吳金秋，張 沖，孟 軍,3，曾亞琦,3，加娜爾·努爾頓，王川坤，袁鑫鑫，王彤亮，姚新奎,3

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)馬產(chǎn)業(yè)研究院，烏魯木齊 830052；3.新疆馬繁育與運(yùn)動(dòng)生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830052；4.新疆伊犁哈薩克自治州昭蘇馬場(chǎng)，新疆昭蘇 835000)

0 引 言

【研究意義】運(yùn)動(dòng)型伊犁馬在國(guó)內(nèi)賽事中提高了國(guó)產(chǎn)馬的核心競(jìng)爭(zhēng)力[1]。三磷酸腺苷是肌肉收縮的直接能量來(lái)源，高強(qiáng)度體育鍛煉需要大量的三磷酸腺苷。通過(guò)無(wú)氧呼吸可以快速產(chǎn)生能量，將乳酸和氫離子釋放到肌肉中。這些離子的積累導(dǎo)致酸中毒和疲勞[2-3]，導(dǎo)致肌肉性能下降[4]。紅細(xì)胞膜中存在的單羧酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白同工型1(MCT1，Monocarboxylate transporters1)是將乳酸和氫離子從血漿轉(zhuǎn)運(yùn)到紅細(xì)胞的關(guān)鍵。肌肉和血漿之間產(chǎn)生的梯度有助于維持酸/堿平衡并延遲肌肉疲勞。單羧酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1T等位基因與紅細(xì)胞乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)率降低有關(guān)[5]。當(dāng)運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度超過(guò)乳酸鹽閾值時(shí)，乳酸鹽的產(chǎn)生大于其清除，導(dǎo)致肌肉細(xì)胞中乳酸鹽的積累。馬匹的速度性能直接影響著馬匹的競(jìng)技性能和價(jià)值。MCT1基因突變是影響馬匹速度性能的遺傳因素之一，從分子水平上尋找決定伊犁馬速度運(yùn)動(dòng)性能的功能基因，根據(jù)運(yùn)動(dòng)特性的不同而進(jìn)行精準(zhǔn)的選材，能夠更好的發(fā)揮運(yùn)動(dòng)性能的優(yōu)勢(shì)，在比賽中獲取更好的成績(jī)?；蚨鄳B(tài)性能夠體現(xiàn)馬匹運(yùn)動(dòng)性能，開(kāi)展對(duì)提高伊犁馬早期選育研究具有實(shí)踐意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】運(yùn)動(dòng)性能是一種復(fù)雜的表型，受到多種環(huán)境和遺傳因素的影響等[6-7]。MCT1的關(guān)鍵生理學(xué)作用是從循環(huán)中吸收乳酸，而MCT4似乎更適合于輔助血液循環(huán)。MCT1基因可能與精英運(yùn)動(dòng)員的表現(xiàn)有關(guān)[8]。有20多個(gè)核苷酸多態(tài)性與運(yùn)動(dòng)性能有關(guān)[9]。Bickham等[10]對(duì)7名中長(zhǎng)跑運(yùn)動(dòng)員進(jìn)行了為期6周的短跑訓(xùn)練，訓(xùn)練后MCT1顯著增加，MCT4沒(méi)有增加，MCT1對(duì)于成績(jī)具有一定的影響。MCT1與運(yùn)動(dòng)員存在一定的關(guān)聯(lián)性。Gurgul等[11]研究表明MCT1基因通過(guò)控制阿拉伯馬在速度賽中的乳酸代謝與運(yùn)動(dòng)適應(yīng)性之間存在顯著關(guān)聯(lián)性。Sawczuk等[12]研究發(fā)現(xiàn)MCT1T等位基因與隱性遺傳模型中的短跑力量表現(xiàn)相關(guān)，并且與兩個(gè)對(duì)照組相比，短跑力量運(yùn)動(dòng)員中TT基因型更為普遍，MCT1基因中TT基因型是影響運(yùn)動(dòng)成績(jī)的基因型之一?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前在伊犁馬中基因多態(tài)性與速度性能的關(guān)聯(lián)性研究相對(duì)較少，影響馬匹運(yùn)動(dòng)性能的因素包括環(huán)境因素和遺傳因素。將分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用到伊犁馬的選擇與培育，能夠在一定程度上加快速度馬的選育?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】從基因?qū)用娣治鲆晾珩RMCT1基因多態(tài)性與其速度性能的關(guān)聯(lián)性，篩選出有利于伊犁馬比賽速度的分子標(biāo)記位點(diǎn)，為伊犁馬早期選育提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 馬 匹

選取2019～2021年新疆中華民族大賽馬參加2 000 m速度賽的2歲伊犁馬50匹，其中公馬和母馬各25匹，使用EDTA抗凝真空采血管，左側(cè)頸靜脈采血5 mL，-20℃冰箱保存，用于提取伊犁馬基因組DNA，利用終點(diǎn)計(jì)時(shí)器記錄伊犁馬2 000 m比賽成績(jī)。

1.1.2 試劑及儀器

主要試劑：Taq Hot Start Version(TAKARA公司)；10×Buffer I；Bigdye(ABI公司)；Ezup柱式血液基因組DNA抽提試劑盒(上海生工)；dNTP(2.5 mM)；HSTaq；DNA Mark；1.5%瓊脂糖。

主要儀器：臺(tái)式恒溫金屬浴，Centrifuge 5415D離心機(jī)，NAS-99分光光度計(jì)，BC-subMID電泳儀，電泳槽，GeneAmp 9700 PCR儀，3730XL遺傳分析儀。

1.2 方 法

1.2.1 運(yùn)動(dòng)性能數(shù)據(jù)

伊犁馬在2 000 m比賽時(shí)利用終點(diǎn)計(jì)時(shí)器記錄比賽成績(jī)，獲取馬匹運(yùn)動(dòng)性能數(shù)據(jù)。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)

使用Ezup柱式血液基因組DNA抽提式試劑盒提取伊犁馬血液樣本基因組DNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳直接檢測(cè)DNA質(zhì)量，使用Nanodrop2000分光光度計(jì)對(duì)濃度進(jìn)行檢測(cè)，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

參考Genbank中公布的位于第五號(hào)染色體上的純血馬基因序列，以MCT1基因(登錄號(hào)：NC_009148.3)的第2、3外顯子區(qū)域及附近區(qū)域?yàn)闄z測(cè)目標(biāo)，利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物基本信息，引物序列送往天津康普森檢測(cè)檢驗(yàn)有限公司合成。表1

表1 引物信息

1.2.3 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

(1)PCR反應(yīng)體系為20 μL。表2。

(2)列出PCR反應(yīng)條件，將目的片段送往天津康普森檢測(cè)檢驗(yàn)有限公司測(cè)序。表3

1.2.4 生物信息學(xué)

使用在線軟件SOPMA對(duì)錯(cuò)義突變位點(diǎn)不同基因型進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，網(wǎng)址為https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.Pl page=npsa_sopma.html

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用直接測(cè)序進(jìn)行序列分析，利用DNAMAN6.0.3.99官方中文版本進(jìn)行序列比對(duì)，利用Chromas2.3官方版本軟件查看序列峰圖并判定SNP位點(diǎn)，利用在線程序BLAT查找位點(diǎn)信息。

表2 PCR反應(yīng)體系

利用Excel軟件分別計(jì)算不同位點(diǎn)在所測(cè)群體中的基因型頻率、等位基因頻率、群體雜合度(He)、有效等位基因數(shù)(Ne)、多態(tài)性信息含量(PIC)并檢驗(yàn)是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。采用SPSS26.0軟件分析，以MCT1基因不同基因分型為分組依據(jù)，對(duì)MCT1基因不同的基因型與伊犁馬速度性能進(jìn)行One-Way ANOVA方差分析和LSD(Least Significant Difference)多重比較，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

表3 PCR反應(yīng)條件

2 結(jié)果與分析

2.1 不同伊犁馬匹2 000 m比賽速度對(duì)比(表4)

表4 伊犁馬2 000 m比賽速度

2.2 基因測(cè)序

研究表明，在選取伊犁馬MCT1基因第2外顯子上發(fā)現(xiàn)1個(gè)突變位點(diǎn)SNP，但是在第3外顯子上沒(méi)有發(fā)現(xiàn)SNP，利用DNAMAN、Chromas兩者判定SNP位點(diǎn)。

利用BLAT確定SNP位點(diǎn)信息，利用BioXM2.6來(lái)判斷突變類型，MCT1基因在g.52168582T>G處發(fā)生堿基突變，該突變位點(diǎn)使堿基T突變?yōu)閴A基G，該堿基突變導(dǎo)致第六號(hào)位置編碼氨基酸由苯丙氨酸(F)變?yōu)榱涟彼?L)，故此突變位點(diǎn)為錯(cuò)義突變位點(diǎn)，一共包含3種基因型，即TG、TT、GG。圖1

圖1 伊犁馬 MCT1基因第2外顯子SNP位點(diǎn)測(cè)序及基因分型

2.3 伊犁馬MCT1基因的群體遺傳學(xué)結(jié)構(gòu)多樣性

研究表明，根據(jù)EXCELE表格計(jì)算伊犁馬MCT1基因第2外顯子SNP突變位點(diǎn)群體遺傳信息。其中，TT基因型頻率為52%、TG基因型頻率為40%、GG基因型頻率為8%；T等位基因頻率72為%、G等位基因頻率為28%；所以在SNP中TT為優(yōu)勢(shì)基因型，T為優(yōu)勢(shì)等位基因。MCT1基因SNP突變位點(diǎn)多態(tài)信息含量(PIC)為0.287，根據(jù)多態(tài)信息含量分類，故SNP突變位點(diǎn)為中度多態(tài)位點(diǎn)(0.250.05)。

2.4 伊犁馬MCT1不同基因型與速度性能的關(guān)聯(lián)性

研究表明，利用SPSS26.0軟件對(duì)MCT1基因SNP突變位點(diǎn)不同基因型間伊犁馬速度性狀進(jìn)行方差分析。結(jié)果顯示伊犁馬在2 000 m速度賽中MCT1基因該突變位點(diǎn)不同基因型平均速度均有所差異，即GG基因型為11.03 m/s左右，TG基因型為11.72 m/s左右，TT基因型為12.1 m/s左右。伊犁馬在2 000 m速度賽中，TT基因型個(gè)體的平均速度快于GG和TG基因型個(gè)體平均速度，且TT基因型個(gè)體的平均速度顯著快于GG基因型個(gè)體的平均速度(P<0.05)，但與TG基因型個(gè)體的平均速度顯示差異不顯著(P>0.05)；TG基因型個(gè)體平均速度快于GG基因型平均速度，但他們之間顯示差異不顯著(P>0.05)，總體2 000 m平均比賽速度：TT型>TG型>GG型。

2.5 不同基因型所編碼MCT1蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

研究表明，在g.52168582處，T>G為錯(cuò)義突變，由于氨基酸的變化使MCT1蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)夠發(fā)生了改變。β折疊由10.48%變?yōu)?0.79%；α螺旋由27.54%變?yōu)?8.57%；無(wú)規(guī)卷曲度由28.25變?yōu)?7.30；伸展度由33.73%變?yōu)?3.33%。表5，圖2

表5 突變前后蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖2 突變前(a)與突變后(b)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)

3 討 論

3.1 MCT1基因群體遺傳多樣性

MCT家族目前共有14個(gè)成員，其中只有4個(gè)成員(MCT1-MCT4)有實(shí)驗(yàn)證明能夠催化乳酸、丙酮酸和酮體等代謝物上重要的單羧酸鹽的質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)[13]。MCT1在許多組織中表達(dá)，包括肌肉和心臟[14-15]。其主要生理作用是根據(jù)細(xì)胞的代謝狀態(tài)促進(jìn)其進(jìn)入或流出細(xì)胞。在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和腎的近曲小管細(xì)胞中，MCT1可用于將L-乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)到糖異生細(xì)胞中，它是糖異生的主要底物，尤其是在運(yùn)動(dòng)后[13]。

馬匹MCT1基因定位于第5號(hào)染色體上，全長(zhǎng)39 463 bp，一共包含外顯子6個(gè)，內(nèi)含子4個(gè)。本研究通過(guò)PCR并且利用DNA直接測(cè)序法以MCT1基因第2外顯子區(qū)域及其附近區(qū)域?yàn)闄z測(cè)目標(biāo)進(jìn)行序列分析，結(jié)果在伊犁馬MCT1基因第2外顯子上檢測(cè)到1個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，此突變位點(diǎn)在g.52168582處由堿基T突變?yōu)閴A基G，此突變位點(diǎn)為錯(cuò)義突變位點(diǎn)，一共包含3種基因型，即TT、TG、GG，其中TT為優(yōu)勢(shì)基因型，T為優(yōu)勢(shì)等位基因，堿基的突變使得氨基酸在6號(hào)由苯丙氨酸變?yōu)榱涟彼?，?dǎo)致氨基酸的序列發(fā)生改變。根據(jù)群體內(nèi)基因型頻率和等位基因頻率計(jì)算PIC值，若PIC值高于0.5則為高度多態(tài)位點(diǎn)，若PIC值高于0.25且低于0.5則為中度多態(tài)，若PIC值低于0.25則為低度多態(tài)，多態(tài)信息的高低則由其表示。群體內(nèi)遺傳變異大小是通過(guò)有效等位基因數(shù)來(lái)表達(dá)，其反應(yīng)了等位基因在群體內(nèi)的分布程度，雜合度也是群體遺傳變異的參考數(shù)[16-17]。伊犁馬MCT1基因PIC值高于0.25且低于0.5為中度多態(tài)位點(diǎn)，雜合度高，因此可知伊犁馬群體內(nèi)MCT1基因變異程度較大，遺傳多樣性較大，因此具有遺傳選擇的潛力。今后在選育過(guò)程中可有目的進(jìn)行選種育種，加快培育本品種。研究表明伊犁馬MCT1基因第2外顯子上存在多態(tài)位點(diǎn)，可在今后選擇育種的過(guò)程中進(jìn)一步利用。

3.2 伊犁馬MCT1基因多態(tài)性與2 000 m比賽速度關(guān)聯(lián)性

MCT1基因編碼一種蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)在比賽中有助于調(diào)節(jié)肌肉細(xì)胞中厭氧糖酵解產(chǎn)生的乳酸。盡管無(wú)氧糖酵解是產(chǎn)生劇烈運(yùn)動(dòng)和短期運(yùn)動(dòng)所需的ATP的最快途徑，但它也會(huì)導(dǎo)致乳酸在肌肉細(xì)胞中的積累，進(jìn)而導(dǎo)致肌肉疲勞并導(dǎo)致長(zhǎng)距離運(yùn)動(dòng)的表現(xiàn)降低[8,18-19]。MCT1蛋白通過(guò)將乳酸帶入骨骼肌細(xì)胞(用作呼吸燃料)來(lái)幫助維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)，甚至在更長(zhǎng)的距離內(nèi)也可確保有效的代謝[13,20]。在大鼠和人類中，MCT1在慢性運(yùn)動(dòng)和耐力或劇烈性運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練中表達(dá)增加，MCT1基因?qū)\(yùn)動(dòng)性能存在一定的影響。由于MCT1基因在馬的新陳代謝中起關(guān)鍵作用，MCT1基因家族的變體以前也被認(rèn)為對(duì)耐力賽性能很重要[21-22]。

Sawczuk等[12]通過(guò)比較耐力運(yùn)動(dòng)員和短跑或力量運(yùn)動(dòng)員MCT1基因型分布和等位基因頻率，發(fā)現(xiàn)TT基因型與短跑或力量型運(yùn)動(dòng)員狀態(tài)有關(guān)，這與試驗(yàn)中MCT1TT基因型個(gè)體速度快于其它2個(gè)基因型個(gè)體速度相同，說(shuō)明此基因型不管是對(duì)人類還是馬匹都具有一定的影響力。還有學(xué)者研究了健康速步馬和患有肌病的馬MCT1基因中的Lys457GlnSNP，在對(duì)照組中的一匹馬中發(fā)現(xiàn)了AY457175.1：c1573A>C這種多態(tài)性，但未觀察到與乳酸在紅細(xì)胞中的運(yùn)輸相關(guān)[23]。但是，Mykk?nen等[24]在速步馬和芬蘭馬的肌病中研究了相同的基因型，但并未發(fā)現(xiàn)與疾病的關(guān)聯(lián)，證實(shí)了此基因型可能與馬匹疾病并無(wú)相關(guān)性。Koho等[25]分析了速步馬，芬蘭馬，溫血馬和冰島馬的相同的多態(tài)性位點(diǎn)。Regatieri等[21]通過(guò)研究不同品種馬匹MCT1在c1573A>C處多態(tài)性基因型的分布情況發(fā)現(xiàn)，AC基因型只有三匹馬存在突變雜合型AC，因此能確定等位基因?qū)λ芯康鸟R品種的運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)的影響。在今后研究中可以擴(kuò)大測(cè)序范圍、加大樣本量并且加以驗(yàn)證不同基因型對(duì)速度性能的影響。在254匹平地賽阿拉伯馬中，使用PCR-RFLP或PCR-HRM方法對(duì)SNP進(jìn)行了鑒定和基因分型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在研究群體中，短距離比賽僅由TT基因型馬匹獲得名次[18]，與試驗(yàn)伊犁馬MCT1基因中TT基因型的伊犁馬在2 000 m比賽中速度最快的結(jié)果一致，說(shuō)明了MCT1基因中TT基因型可能對(duì)馬匹速度性能產(chǎn)生一定的影響。不同基因型的個(gè)體適于不同距離的比賽，這表明有可能使用MCT1基因中的SNP作為標(biāo)記來(lái)預(yù)測(cè)一匹馬最佳比賽距離[26]，為進(jìn)一步研究以驗(yàn)證MCT1基因作為與比賽性能相關(guān)的潛在標(biāo)志物的使用提供了基礎(chǔ)，并且也通過(guò)基因分型共發(fā)現(xiàn)3種基因型即TT、GG、TG，其中TT基因型個(gè)體的平均速度顯著快于GG基因型個(gè)體平均的速度，與此得出相同的結(jié)果。

4 結(jié) 論

伊犁馬MCT1基因第2外顯子共檢測(cè)到一個(gè)突變位點(diǎn)，該突變位點(diǎn)屬于中度多態(tài)位點(diǎn)，并且處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)；存在3種基因型，在g.52168582T>G處為錯(cuò)義突變，導(dǎo)致其編碼的氨基酸由苯丙氨酸變?yōu)榱涟彼幔沟镁幋aMCT1蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，影響馬匹運(yùn)動(dòng)性能，該突變位點(diǎn)可能是影響馬匹速度性能的重要位點(diǎn)，伊犁馬早期選育過(guò)程中可以有目的針對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行選育。

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