張浩 張鈺 肖世寧 劉家明

1南昌大學第一附屬醫(yī)院骨科（南昌 330006）；2南昌大學第四臨床醫(yī)學院（南昌 330100）；3南昌大學脊柱脊髓研究所（南昌 330006）

3D打印技術起源于20世紀90年代，是一種增材制造（AM）技術，借助計算機輔助設計和計算機輔助制造（CAD/CAM）工具來控制打印物的宏觀形狀和每一分層的細微結構，并結合材料科學和機械制造等技術來選擇打印原材料和設定打印程序［1-2］。該技術具有高度的自由化，不需要特定的工業(yè)模具以及繁雜的工藝，只需要選擇原材料并設計好3D打印機需執(zhí)行的數據模型，就能打印出所設計的三維結構。隨著技術的不斷成熟和完善，3D打印技術目前已被廣泛應用于汽車、航空和醫(yī)療等領域［3］。

在醫(yī)療領域中，靈活便捷的3D打印技術已經在生成骨骼、肌肉等生物結構和人工關節(jié)假體等植入式醫(yī)療器械方面取得了成功，該技術既能保證精準度，又能使物質快速成型，同時保持良好的生物相容性，促進包括脊柱外科治療在內的許多臨床治療開發(fā)出了簡便、高效的新型方案，并在實際應用中取得了良好的成效［4-5］。3D打印技術也為當前難以解決的脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）問題提供了新的思路與方向，利用3D打印技術可以打印出具有精細孔隙結構的仿生脊髓支架填補SCI在損傷部位產生的間隙，通過改善微環(huán)境來促進軸突修復和再生，同時可以搭載相應的干細胞來促進細胞分化并減少炎癥反應［6］。

目前多種3D打印生物支架已被研發(fā)，包括傳統材料支架、新型材料支架和承載細胞的支架等，并通過動物SCI模型進行了實驗研究，驗證了3D打印仿生脊髓支架的對SCI修復的促進作用。本文就近期3D打印仿生脊髓支架的實驗研究進展進行綜述，探究3D打印技術制造的脊髓支架對SCI修復的效果，為臨床上應用3D打印技術解決SCI修復問題提供理論依據和研究方向。

1 3D打印仿生支架在SCI修復中的實驗研究

SCI是指由壓迫、碰撞和撕裂等外界物理因素造成的原發(fā)性損傷，以及損傷后的炎癥反應和血栓形成導致的繼發(fā)性損傷。SCI會引起損傷區(qū)域的微環(huán)境改變，包括瘢痕組織形成、營養(yǎng)因子缺乏和髓鞘蛋白中神經再生抑制因子的表達，這些改變均不利于神經組織的再生修復［7］，如果沒有有效的治療措施介入，SCI后的自我修復將十分困難。目前，治療SCI的主要方法是外科手術減壓和物理固定損傷脊柱，并借助藥物輔助治療［8］，但治療效果往往不夠理想。因此，SCI的科學治療仍是當前研究的熱點問題。3D打印技術可以精準制造出復雜的三維脊髓支架和所需的修復細胞，在SCI動物實驗中取得了理想的效果，為臨床SCI的治療提供了新的思路。

3D生物打印是以生物材料、活性物質與活細胞等作為生物墨水，通過建模軟件設定打印程序后，利用特殊的打印裝置形成具有三維立體結構的類組織體，其過程可分為4個步驟：數據采集、材料選擇、生物打印和功能化［9］。在現有的3D打印技術中，噴墨打印、微擠壓打印、立體光刻和熔融沉積建模等方法在神經組織工程領域的應用越來越受關注。

生物支架是當前治療SCI的熱點方向。3D打印脊髓支架利用膠原蛋白等生物分子材料，并通過掃描脊髓損傷處的結構設計出特異性的脊髓支架模型，從而得到具有滿足植入要求的形狀大小以及完整內部結構的脊髓支架，并且在植入脊髓損傷處時可以判斷方位，精準地與脊髓損傷端相結合［10-11］，有利于損傷區(qū)域的修復再生。軸突再生和損傷區(qū)域的重新連接是SCI修復的前提，并且繼發(fā)性損傷期是治療的關鍵時期［12］。3D打印脊髓仿生支架既可以作為損傷區(qū)軸突再生的接觸引導，也可以作為傳遞干細胞的載體，從而改變不利于神經再生的微環(huán)境［6］。因此，3D打印仿生支架對于繼發(fā)性損傷的治療十分有效，在整體的SCI治療方面具有先天的優(yōu)勢。

當前用于3D打印脊髓支架的原料主要是膠原蛋白，這種材料具有良好的生物相容性，但也有穩(wěn)定性差等局限性。研究者通過用其他材料與膠原蛋白混合作為3D打印的原料，利用各材料的優(yōu)勢互補制作出了具有理想效果的仿生脊髓支架。隨著技術的不斷發(fā)展，越來越多的新型材料被用來作為3D打印脊髓支架的原材料，并在特定情況下結合神經干細胞、特殊的細胞因子等提高支架的應用效果。

2 改良膠原蛋白支架

膠原蛋白是細胞外基質的主要成分，具有低免疫原性和良好的生物相容性，但是熱穩(wěn)定性、力學性能和抗酶性較差。雖然在組織工程中運用較多，但其應用仍受自身性質的約束［13］。將膠原蛋白與其他互補的生物材料相結合，可以得到適合制作脊髓支架的混合材料，很好地改善了傳統支架在應用中遇到的問題。目前對于3D打印制造的改良膠原蛋白支架均在動物實驗中驗證了支架對于SCI修復的促進作用，可以加速SCI后的神經系統重建和神經功能恢復。

2.1 3D打印膠原蛋白/殼聚糖仿生脊髓支架 史新宇等［11］設計將殼聚糖與膠原蛋白結合來彌補膠原蛋白機械性能弱的缺點，利用3D打印技術制造出了膠原蛋白/殼聚糖仿生脊髓支架，并通過實驗觀察該支架對脊髓損傷大鼠的治療作用。結果3D打印膠原/殼聚糖支架組大鼠的BBB評分和斜坡實驗角度均高于其他組，并且運動誘發(fā)電位和體感誘發(fā)電位相比于其他組潛伏期更短、振幅更大，表面運動功能恢復效果優(yōu)于其他組。MRI和彌散張量成像結果也顯示該組大鼠的神經功能恢復良好。朱旭［14］也利用3D打印膠原/殼聚糖支架探索其對脊髓損傷大鼠的治療效果，通過對大鼠的BBB評分和斜板爬壁實驗以及在離體后采用HE染色、Bielschowsky銀染和NF免疫熒光染色方法檢測對比后發(fā)現，各項結果均表明3D打印支架組的大鼠神經組織恢復效果明顯優(yōu)于其他組?？梢?，殼聚糖與膠原蛋白結合具有互補的作用，以二者為原材料利用3D打印技術制造的仿生脊髓支架具有良好的生物相容性和力學性能，對于SCI的修復有明顯的促進作用。

近年來，隨著組織工程學的發(fā)展，生物支架、種子細胞、神經因子三者聯合移植被認為是目前治療SCI的有效療法［15］。生物支架搭載特定神經因子修飾種子細胞，既可以根據特定的損傷情況進行細胞修飾，又能保障種子細胞有適宜的生理環(huán)境發(fā)揮修復作用。神經干細胞（NSCs）具有強大的增殖能力和分化多向性，在神經治療方面有著巨大的潛力，經神經因子修飾的NSCs直接注射至病變處對SCI的修復具有正向促進作用［16］。生物支架可以為細胞提供所需的理想生理環(huán)境，促進NSCs在SCI修復中的分化進程，因此將支架與修飾后的細胞結合是當前的研究熱點［17］。LIU等［18］通過低溫3D打印制造了一種腦源性神經營養(yǎng)因子（BDNF）集成的膠原蛋白/殼聚糖支架，可以延長BDNF在SCI治療中的釋放，在植入SCI大鼠體內后促進了神經纖維再生和突觸連接的建立，增強了損傷部位的髓鞘再生。隋曌等［19］等制備了吸附神經營養(yǎng)素-3（NT-3）的3D打印膠原蛋白/殼聚糖支架，用于SCI大鼠實驗中發(fā)現植入該支架的SCI大鼠在BBB評分、斜坡爬壁實驗和神經纖維再生數量等各項指標中均優(yōu)于對照組，表明該支架對SCI的修復具有良好的促進作用。劉曉云［20］開發(fā)了一種由功能性殼聚糖，透明質酸衍生物和基質膠組成的新型生物相容性生物墨水，這種材料打印的支架可以保持高NSC活力（約95%），并提供良性的微環(huán)境，促進細胞-物質相互作用和神經元分化，以優(yōu)化神經網絡的形成。并且通過大鼠體內實驗證明了該支架可以促進軸突再生，減少神經膠質瘢痕沉積，使大鼠的運動功能恢復顯著。

值得注意的是，除了利用MRI、電生理評分等傳統方法來檢測SCI修復的效果外，FRIEDRICH等［21］利用3D打印技術制造了一種模塊化微流控穩(wěn)態(tài)成像板，并證實了該裝置可以在離散時間段內觀察損傷脊髓的再生過程，這項技術在以后的SCI修復實驗中具有很好的應用前景。

2.2 3D打印膠原蛋白/硫酸肝素仿生脊髓支架

與殼聚糖的作用相似，硫酸肝素與膠原蛋白結合可以彌補膠原蛋白力學性能的不足，并延長降解時間［22］。JIANG等［23］的研究證實，3D打印膠原蛋白/硫酸肝素支架具有良好的力學性能和生物相容性，并且降解速率較慢。張仁坤等［24］借助3D打印機將膠原蛋白和硫酸肝素的結合物制備出了一種具有規(guī)律孔隙的高度仿生神經組織的新型支架材料，將其作為3D打印仿生脊髓支架的原材料具有很好的應用前景。CHEN等［25］觀察3D打印膠原蛋白/硫酸肝素仿生脊髓支架對脊髓損傷大鼠的治療作用，發(fā)現3D打印支架組大鼠的運動功能明顯恢復，并通過電生理檢查發(fā)現支架組的神經絲（NF）大量增多，進一步改善了SCI的病理損傷。張仁坤等［26］將3D打印膠原蛋白/硫酸肝素仿生脊髓支架載NeuroD1修飾的NCSs用于大鼠脊髓損傷的修復，結果顯示支架+NSCs-NeuroD1組的Tarlov和Rivlin評分和各時間段BBB評分均高于其他對照組，并在所有實驗組中運動和感覺潛伏期最短、振幅最大，表明該治療方法可以促進脊髓損傷大鼠的神經修復。

用于SCI修復的NCSs可來源于誘導多能干細胞（iPSCs）［27］，iPSCs是一種由哺乳動物成體細胞經轉入轉錄因子等手段脫分化形成的多功能干細胞，與胚胎干細胞擁有相似的再生能力，可以用來替代一些難以獲得的干細胞進行研究和治療，并且在實際應用中的倫理爭議很小，誘導iPSCs進行定向分化是再生醫(yī)學的熱點研究方向。李長明等［15］利用尿液中的腎小管細胞誘導出了iPSCs，并使其分化為NCSs。之后利用3D打印膠原蛋白/硫酸肝素仿生脊髓支架載iPSCs來源的NSCs進行急性脊髓損傷大鼠的修復，結果顯示iPSCs-NSCs組術后2～8周的BBB評分、神經電生理檢測結果以及術后8周的Tarlov、Rivlin評分均高于模型組和支架模型組。表明3D支架載尿液細胞來源iPSCs-NSCs移植對急性脊髓損傷大鼠的修復具有良好的促進作用。

2.3 3D打印膠原蛋白/絲素蛋白仿生脊髓支架

絲素蛋白是從蠶絲中提取的一種具有良好的力學性能、生物相容性以及低免疫原性的天然生物材料［28］，可與膠原蛋白進行互補共同作為脊髓仿生支架的材料。劉曉銀等［29］為檢驗彌散張量成像與運動功能之間的相關性，利用3D打印膠原蛋白/絲素蛋白仿生脊髓支架對脊髓損傷大鼠進行實驗，并通過BBB評分、斜坡爬壁實驗來檢驗大鼠神經功能恢復的效果。結果顯示，3D打印膠原蛋白/絲素蛋白支架更能促進損傷大鼠運動功能的恢復。JIANG等［30］將3D打印膠原蛋白/絲素蛋白支架與NCSs相結合用于大鼠脊髓損傷的修復，發(fā)現該組大鼠的BBB評分、斜坡爬壁實驗的坡度均高于其他組，并且該組大鼠的脊髓損傷空隙內的填充組織較多，說明支架可促進神經組織的再生修復。LI等［31］利用3D打印技術制造的膠原蛋白/絲素蛋白支架（3D-C/SF）模擬皮質脊髓束，將其與冷凍干燥技術制備的支架（C/SF）分別植入SCI大鼠中進行對比，結果3D-C/SF組在組織學分析中表現出較少的病變和無序結構，并且在病變部位表現出更多的GAP43陽性特征。在單純使用膠原蛋白/絲素蛋白仿生脊髓支架的基礎上，CHEN等［32］將人臍間充質干細胞吸附在支架上共同植入SCI大鼠中觀察療效，通過BBB評分、斜坡爬壁實驗和MRI等指標與對照組相比，結果均提示這種搭載間充質干細胞的新型支架可以促進神經纖維和髓鞘再生，加速損傷部位的突觸連接。

3 新型生物材料支架

3.1 3D打印甲基丙烯酸酐化明膠（GelMA）支架

聚乙二醇（二醇）二丙烯酸酯（PEGDA）是一種親水、有彈性的空白板巖水凝膠，可用于制造各種生物分子。3D打印PEGDA-GelMA支架可改變星形膠質細胞的反應性，使星形膠質細胞的足突平行于支架通道內的再生軸突，并可促進生長，降低損傷區(qū)域的炎癥反應［33］。KOFFLER 等［34］使用微尺度連續(xù)投影打?。é藽PP）的方法制備了3D仿生PEGDA-GelMa支架，用于脊髓損傷再生的研究，支架內具有精確的CNS結構。在實驗中，3D仿生PEGDA-GelMa支架表現出了良好的生物相容性，并且在4周后仍未發(fā)生斷裂或變形，與其他組的生物支架相比具有良好的力學性能。在另一項研究中，ZHU等［35］通過基于立體刻印的生物打印技術制備了PEGDA-GelMa支架，并將NCSs移植到支架上，之后將低水平光療法（LLLT）與該支架進行結合使用，探索細胞后續(xù)的增殖和分化。實驗結果顯示，膠質細胞標記物的表達受到抑制，陽性神經元細胞大量增多，激光刺激細胞中神經元makers基因表達水平上調。表明LLLT與PEGDAGelMa支架相結合對神經組織修復具有顯著的促進作用。

HAMID等［36］利用聚己內酯（PCL）與GelMa結合打印仿生脊髓支架，相比于傳統制造方法，3D打印可以明顯提高該支架的孔隙率。將擬胚體（EB）加入到支架中進行誘導分化實驗，結果顯示分化的EBs中含有βⅢ-微管蛋白陽性神經元，并表現為軸突延伸和細胞遷移，這表明該支架可促進EBs的神經分化，可推動SCI的修復。王鍵豪等［37］探究了3D打印GelMA水凝膠支架聯合骨髓間充質干細胞促進SCI修復的可能性，將支架植入SCI大鼠后與SCI損傷對照組大鼠比較，結果顯示支架組的細胞存活率、再生脊髓組織數目和大鼠BBB評分等指標均高于對照組，表明該支架適宜細胞存活增殖、生物性良好等優(yōu)良特性，可有效促進SCI修復。

3.2 3D打印聚乳酸-羥基乙酸（PLGA）支架 聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）是由乳酸和羥基乙酸隨機聚合而成的一種可降解的功能高分子有機化合物，具有良好的生物相容性，并且沒有毒性。SUN等［38］利用PLGA制造了一種多孔、親水性高和生物降解性良好的仿生脊髓支架，并在該支架上評估雪旺細胞（SC）的發(fā)育情況。結果顯示，SCs在PLGA支架上的發(fā)育增殖良好，作為周圍神經系統中的神經膠質細胞，SCs發(fā)育良好表明該支架可以促進SCs連接和支持各種神經成分，并快速發(fā)揮分配營養(yǎng)物質、參與修復和吞噬的作用，加快了神經損傷的再生修復；GFAP染色、Nissl染色、LFB染色和Bielschowsky銀染也表明PLGA支架可顯著促進脊髓的恢復。KAPLAN等［39］將PLLA和PLGA按1∶1混合后進行3D打印制造出了具有更高的孔隙率和良好的生物相容性的仿生脊髓支架，并將纖維蛋白負載到支架上共同植入大鼠脊髓的損傷處，結果顯示，該支架可以引導軸突再生和突觸形成，為脊髓神經組織再生提供了一個良好的微環(huán)境。

3.3 3D打印海藻酸鈉-基質膠（SA-MA）支架 外胚間充質干細胞（EMSCs）是一種可分化為骨細胞、神經元和膠質細胞的成體干細胞。LI等［40］利用3D打印技術制造了一種海藻酸鈉-基質膠（SA-MA）體外支架，并檢測該支架對EMSCs分化和生長的影響效果。根據Higuchi方程，結合有EMSCs的支架結構具有生長因子BDNF的持續(xù)釋放效應，并且支架上細胞存活率和分化效率均高于二維培養(yǎng)。SA-MA促進EMSCs神經元分化的能力為SCI治療中的神經元再生提供了一種新的生物材料。

3.4 3D打印嗅鞘細胞結合水凝膠支架 許多活細胞，包括雪旺細胞、NSCs和嗅鞘細胞（OECs）等，已被用于促進神經修復再生。OECs是一種終身具有神經再生功能的再生細胞，它與雪旺細胞和膠質細胞在表現型上具有共同點，既存在于中樞神經系統，又存在于周圍神經系統。OECs具有促進軸突生長和神經營養(yǎng)等作用，在神經再生時可以發(fā)揮多種作用，使其成為修復神經時的良好選擇。在3D打印技術中，活細胞可以直接嵌入支架或者混合在打印介質中作為打印原材料。OECs可以透過星形細胞的疤痕，并緩解沿著傷口的神經軸突的生長發(fā)育［41］。OTHON等［42］利用生物激光打印技術（BioLP）在多層水凝膠支架上形成了數條OECs線，發(fā)現結合有打印得到的OECs的脊髓支架可使細胞間的相互作用增加，并使治療藥物集中于移植部位，對于脊髓損傷修復具有良好的促進作用。

3.5 3D打印神經引導導管結合多能間充質基質細胞支架 神經引導導管移植在短間隙缺損病變的治療中具有良好的功能效果，但由于來源有限和傳統制備困難，神經引導導管在長間隙缺損病變中應用十分局限。RODRíGUEZ-SáNCHEZ等［43］制備了3D打印的聚己內酯神經引導導管，并在異源纖維蛋白生物聚合物中嵌入了犬類多能間充質基質細胞作為細胞支架來研究其神經再生作用，通過體外炎癥實驗和植入坐骨神經損傷大鼠實驗發(fā)現了該支架具有支持營養(yǎng)微環(huán)境和促進神經電生理恢復的積極作用，并且在脊髓微環(huán)境中可變?yōu)樯窠洜I養(yǎng)因子介導的促再生狀態(tài)。

3.6 3D打印熱響應聚氨酯（PU）水凝膠支架 聚氨酯（PU）彈性體是一類堅韌柔順的熱塑性彈性體，具有由硬段和軟段組成的線性結構［44］。熱響應性和可生物降解的PU分散體無需交聯劑就可以在37℃附近形成凝膠，將NCSs嵌入在這種凝膠中可作為打印支架的原材料。HSIEH等［45］將嵌有NCSs的PU水凝膠支架用于斑馬魚創(chuàng)傷性腦損傷的實驗研究，該支架促進了斑馬魚的CNS修復，使得創(chuàng)傷性腦損傷的成年斑馬魚的神經功能得以恢復。PU支架具有很強的機械強度、彈性以及支持細胞增殖的能力，使用結晶度較高的PU制成相關的支架，可使支架的降解速率適合纖維環(huán)（AF）的修復再生［46］。PU支架在SCI修復領域具有一定的應用潛力。

4 總結與展望

隨著新型材料的出現和3D打印技術的發(fā)展，以改良膠原蛋白或其他新型材料制造3D打印仿生脊髓支架的動物實驗研究成為了當前SCI修復研究的一個嶄新方向，研究者通過SCI損傷動物模型驗證了這些支架對于促進動物SCI修復的正向促進效果。

目前，3D打印技術在SCI乃至整個醫(yī)學領域的應用越來越廣泛。由于其個體化及精準化的特點，能更好地解決傳統打印支架結構不完善、患者的個性化損傷問題，而且對脊柱外科的術前評估也有很大的幫助。盡管已有多種不同材料制造的3D打印脊髓支架在動物實驗中取得了良好的效果，但對于不同材料制造的支架之間的療效差異的研究還比較缺乏，沒有得到一種公認的最科學有效的打印原材料，并且實驗僅局限于動物，實際的臨床效果仍是未知的。同時3D打印在SCI中的應用同樣受到該技術本身的約束：（1）打印設備和原材料的價格昂貴，使得醫(yī)用應用成本偏高；（2）打印技術不夠成熟，目前不能打印出軟組織附著，如肌肉、血管和神經的走形和分布等；（3）打印的準備周期較長。在脊柱外科應用中，構建所需的組織打印模型以及原材料的選擇與準備均會耗費大量時間，可能會延誤最佳的治療時機［47］。

總之，3D打印的脊髓支架在動物實驗中的理想修復效果為臨床SCI的治療提供了新的思路和方向，今后的研究可以以探究最佳打印原材料和臨床實際應用效果為重心，得出3D打印技術用于促進臨床SCI修復的可行性。雖然該技術僅處于動物實驗階段，尚未轉化為臨床應用，但其應用前景仍十分值得期待。