糖，最多可達(dá)31%[4-6]，可用于發(fā)酵生產(chǎn)衣康酸。目前報(bào)道的研究中，利用葡萄糖發(fā)酵生產(chǎn)衣康酸已經(jīng)達(dá)到較高水平[7-11]，而有關(guān)木糖發(fā)酵衣康酸的報(bào)道較少。Saha[12]報(bào)道了部分土曲霉菌種可利用木糖產(chǎn)衣康酸，產(chǎn)酸率30 g/L左右。2016年，孫婷[13]研究土曲霉菌種利用小麥麩水解糖(葡萄糖和木糖)發(fā)酵衣康酸達(dá)49.65±0.43 g/L。楊靜[14]開展了玉米芯和麩皮進(jìn)行衣康酸發(fā)酵研究，產(chǎn)率均不高。因此，選育高效利用木糖的適宜菌株是實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)秸稈生產(chǎn)衣康酸的前提基礎(chǔ)，對(duì)利用農(nóng)業(yè)秸稈纖維質(zhì)原料發(fā)酵生產(chǎn)衣康酸有著重要的意義。

本研究利用前期工作中篩選到的1株可利用木糖產(chǎn)衣康酸的土曲霉菌株(Aspergillusterreus)ASP-046為出發(fā)菌株，采用紫外誘變方法[15]，篩選了高效利用木糖產(chǎn)衣康酸的發(fā)酵菌株。然后，通過Plackett-Burman試驗(yàn)和Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)法[16-17]優(yōu)化土曲霉發(fā)酵培養(yǎng)條件，探索初始pH、發(fā)酵溫度、接種量、裝液量、搖床轉(zhuǎn)速、發(fā)酵時(shí)間多因素間的相互作用，確定衣康酸發(fā)酵最佳培養(yǎng)條件，提高衣康酸產(chǎn)量，為利用秸稈糖產(chǎn)衣康酸提供優(yōu)良菌株及技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)菌種 土曲霉菌種AspergillusterreusASP-046，本實(shí)驗(yàn)室篩選保藏。

1.1.2 試劑 衣康酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度99%)：美國(guó)SIGMA公司；木糖：濟(jì)南圣泉唐和生物科技有限公司，純度99.5%；玉米漿：CAS 66071-94-1阿拉?。黄渌噭┚鶃碜陨ど锕こ?上海)股份有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基(g/L)：木糖20.0，氯化鈉20.0，玉米漿4.0，瓊脂粉20.0，定容至1 L，pH 6.8。

種子培養(yǎng)基(g/L)：木糖50.0，硝酸銨(NH4NO3)5.0，七水硫酸鎂(MgSO4·7H2O)2.0，玉米漿1.2，定容至1 L， pH 3.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：木糖110.0，硝酸銨(NH4NO3)4.0，七水硫酸鎂(MgSO4·7H2O)1.0，玉米漿0.8，磷酸二氫鉀(KH2PO4)0.06，五水硫酸銅(CuSO4·5H2O)0.06，定容至1 L， pH 3.0。

指示劑培養(yǎng)基(g/L)：木糖80.0，硝酸銨(NH4NO3)4.0，七水硫酸鎂(MgSO4·7H2O)1.0，玉米漿0.8，磷酸二氫鉀(KH2PO4)0.06，瓊脂粉20.0，0.2%溴甲酚綠溶液(稱取0.5g溴甲酚綠溶于250 mL20%的乙醇溶液中即得)50 mL/L，pH 6.8。

1.2 儀器與設(shè)備

美國(guó)Waters公司e2695 Alliance高效液相色譜儀(配置2414示差檢測(cè)器)； 德國(guó)賽多利斯Sartorius practum 224-ICN分析天平；湖南湘儀高速離心機(jī)H1650-W；上海智城恒溫培養(yǎng)振蕩器ZWY-2102C；上海博迅生化培養(yǎng)箱SPX-250B-Z；北京賽百奧科技有限公司UV-Ⅷ紫外誘變箱；TOSOH Tskgel OApak-P+OApak-A(300 mm×7.8 mm，5 μm)色譜柱。

1.3 方法

1.3.1 檢測(cè)方法 發(fā)酵液于10 000 r/min離心10 min；取上清液，稀釋，用0.22 μm聚醚水性濾膜過濾，采用Waters e2695 Alliance高效液相色譜分離單元和Waters 2414示差檢測(cè)器進(jìn)行分析。

色譜條件：色譜柱TOSOH Tskgel OApak-P+OApak-A(300 mm×7.8 mm、5 μm)；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL；流速：1.0 mL/min；流動(dòng)相：0.75 mmol/L H2SO4；測(cè)定發(fā)酵液中衣康酸和殘?zhí)呛俊?/p>

1.3.2 誘變方法 單孢子懸液的制備：用無菌水洗脫培養(yǎng)5 d的斜面孢子，接入種子培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)至孢子剛萌芽(約6 h)，移入裝有玻璃珠及無菌水的三角瓶中，振蕩打碎孢子團(tuán)塊，然后用無菌脫脂棉過濾，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整孢子數(shù)約1×106個(gè)/mL。

紫外誘變：吸取單孢子懸液5 mL放置于磁力攪拌上的培養(yǎng)皿中，254 nm紫外燈下，距離20 cm，分別照射0 s、40 s、80 s、160 s、200 s和240 s，邊攪拌邊照射，完畢后立即在紅外線燈光下，將孢子液稀釋涂平板(指示劑培養(yǎng)基)，用黑布包好，放置30 ℃恒溫培養(yǎng)3—5 d，計(jì)算致死率。選取致死率70%～80%的紫外誘變劑量，反復(fù)誘變，挑選生長(zhǎng)快、變色圈與菌落直徑比大的單菌落，接入斜面培養(yǎng)。

搖瓶篩選：突變菌株經(jīng)斜面30 ℃恒溫培養(yǎng)4—5 d后，用無菌水洗脫斜面孢子(孢子數(shù)約×108)，接入到種子培養(yǎng)基中，于30 ℃，170 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。按8%接種量接種于搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中(250 mL三角瓶，裝液量40 mL)，32 ℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)6 d，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定衣康酸和殘?zhí)?。根?jù)產(chǎn)酸量及殘?zhí)?，?jì)算糖酸轉(zhuǎn)化率，篩選出優(yōu)良的突變株。糖酸轉(zhuǎn)化率按式(1)計(jì)算：

(1)

突變株穩(wěn)定性考察：選取產(chǎn)酸高的突變株進(jìn)行傳代穩(wěn)定性試驗(yàn)，連續(xù)傳代6次，測(cè)定產(chǎn)酸能力。

1.3.3 不同碳源利用考察試驗(yàn) 挑選誘變后產(chǎn)酸高且穩(wěn)定性好的土曲霉菌株ASP-M-87，分別加入濃度為110 g/L的葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、蔗糖、果糖、乳糖，其他成分不變，考察不同碳源對(duì)衣康酸產(chǎn)量的影響。另外，考察了葡萄糖及木糖不同配比起始濃度對(duì)衣康酸產(chǎn)量的影響。

1.3.4 單因素試驗(yàn) 以土曲霉菌株ASP-M-87，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)條件單因素試驗(yàn)。選取了土曲霉發(fā)酵過程中培養(yǎng)基初始pH、接種量、培養(yǎng)溫度、裝液量、搖床轉(zhuǎn)速5個(gè)單因素，分別設(shè)置不同梯度，通過測(cè)定衣康酸含量，確定各因素最適水平。

1.3.5 Plackett-Burman(PB)試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Design-Expert 8.0.6軟件的Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)從培養(yǎng)基初始pH、裝液量、培養(yǎng)溫度、接種量、搖床轉(zhuǎn)速以及培養(yǎng)時(shí)間6個(gè)因素中篩選對(duì)衣康酸產(chǎn)量影響顯著的因素。每組3個(gè)平行試驗(yàn)，培養(yǎng)結(jié)束后檢測(cè)衣康酸含量。PB試驗(yàn)因素及水平表見表1。

1.3.6 最陡爬坡試驗(yàn) 根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)影響顯著的各因素效應(yīng)值的大小確定變化的步長(zhǎng)，正效應(yīng)取高水平，負(fù)效應(yīng)取低水平。

表1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)因素水平表

按一定的梯度增加或者減少各因素的水平值，檢測(cè)發(fā)酵液中衣康酸含量的變化，含量最高組的水平值即為響應(yīng)面分析的中心組。

1.3.7 Box-Behnken(BB)響應(yīng)面試驗(yàn) 以最陡爬坡試驗(yàn)篩選出的含量最高組的水平值作為中心點(diǎn)，采用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以Plackett-Burman試驗(yàn)確定的3個(gè)顯著因素為自變量，衣康酸含量為響應(yīng)值，進(jìn)行3因素3水平試驗(yàn)，運(yùn)用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合，得到響應(yīng)值擬合方程，并對(duì)方程進(jìn)行方差分析和可靠性分析，得到最大響應(yīng)值的各因素的最佳水平值，得出最佳的發(fā)酵培養(yǎng)條件。響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平表見表2。

表2 Box-Behnken 設(shè)計(jì)因素水平表

1.3.8 驗(yàn)證試驗(yàn) 用響應(yīng)面試驗(yàn)得出的最佳培養(yǎng)條件進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，取平均值，以驗(yàn)證響應(yīng)面結(jié)果是否可靠，從而確定最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)條件。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外線誘變

2.1.1 紫外誘變時(shí)間的確定 將照射0 s、40 s、80 s、160 s、200 s和240 s后的單孢子懸液，涂布木糖為唯一碳源的平板，30 ℃培養(yǎng)3—5 d 后計(jì)數(shù)菌落，計(jì)算各個(gè)誘變時(shí)間的致死率，結(jié)果見圖1。由圖1可知，照射時(shí)間160 s后，土曲霉ASP-046的致死率逐漸增大，均大于70%。研究表明：紫外誘變致死率70%～80%的突變率最高[15]，因此選取紫外誘變時(shí)間為160 s。

圖1 紫外誘變致死率曲線

2.1.2 紫外誘變結(jié)果 土曲霉菌株ASP-046孢子懸液紫外誘變160 s，涂布指示劑培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)5 d，從中選出了100株變色圈與菌落直徑比較大的菌株，進(jìn)行搖瓶初篩和復(fù)篩試驗(yàn)，其中10株的產(chǎn)酸量明顯提高，結(jié)果見表3。

表3 紫外誘變的搖瓶發(fā)酵結(jié)果

從表3結(jié)果看出，菌株ASP-M-67、ASP-M-87復(fù)篩產(chǎn)酸后產(chǎn)量仍然較高，分別為42.54 g/L和43.28 g/L。較出發(fā)菌株(20.34 g/L)提高了109.14%和112.78%。

2.1.3 突變菌株ASP-M-87穩(wěn)定性考察 對(duì)突變土曲霉菌株ASP-M-87連續(xù)培養(yǎng)6代，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)，產(chǎn)酸量結(jié)果分別為：43.28 g/L、43.12 g/L、43.09 g/L、43.01 g/L、42.98 g/L、42.89 g/L，產(chǎn)酸量幾乎無變化 ，說明土曲霉菌株ASP-M-87有較好的穩(wěn)定性。

2.2 不同碳源利用考察試驗(yàn)

分別以葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、蔗糖、果糖、乳糖以及葡萄糖和木糖不同比例為碳源，考察了誘變菌株ASP-M-87對(duì)不同碳源的利用情況。表4結(jié)果顯示：該菌株不利用果糖、乳糖；能轉(zhuǎn)化葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖和蔗糖。在糖濃度110 g/L的情況下，葡萄糖產(chǎn)酸最高、其次蔗糖、甘露糖、木糖和阿拉伯糖。表5結(jié)果顯示：不同比例的葡萄糖及木糖為碳源混合發(fā)酵時(shí)，葡萄糖比例高，產(chǎn)酸高，而且該菌株先轉(zhuǎn)化葡萄糖，再轉(zhuǎn)化木糖。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[18]：木糖的跨膜運(yùn)輸存在兩種不同的運(yùn)輸系統(tǒng)，低親和力運(yùn)輸系統(tǒng)為木糖和葡萄糖共享，不被葡萄糖抑制；高親和力則通過葡萄糖運(yùn)輸因子HXT4、HXT5、HXT7和Gal2介導(dǎo)進(jìn)行的，葡萄糖的存在，可能影響到了發(fā)酵菌株對(duì)木糖的優(yōu)先利用。

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果

以木糖為碳源，進(jìn)行了不同因素對(duì)衣康酸產(chǎn)量影響試驗(yàn)，結(jié)果見表6。發(fā)酵過程中培養(yǎng)基的pH值是一項(xiàng)重要的發(fā)酵參數(shù)，對(duì)菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成有很大的影響，pH值的變化會(huì)引起酶活力的改變，影響菌體對(duì)基質(zhì)的利用速度和細(xì)胞結(jié)構(gòu)，以致于影響菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成，因此確定發(fā)酵過程的最適pH值是保證或提高產(chǎn)量的重要環(huán)節(jié)。從表6中可知，pH為1.7時(shí)，幾乎不產(chǎn)酸，pH為2.0～5.0，產(chǎn)酸幾乎相當(dāng)；在發(fā)酵過程中溫度也是保證衣康酸發(fā)酵正常進(jìn)行的重要條件之一，因?yàn)闇囟仁潜ＷC酶活性的重要條件，并可以影響基質(zhì)和氧在發(fā)酵液中溶解和傳遞速率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ASP-M-87的適宜發(fā)酵溫度為35 ℃，超過39 ℃，幾乎不產(chǎn)酸。接種量以8%～10%的比例較好，接種量太低時(shí)，由于長(zhǎng)菌時(shí)間過長(zhǎng)，延長(zhǎng)了發(fā)酵周期，后期菌種活力下降，產(chǎn)酸率下降；高于10%時(shí)，接入的老菌絲比例高，菌種活力低，發(fā)酵產(chǎn)酸率降低。土曲霉屬于好氧微生物，溶解氧是衣康酸發(fā)酵非常重要的一個(gè)影響因素，適當(dāng)?shù)娜芙庋蹙S持其呼吸和代謝產(chǎn)物的合成，氧的不足會(huì)造成代謝異常，產(chǎn)量下降。當(dāng)裝液量20～40 mL/250mL三角瓶時(shí)，產(chǎn)酸量相當(dāng)；當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速?gòu)?00 r/min增加至300 r/min時(shí)，產(chǎn)酸量逐步增加后稍下降，顯示250 r/min左右時(shí)較佳。

表4 不同碳源產(chǎn)衣康酸試驗(yàn)結(jié)果

表5 葡萄糖與木糖不同比例產(chǎn)衣康酸結(jié)果

表6 不同因素對(duì)衣康酸產(chǎn)量的影響

2.4 Plackett-Burman試驗(yàn)顯著因子篩選

Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果見表7，利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表7的結(jié)果進(jìn)行回歸方差分析，得到各因素的偏回歸系數(shù)和影響顯著性見表8。從表8可知，培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速對(duì)衣康酸產(chǎn)量影響極顯著(P均小于0.01)，其次影響為接種量，因此確定培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速以及接種量作為下一步進(jìn)行爬坡試驗(yàn)的關(guān)鍵因素。其他因素的取值可以根據(jù)各因素效應(yīng)的正負(fù)和大小，正效應(yīng)的因素取較高值，負(fù)效應(yīng)的因素取較低值。

2.5 最陡爬坡試驗(yàn)

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果及顯著因子分析結(jié)果，選取了培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速、接種量進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表9。

表7 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表8 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)影響因素顯著性及效應(yīng)分析

從表9可知，第3組發(fā)酵培養(yǎng)條件對(duì)應(yīng)的衣康酸產(chǎn)量最高，因此以培養(yǎng)溫度35 ℃、搖床轉(zhuǎn)速260 r/min、接種量10%v/v 作為中心點(diǎn)，進(jìn)行下一步響應(yīng)面試驗(yàn)分析。

表9 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.6 Box-Behnken試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)條件

以衣康酸濃度(Y)為響應(yīng)值，選取培養(yǎng)溫度(A)、搖床轉(zhuǎn)速(B)以及接種量(C)3個(gè)因素進(jìn)行了三因素三水平的Box-Behnken試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表10。

利用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)表10試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次回歸分析，得二次多項(xiàng)式回歸模型方程：Y=60.48+6.64A-2.27B+0.95C-0.96AB-6.58AC-0.11BC-15.65A2-3.79B2-7.49C2。

表10 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

方差分析中，F(xiàn)值反映各因素對(duì)響應(yīng)值衣康酸濃度的影響強(qiáng)度，數(shù)值越大，影響越大， A>B>C，即溫度>搖床轉(zhuǎn)速 >接種量。各因素交互作用響應(yīng)面曲線圖見圖2、圖3以及圖4。通過Design Expert 8.0.6軟件分析得到最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度35.69 ℃、搖床轉(zhuǎn)速246.95 r/min、接種量9.83%v/v，衣康酸濃度的理論預(yù)測(cè)值為61.599 g/L。

表11 回歸模型方差分析

圖2 溫度和搖床轉(zhuǎn)速的交互影響衣康酸產(chǎn)量的響應(yīng)面圖

圖3 溫度和接種量的交互影響衣康酸產(chǎn)量的響應(yīng)面圖

2.7 最佳搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件驗(yàn)證

在預(yù)測(cè)的最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件的基礎(chǔ)上，考慮到實(shí)際操作簡(jiǎn)便的需要，將該條件修正為：培養(yǎng)溫度36 ℃、搖床轉(zhuǎn)速247 r/min、接種量為9.8%，在此工藝條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果平均值為61.21 g/L，預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值較相近。這說明二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型進(jìn)行優(yōu)化符合設(shè)計(jì)目標(biāo)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)學(xué)模型具有可靠性和準(zhǔn)確性。

圖4 搖床轉(zhuǎn)速和接種量的交互影響衣康酸產(chǎn)量的響應(yīng)面圖

3 結(jié)論

1)以土曲霉(Aspergillusterreus)ASP-56為出發(fā)菌株，采用紫外誘變，選育出了較出發(fā)菌株(20.34 g/L)顯著提高的菌株，編號(hào)為ASP-M-87，該菌株以木糖為碳源，產(chǎn)酸量達(dá)43.28 g/L，比出發(fā)菌株提高了 112.78%。菌株連續(xù)傳代6次，遺傳穩(wěn)定性良好，且利用碳源廣譜，可利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖以及甘露糖等秸稈糖。該菌株的獲得可為進(jìn)一步利用秸稈糖產(chǎn)衣康酸研究提供菌種資源。

2)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)、最陡爬坡試驗(yàn)和Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化土曲霉ASP-M-87搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件，優(yōu)化后的培養(yǎng)條件為：pH2.5、溫度36 ℃、轉(zhuǎn)速247 r/min、接種量9.8%(V/V)、裝液量30 mL/250mL三角瓶、發(fā)酵時(shí)間144 h，衣康酸產(chǎn)量達(dá)61.21 g/L，木糖轉(zhuǎn)化率達(dá)56.89%，比優(yōu)化前(43.28 g/L)提高了41.43%。此研究結(jié)果可為衣康酸發(fā)酵工藝提供技術(shù)支持。