鐘浩杰，姚新奎,2，羅鵬輝，孟 軍,2，姚岳揚(yáng)，王川坤，任萬路

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.新疆馬繁育與運(yùn)動生理重點實驗室/新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)馬產(chǎn)業(yè)研究院，烏魯木齊 830052；3.新疆維吾爾自治區(qū)畜牧總站，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】代謝組學(xué)可以系統(tǒng)、高效、全面的反映動物機(jī)體對復(fù)雜營養(yǎng)物質(zhì)的代謝過程，是一種非常適合研究營養(yǎng)與代謝復(fù)雜關(guān)系的方法[1]。代謝組學(xué)利用先進(jìn)的分析化學(xué)技術(shù)更系統(tǒng)、更全面的檢測血液、尿液或糞便中的小分子代謝物。生物醫(yī)學(xué)科學(xué)樣本包括組織或組織提取物以及生物液體[2]。糞便中大量的化合物直觀的展現(xiàn)了消化道以及不同空間的菌群對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收的過程。識別飲食改變引起的細(xì)微代謝變化，使用更綜合的方法全面的分析糞便代謝物，對獲得更多馬匹消化、吸收和代謝的相關(guān)信息具有重大意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】發(fā)酵工藝已被廣泛用于提高豆粕的營養(yǎng)物質(zhì)的生物利用度[3]和降低抗?fàn)I養(yǎng)因子的水平[4]。Frias等[5]也證實了發(fā)酵過程能夠降解SBM的抗?fàn)I養(yǎng)和致敏物質(zhì)。Wang等[6]、Espinosa等[7]研究發(fā)現(xiàn)，仔豬飼糧中添加發(fā)酵豆粕對氨基酸消化率、代謝能、表觀回腸消化率均無顯著影響，但可以顯著改善斷奶后的生長性能。吳丹丹等[8]研究表明，奶牛飼糧中添加100g/d小肽能顯著提高微生物蛋白產(chǎn)量，有效提高氮的消化利用率和沉積效率，減少氮排放，提高奶牛生長性能。Feng等[9]研究發(fā)現(xiàn)，相比于普通豆粕，發(fā)酵豆粕可以顯著提高肉雞腸道中胰蛋白酶、脂肪酶和蛋白酶活性，提高空腸黏膜絨毛高度，降低隱窩深度。【本研究切入點】發(fā)酵豆粕在牛、羊、豬、雞以及水產(chǎn)等動物營養(yǎng)研究中獲得了相應(yīng)的研究成果，但是在馬匹上的研究鮮見報道。需研究補(bǔ)喂發(fā)酵豆粕對伊犁馬駒糞便代謝物的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問題】基于UPLC-MS/MS檢測方法以及多元統(tǒng)計分析，研究補(bǔ)喂發(fā)酵豆粕對伊犁馬駒糞便代謝物的影響，從分子水平分析發(fā)酵豆粕對伊犁馬駒代謝的影響機(jī)制，為伊犁馬駒專用飼料的研究與開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 馬 匹

試驗于2021年5月至2021年10月在昌吉良源農(nóng)牧業(yè)發(fā)展有限公司馬場進(jìn)行，選取10匹體況相近、無消化系統(tǒng)疾病病史的12月齡伊犁馬駒，隨機(jī)分為兩組，每組5匹馬。對照組和試驗組分別在干草和普通精飼料的基礎(chǔ)上添加5%的普通豆粕和5%的發(fā)酵豆粕。分別飼于不同圈舍，預(yù)飼7 d，試驗期為56 d，整個試驗過程中，所有馬均為舍飼，墊料選取清潔干燥的木屑，每天分3次給料，自由飲水和舔食舔磚。

1.1.2 基礎(chǔ)飼料

試驗所用發(fā)酵豆粕由新疆酵博仕生物科技有限公司生產(chǎn)，菌種為植物乳酸桿菌、地衣芽孢桿菌、釀酒酵母等。試驗過程中，所有試驗馬匹每天飼喂干草(1.5 kg/100 kg體重)，每天按照每匹馬駒體重的1%飼喂精飼料。表1

1.1.3 樣品采集

試驗56 d無菌采集試驗馬匹直腸糞便，所有用于非靶向代謝組學(xué)分析的樣品均收集在5 mL無菌凍存管中，樣品立即放入液氮中儲存，直到糞便代謝產(chǎn)物的提取。

1.1.4 儀器與試劑

(1)質(zhì)譜：四級桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀(Thermo Fisher Scientific)；

(2)色譜：超高效液相色譜系統(tǒng)(Dionex)；

(3)離心機(jī)(Thermo Fisher Scientific)；

(4)色譜柱：Waters, ACQUITY UPLC BEH Amide 1.7 μm，2.1 mm×100 mm column；

(5)試劑：乙腈、乙酸銨、甲醇等。

1.2 方 法

1.2.1 代謝物提取

稱取100 mg糞便樣本，將甲醇、乙腈和水按4∶4∶2的比例混勻，預(yù)冷后取400 μL加入糞便樣本中，充分混勻，-20℃靜置60 min，離心機(jī)調(diào)至4℃離心20 min，將上清液進(jìn)行干燥處理，乙腈和水按1∶1的比例混勻，取100 μL加入上述經(jīng)過干燥處理的容器中再次溶解提取到的代謝物，混勻后 4℃離心15 min，取2 μL上清液質(zhì)譜分析。

表1 試驗日糧組成及營養(yǎng)水平

1.2.2 LC-MS/MS

(1)色譜條件

采用 ACQUITY UPLC BEH C18柱進(jìn)行色譜分離，色譜柱柱溫為40℃，流速為 0.3 mL/min。對代謝物進(jìn)行不同梯度脫洗。個樣品檢測量為5 μL。分析過程中樣品始終處于4℃環(huán)境中。采用隨機(jī)分析。將設(shè)置好的QC樣品置于各樣品間依次檢測。

(2) 質(zhì)譜條件

各組樣品將在正、負(fù)電場兩種環(huán)境下檢測，經(jīng)UHPLC分離后用四級桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Compound Discoverer 3.0軟件對質(zhì)譜條件下獲得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行峰提取、峰對齊、峰校正、標(biāo)準(zhǔn)化等處理。輸出由樣本名稱、譜峰信息、及峰面積組成的三維數(shù)據(jù)矩陣。采用二級譜圖匹配和精確質(zhì)量數(shù)匹配的方式對化合物分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，與數(shù)據(jù)庫比對。數(shù)據(jù)經(jīng)Pareto-scaling預(yù)處理后，進(jìn)行PCA和OPLS-DA分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 QC樣本總離子流圖譜比較

研究表明，各色譜峰保留時間和峰響應(yīng)強(qiáng)度均波動小，在實驗過程中儀器誤差引起的變異較小。圖1

2.2 正、負(fù)離子模式PCA模式下數(shù)據(jù)分離趨勢

說明2組樣品在代謝物組成上有明顯差異。圖2

圖1 QC樣本TIC圖譜

a：對照組Control group b：試驗組Experimental group

2.3 POLS-DA分析

研究表明，在正、負(fù)離子模式下的POLS-DA置換檢驗，各組Q2均小于0.05，沒有過度擬合。表2，圖4

a：對照組Control group b：試驗組Experimental group

圖4 正(a)、負(fù)(b)離子模式OPLS-DA得分比較

表2 OPLS-DA模型評價參數(shù)

2.4 差異代謝物篩選對比

研究表明，在試驗組與對照組的對比中，共篩選出211種差異代謝物，其中130種代謝物上調(diào)，181種代謝物下調(diào)。圖5

圖5 正(a)、負(fù)(b)離子模式火山對比

試驗組和對照組的對比中，共篩選出顯著性差異代謝物9種，添加5%的發(fā)酵豆粕顯著提高了馬駒糞便中果糖基甘氨酸、甜菜堿、甘露醇等物質(zhì)的含量(P<0.05)，顯著降低了高香草酸、丙酮酸、苯乙醇、煙酸和對羥苯基乙醇的含量(P<0.05)。 表3

2.5 差異代謝物聚類對比

研究表明，正、負(fù)離子模式下分別有4個和5個簇，正離子熱圖中的簇1、簇2在對照組中分布最多，在試驗組的部分個體中少量分布；簇3和簇4在試驗組中的分布明顯高于對照組。負(fù)離子熱圖中的簇1、簇2在對照組中分布最多，而簇3、簇4、簇5集中分布在試驗組。圖6

表3 試驗組與對照組之間顯著性差異代謝物

圖6 正(a)、負(fù)(b)離子模式聚類熱圖

2.6 糞便差異代謝物KEGG通路對比

研究表明，試驗組與對照組兩組間差異顯著的代謝通路，主要包括在甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝(Glycine, serine and threonine metabolism)、酪氨酸代謝(Tyrosine metabolism)、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ABC transporters)、苯丙氨酸代謝(Phenylalanine metabolism)、百日咳(Pertussis)、多巴胺能突觸(Dopaminergic synapse)、胰島素分泌(Insulin secretion)、HIF-1信號通路(HIF-1 signaling pathway)煙酸和煙酰胺代謝(Nicotinate and nicotinamide metabolism)等通路。圖7

圖7 試驗組與對照組糞便代謝通路

3 討 論

Escalona等[10]研究，將核磁共振代謝組學(xué)分析應(yīng)用于不同種類的馬生物樣本，并且生成了一份“代謝物圖譜”，其中包含了在普通馬體液中識別出的所有代謝物。糞便和尿液代謝譜有助于解釋宿主和微生物的相互作用，而血漿代謝組可以推斷宿主的生理機(jī)能。自Escalona等[10]將核磁共振代謝組學(xué)分析應(yīng)用于不同種類的體液樣本以來，NMR代謝組學(xué)被進(jìn)一步應(yīng)用于馬的生物體液，包括滑液[11]、尿囊液[12]和氣管沖洗液[13]。

甜菜堿又稱三甲基甘氨酸，甜菜堿最初在甜菜中被分離出來，該物質(zhì)具有多種生理活性，目前已作為一種飼料添加劑，應(yīng)用于各種畜禽養(yǎng)殖中。甜菜堿的滲透作用能夠調(diào)節(jié)動物體內(nèi)滲透壓，提高血清中生長激素水平，促進(jìn)動物生長；具有改善胴體成分、提高肉品質(zhì)等功效[14,15]。除了作為滲透性物質(zhì)的作用外，其代謝作用已被證明在保護(hù)肝臟和其他組織以及減輕心血管危險因素方面具有重要作用。甜菜堿被認(rèn)為是預(yù)防慢性疾病的重要營養(yǎng)物質(zhì)[16]。甜菜堿是動物機(jī)體內(nèi)重要的甲基供體，促進(jìn)脂肪分解，抑制脂肪合成[17]。賀紹君等[18]研究發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激狀態(tài)下，在基礎(chǔ)飼糧中添加甜菜堿可改善AA肉雞生長性能，提高十二指腸消化酶的活性，維持盲腸內(nèi)微生物區(qū)系平衡，從而減輕熱應(yīng)激對肉雞的危害。研究通過添加5%的發(fā)酵豆粕顯著提高了伊犁馬駒糞便中的甜菜堿、甘露醇、果糖基甘氨酸等物質(zhì)的含量，并參與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝通路，說明飼料中添加5%的發(fā)酵豆粕能夠調(diào)節(jié)伊犁馬駒滲透壓以及脂肪、蛋白質(zhì)和氨基酸代謝，并具有改善飼料適口性、抗應(yīng)激和轉(zhuǎn)甲基等作用。

煙酸又稱尼克酸，是動物必須維生素之一，廣泛分布于動植物種[19]。煙酸作為輔酶Ⅰ(NAD)和輔酶Ⅱ(NADP)的前體，既在機(jī)體碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪代謝中扮演著重要的角色，又能參與體內(nèi)能量代謝的調(diào)節(jié)[20,21]。具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[22]、緩解應(yīng)激等多種生物學(xué)功能。試驗中，試驗組煙酸含量顯著高于對照組，通過煙酸代謝通路調(diào)節(jié)維生素代謝，飼糧中添加5%的發(fā)酵豆粕能夠調(diào)節(jié)伊犁馬駒碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪代謝，并且具有抗炎、抗氧化、緩解應(yīng)激等功能。

4 結(jié) 論

飼料中添加5%的發(fā)酵豆粕顯著提高了伊犁馬駒糞便中甜菜堿、果糖基甘氨酸、甘露醇和煙酸等物質(zhì)的含量，根據(jù)不同代謝產(chǎn)物在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮的生理功能可知補(bǔ)喂發(fā)酵豆粕能夠調(diào)節(jié)伊犁馬駒碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪和氨基酸代謝，并且具有抗氧化、抗炎、緩解應(yīng)激、調(diào)節(jié)滲透壓等多種生物學(xué)功能。

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