逄成章 劉文彬 金小寶

1廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院（廣州 510006）；2廣東省生物活性藥物研究重點實驗室（廣州 511436）

高尿酸血癥（HUA）是一種由于嘌呤代謝紊亂所引起的血尿酸濃度超出標(biāo)準(zhǔn)范圍的慢性代謝性疾病。研究表明，HUA是引發(fā)痛風(fēng)的重要因素，也可引起冠心?。?］、高血壓［2］、糖尿?。?］。目前 HUA的治療主要包括兩個途徑：一是促進尿酸代謝，此類藥物抑制近端腎小管對尿酸的重吸收而達到促進尿酸外排，如苯溴馬?。?］、丙磺舒［5］等；二是抑制尿酸產(chǎn)生，如黃嘌呤氧化酶抑制劑別嘌呤醇［6］。但上述藥物在使用過程皆伴隨著不同程度的副作用，因此，開發(fā)新型抗尿酸藥物具有重要意義。

新藥開發(fā)是一個耗時、昂貴和有風(fēng)險的過程。近年來許多藥物被批準(zhǔn)用于其他適應(yīng)證［7］，老藥新用策略應(yīng)運而生，即利用目前已知藥物并發(fā)掘活性藥物成分重新治療新的適應(yīng)癥。與傳統(tǒng)新藥研發(fā)相比，基于現(xiàn)有藥物研究的優(yōu)勢，可克服在新藥研發(fā)領(lǐng)域所投入的大量資金、規(guī)避新藥研發(fā)失敗風(fēng)險和減短新藥上市周期等［8］?；虮磉_譜技術(shù)可以通過對比疾病前后基因表達的差異，分析疾病發(fā)病機理和潛在藥物作用靶點，建立“靶點-疾病”間的關(guān)聯(lián)。因此，本研究使用疾病基因表達譜獲得的“靶點-疾病”信息與藥物轉(zhuǎn)錄組獲得的“靶點-藥物”信息進行相關(guān)性分析，預(yù)測潛在的HUA治療藥物，并進行體外細胞實驗驗證，本研究為新型抗HUA藥物的研發(fā)提供一種新的方法和視角。

1 材料與方法

1.1 細胞株來源 人腎小管上皮細胞系HK-2，由廣東省生物活性藥物研究重點實驗室提供，保存于-80℃冰箱。

1.2 試劑與儀器 阿維菌素（Solarbio，批號：No.410BO21）；黃嘌呤氧化酶（XOD）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20220523）；尿酸（UA）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：190706）；腺苷（上海麥克林生化科技有限公司，批號：C13160852）；全自動酶標(biāo)儀ELx800（美國Bio-Tek公司）。

1.3 HUA差異表達基因譜的篩選與分析 通過GEO數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）檢索HUA相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選對HUA基因表達譜芯片。以P＜0.01，logFC≥1或logFC≤-1為篩選條件，利用Bioconductor軟件對差異表達基因進行篩選，使用edge R包繪制差異基因表達熱圖，篩選HUA差異表達基因，建立HUA特征性表達譜并利用STRING平臺（https：//www.string-db.org/）進行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互關(guān)系（protein-protein interaction，PPI）分析，應(yīng)用Cytoscape 3.6.1軟件對差異基因進行PPI網(wǎng)絡(luò)可視化分析與數(shù)據(jù)處理，篩選HUA中的核心基因。將HUA差異基因上傳至DAVID數(shù)據(jù)庫中（https：//david.ncifcrf.gov/），并導(dǎo)入關(guān)鍵靶點蛋白，設(shè)置P＜0.05進行篩選，對交集靶點進行KEGG（https：//www.genome.jp/kegg/）和 GO（http：//geneontology.org/）富集分析。

1.4 CMAP篩選抗HUA治療藥物 使用Connectivity Map數(shù) 據(jù)庫（https：//cmap.ihmc.us）篩 選抗HUA候選藥物，分上調(diào)基因和下調(diào)基因上傳至藥物轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，進行藥物表達譜與疾病表達譜數(shù)據(jù)對比，并采用非參數(shù)Kolmogorov-Smirnov方法處理，獲得負分值藥物，表示對HUA有潛在治療作用，預(yù)測抗HUA藥物。

1.5 候選藥物與核心靶點蛋白分子對接驗證 使用PDB數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org/）下載核心基因靶點蛋白的3D結(jié)構(gòu)；使用Pubchem數(shù)據(jù)庫（http：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載抗HUA活性候選藥物的3D結(jié)構(gòu)；采用chem3D軟件轉(zhuǎn)換為mol2文件，選擇 Swissdock（http：//www.swissdock.ch/docking）平臺進行分子對接，下載對接文件后，采用Chimera1.14軟件進行對接文件的可視化與數(shù)據(jù)分析，記錄各對接靶點的Estimated ΔG值。

1.6 抗HUA候選藥物的細胞毒性和對HK-2HUA細胞模型的影響 取對數(shù)生長期的HK-2細胞，接種于96孔培養(yǎng)板。加入不同濃度的阿維菌素溶液實驗組，將細胞培養(yǎng)24 h和48 h后，分別加入CCK-8試劑，37℃孵育1 h后，酶標(biāo)儀在450 nm處測定吸光度A值，計算細胞活力。取對數(shù)生長期的HK-2細胞，接種于96孔板培養(yǎng)24 h，實驗設(shè)為6個組，陽性藥物對照組加入100 μmol/L別嘌醇溶液，樣品組分別不同濃度的阿維菌素溶液，37℃培養(yǎng)箱孵育24 h。實驗組均用2.5 mmol/L的腺苷孵育30 h后，加入0.005 U/mL的XOD溶液孵育12 h。收集細胞上清液，酶標(biāo)儀檢測細胞上清液中尿酸的含量及XOD活力。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0軟件處理，F(xiàn)方差檢驗后，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，實驗組間差異進行t檢驗分析，P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，*P＜0.05，**P＜0.01。

2 結(jié)果

2.1 HUA差異表達基因譜的篩選 GEO數(shù)據(jù)庫中，獲得基因表達數(shù)據(jù)GSE160170，并通過RMA算法對矩陣數(shù)據(jù)歸一化，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理后GSE160170芯片數(shù)據(jù)集的樣本基因表達均衡，（圖1A）。以P＜0.01，F(xiàn)old change＞1.5為截斷值，Limma分析拆芯片數(shù)據(jù)的差異基因，得到下調(diào)基因810個，上調(diào)基因682個（圖1B）。

圖1 HUA差異基因分析Fig.1 HUA differential gene analysis

2.2 HUA關(guān)鍵基因的篩選 將差異基因上傳至STRING數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建了差異基因的PPI網(wǎng)絡(luò)（圖2A），并在此基礎(chǔ)上了構(gòu)建了核心基因差異基因的PPI網(wǎng)絡(luò)，應(yīng)用Cytoscape軟件對PPI網(wǎng)絡(luò)進行可視化分析，結(jié)果顯示，白細胞介素1β（Interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor，TNF）、趨化因子配體 2（Chemokine Ligand 2，CXCL2）、白細胞介素6（Interleukin-6，IL-6）等可能是HUA發(fā)病中的核心靶點（圖2B）。

圖2 HUA差異基因的PPI網(wǎng)絡(luò)分析Fig.2 PPI network analysis of HUA differential genes

2.3 差異表達基因GO和KEGG富集分析 將生物過程、細胞組成和分子功能顯著的差異基因繪制成柱狀圖，GO分析顯示，共同差異表達基因參與核小體組裝、白細胞趨化性、負調(diào)控細胞群增殖等生物過程；參與核小體、細胞頂端部分、細胞間交流等分子組成；涉及蛋白質(zhì)異二聚化活性、趨化因子活性、C-C趨化因子結(jié)合等分子功能（圖3A）。KEGG共篩選到9條與HUA治療有關(guān)的通路，分析顯示這些差異基因主要涉及HDACS去乙?；M蛋白（HDASC deacetylate histones）、IL-7信號（IL-7）、UB特異性加工蛋白酶（UB-specific processing proteases）等信號通路（圖3B）。

圖3 HUA差異基因的GO和KEGG富集分析Fig.3 GO and KEGG enrichment analysis of HUA differential genes

2.4 CMap藥物轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫預(yù)測HUA治療藥物 通過CMap藥物轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫分析：預(yù)測435個藥物對HUA差異基因進行負調(diào)控，選取負調(diào)控藥物中的前15個藥物進行文獻調(diào)研，有1個為HUA臨床使用藥物，5個為有明確的文獻報道具有降尿酸作用（表1），選擇三種評分較高的藥物阿維菌素、蓽茇酰胺和布地奈德進行體外活性實驗驗證，蓽茇酰胺與布地奈德均無抗HUA活性，阿維菌素在體外模型中具有良好的抑制尿酸生成及抑制XOD酶活性，后續(xù)對阿維菌素進行體外抗HUA細胞模型研究。

表1 CMap藥物轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫對抗HUA藥物的預(yù)測Tab.1 Prediction of anti-HUA drugs from the CMap drug transcriptome database

2.5 候選藥物與核心靶點蛋白分子對接驗證 受體與配體蛋白結(jié)合構(gòu)象越穩(wěn)定則能量越低，越可能發(fā)生相互作用。當(dāng)結(jié)合能絕對值Estimated ΔG大于4.25具有一定活性，大于5.0有較好結(jié)合活性，而大于7.0則具有強結(jié)合活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，阿維菌素與TNF、CXCL2、IL-6和IL-1β的結(jié)合能分別為-7.97、-6.25、-6.73、-7.68 kcal/mol，表明阿維菌素與核心靶點蛋白均有良好的結(jié)合活性（圖4）。

圖4 阿維菌素與HUA核心靶蛋白的分子對接Fig.4 Molecular docking of Avermectin with HUA core target protein

2.6 抗HUA候選藥物的對HK-2的細胞毒性及對HUA細胞模型的影響 在對候選藥物的抗HUA活性驗證中發(fā)現(xiàn)，在藥物濃度為400、200 μg/mL的阿維菌素作用下，對HK-2細胞有較大生長抑制（P＜0.000 1），而在12.5～100 μg/mL范圍內(nèi)對HK-2細胞存活率影響較小（P＞0.05，圖5A、B）。與模型組相比，陽性藥物別嘌醇（allopurinol，ALLO）組細胞上清液中尿酸濃度明顯降低（t=20.44，P＜0.000 1），表明高尿酸細胞模型建立成功，可以用來評價藥物降尿酸活性。與模型組相比，25、50和100 μg/mL阿維菌素可使HK-2細胞上清液尿酸濃度顯著下調(diào)（t=22.04～40.54，P＜0.000 1），且呈濃度依賴性（圖5C）。與模型組相比，25、50和100 μg/mL的阿維菌素都能明顯抑制HK-2細胞XOD活性（t=1.718～31.26，P＜ 0.000 1，圖5D）。

圖5 不同濃度阿維菌素對HK-2細胞活力的影響及對HUA模型上清液UA濃度與XOD活性的影響Fig.5 The effect of different concentrations of abamectin on the viability of HK-2 cells and the effect of UA concentration and XOD activity in the supernatant of HUA model

3 討論

近年來，HUA正在成為一個嚴重的公共衛(wèi)生問題［14］，現(xiàn)有的HUA治療藥物均存在明顯的不足，因此，開發(fā)新型抗HUA藥物具有迫切需求［15］。本研究中對HUA的疾病基因表達譜分析獲得了1492個差異基因，其中下調(diào)基因810個，上調(diào)基因682個。通過CMap藥物轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫分析預(yù)測阿維菌素具有較好的細胞安全性和抑制XOD酶、降低尿酸的作用。基因表達譜技術(shù)與藥物轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫可以連接“疾病-靶點”與“靶點-藥物”之間的信息，有助于精準(zhǔn)的挖掘現(xiàn)有藥物的特定功效，實現(xiàn)高效藥物重定位。如LUO等［16］通過從公共數(shù)據(jù)庫獲得缺血性卒中和正常人群的差異基因，通過CMap預(yù)測發(fā)現(xiàn)木犀草素具有抗缺血性卒中作用，后續(xù)動物模型中證實木犀草素可通過抑制MMP-9和激活PI3K/Akt信號通路發(fā)揮抗缺血性卒中作用。

本研究在差異基因的PPI網(wǎng)絡(luò)中預(yù)測到IL-1β、TNF、CXCL2、IL-6等可能是HUA發(fā)病核心靶點，有研究報道痛風(fēng)急性發(fā)作伴隨著促炎細胞因子IL-1β的分泌，血清中尿酸濃度越高，可能引起IL-1β的分泌增加［17］。TNF信號通路是重要的炎癥信號通路，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)由TNF受體1（TNFR1）和受體2（TNFR2）介導(dǎo)，TNFR2在免疫細胞中表達，它與TNF-α和TNF-β結(jié)合來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)［18］。TNF-α是一種由不同細胞類型產(chǎn)生的促炎細胞因子，如巨噬細胞、淋巴細胞和成纖維細胞等，其中細胞中尿酸可提高TNF-α的含量，進而TNF-α可促進刺激IL-1β的分泌［19］。CXCL2拮抗劑可緩解尿酸誘導(dǎo)的心臟肥大并抑制心臟炎癥和纖維化，CXCL2可能對預(yù)防和治療尿酸誘導(dǎo)的心臟肥大和炎癥反應(yīng)有效［20］。有研究表明與正常人相比HUA患者血清中IL-1β和IL-6水平顯著升高，且具有統(tǒng)計學(xué)意義［21］。以上研究顯示，IL-1β、TNF、CXCL2、IL-6可能是阿維菌素治療HUA的關(guān)鍵靶點。KEGG分析顯示HUA核心靶點主要涉及HDASC deacetylate histones、IL-7、UB-specific processing proteases等信號通路，通過以上生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，治療HUA藥物可能通過多靶點、多通路作用于HUA。

本研究通過分子對接和HUA細胞模型實驗驗證發(fā)現(xiàn)阿維菌素具有降尿酸作用，阿維菌素是由阿維鏈霉菌（Streptomyces avermitilis）產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素［22］。阿維菌素具有良好的殺蟲效果，還具有抗癌［23］、抗病毒［24］、抗真菌［25］等作用。據(jù)報道，阿維菌素在劑量為300 μg/kg，阿維菌素與血漿蛋白結(jié)合，在肝臟中經(jīng)過細胞色素P450系統(tǒng)代謝，幾乎全部通過糞便排出，由于血腦屏障的限制，在大腦中發(fā)現(xiàn)的阿維菌素藥物含量最低，因此阿維菌素對大多數(shù)哺乳動物物種是安全的［26］。本研究首次發(fā)現(xiàn)阿維菌素具有抑制XOD酶活性、降低尿酸的作用，有望成為治療HUA的候選藥物，但阿維菌素抗HUA作用和機制還有待進一步通過動物實驗進行驗證和深入研究。

綜上所述，本文通過HUA疾病基因表達譜和藥物轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)相結(jié)合，連接“靶點-疾病”和“靶點-藥物”信息，從老藥中篩選出具有抗HUA的潛力藥物為阿維菌素，并在體外細胞模型對其抗HUA活性進行了驗證。此研究的開展將有助于提高抗HUA藥物研發(fā)效率，為抗HUA研發(fā)提供一種新思路。