張 明，馬雅楠(綜述)，劉德敏，甄嚴杰(審校)

(河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院心內一科，河北 石家莊 050000)

鈣化性主動脈瓣膜病(calcific aortic valve disease，CAVD)是繼冠狀動脈粥樣硬化和高血壓之后最常見的一種心血管疾病。隨著主動脈瓣葉纖維鈣化進行性加重，引起瓣葉變形、開閉功能異常，進而導致左心室流出道狹窄和血流動力學紊亂，最終引起暈厥、心肌梗死、心力衰竭等心血管事件的發(fā)生。主動脈瓣主要由瓣膜內皮細胞(valve endothelial cells，VECs)和瓣膜間質細胞(valve interstitial cells，VICs)組成。近年來，隨著影像學和分子生物學的發(fā)展，以往關于認為“CAVD是一種鈣鹽沉積的被動的退行性改變”的觀點逐漸轉化為“CAVD是一種涉及內皮損傷、慢性炎癥、細胞外基質重塑、細胞表型分化及細胞凋亡等復雜病理變化的主動炎癥過程”[1]。流行病學調查顯示，CAVD的患病率隨年齡的增長而增加，并且在65歲以上人群中的患病率高達13%[2]。然而，目前臨床上對于CAVD的治療僅以手術治療為主，并且費用昂貴。當前階段尚無阻止其進展或逆轉鈣化的藥物干預方法。因此，探究CAVD的發(fā)病機制、從病因學上根治CAVD已成為目前學術界的研究熱點。非編碼RNA在過去一直是一個未被探索的領域，最近已經(jīng)成為一個新興的治療靶點。隨著深度測序技術的出現(xiàn)，在過去的二十年里，出現(xiàn)了幾種新的非編碼RNA分子。具有基因調控功能的非編碼RNA包括microRNAs(miRNAs)、長非編碼RNAs(LncRNAs)、環(huán)狀RNAs(CircRNAs)、piRNAs、snoRNAs和snRNAs。miRNAs是目前研究最多的非編碼RNA分子之一，它主要通過與靶基因的3，端非編碼區(qū)結合來調控基因表達。以200多個核苷酸為特征的lncRNAs通過miRNAs直接與蛋白質結合來改變其功能，或作為招募轉錄抑制因子或激活因子的骨架發(fā)揮其基因調控功能[3]。近年來，大量證據(jù)表明，非編碼RNA在主動脈瓣鈣化的發(fā)生和預后中起著重要作用。因此，本文總結了目前對非編碼RNA在主動脈瓣鈣化中作用的認識，希望對該領域的研究策略起到一定的指導作用，并可能為研究人員和臨床醫(yī)生提供更為廣泛的主動脈瓣鈣化相關的生物標記物。

1 參與主動脈瓣鈣化的miRNAs

在退化過程中，主動脈瓣葉變厚和鈣化，導致瓣膜僵硬，運動功能受限。鈣化性主動脈瓣病是世界上最常見的心臟瓣膜病(valvular heart disease，VHD)之一，2017年死亡人數(shù)超過10萬人[4]。一些蛋白編碼基因，如Wnt/β-catenin、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)、Runt相關轉錄因子2(runt-related transcription factor 2，RUNX2)、轉錄因子9(transcription factor 9，SOX9)、Msh同源框2(Msh homeobox 2，MSX2)、磷酸酶、Gla蛋白、蛋白多糖、骨橋蛋白和骨唾液蛋白已被證明在主動脈瓣鈣化病中參與鈣化的調節(jié)[5]。此外，最近正在進行中的幾項研究探索了miRNAs和其他非編碼RNA在主動脈瓣鈣化中的作用。

1.1miR-204與主動脈瓣鈣化 VICs向成骨樣細胞分化是瓣膜鈣化的標志。最近的幾項研究發(fā)現(xiàn)miR-204是主動脈瓣鈣化的主要調節(jié)因子[6-8]。鈣化的人主動脈瓣組織中miR-204的表達低于對照組[6-7,9]。此外，鈣化誘導劑，如轉化生長因子-骨形態(tài)發(fā)生蛋白1(bone morphogenetic protein 1，BMP1)和BMP2，已被證明可以抑制VICs中miR-204的表達[6,9]。與miR-204相比，經(jīng)轉化生長因子-BMP1和骨形態(tài)發(fā)生蛋白2處理的鈣化瓣膜和VICs中miR-486表達上調[7,9]。抑制miR-204可促進轉化生長因子-BMP1和BMP2誘導的VICs向成骨細胞分化，而其過表達則相反[6,9]。miR-204阻斷了VICs中堿性磷酸酶的活性和骨鈣素的表達。在小鼠體內miR-204及其同系物miR-211的缺失導致瓣膜心內膜病[由于機械完整性缺陷引起的瓣膜非炎性進行性(黏液瘤)變性][10]，揭示了其在維持瓣膜正常功能方面不可或缺的作用。所有這些研究都顯示miR-204在成骨過程中起關鍵作用，然而目前仍缺乏主動脈瓣鈣化動物模型的研究。體內過表達miR-204能否逆轉主動脈鈣化，改善瓣膜功能，值得進一步研究。除了瓣膜鈣化，miR-204還被發(fā)現(xiàn)能調節(jié)血管鈣化，表明它是鈣化的關鍵調節(jié)因子和一個可能的新治療靶分子。

1.2miR-214與主動脈瓣鈣化 瓣膜鈣化是不同細胞相互作用的結果，包括炎癥細胞、瓣膜內皮細胞和VICs[11]。業(yè)已證實，miR-214通過調節(jié)這些不同的細胞促進瓣膜鈣化[8,12-14]。在瓣膜鈣化開始的階段，剪切-壓力激活內皮細胞，導致黏附分子激活，巨噬細胞和單核細胞在瓣膜中聚集，進而激活VICs啟動鈣化[11]。在人主動脈鈣化瓣膜和暴露于振蕩刺激下的豬瓣膜中均發(fā)現(xiàn)miR-214表達增高[15-18]。Li等[12]發(fā)現(xiàn)增加的miR-214來自于病變瓣膜中浸潤的巨噬細胞釋放的微泡，這些微泡被VICs攝取。巨噬細胞釋放的微泡增強了VICs的鈣化過程，這表明浸潤的巨噬細胞參與了VICs的成骨激活。在VICs中miR-214表達的增加激活了瓣膜鈣化，增加了炎癥細胞因子的產(chǎn)生，進一步證實了miR-214的促成骨作用。然而，Salim等[15]認為miR-214在豬主動脈瓣膜中具有抗成骨作用。豬主動脈瓣膜在循環(huán)拉伸的條件下1周，miR-214的表達下調。此外，在靜態(tài)條件下，miR-214的表達增加減少了豬主動脈瓣膜中的鈣化，而在循環(huán)拉伸條件下沒有觀察到明顯的變化。同樣，在另一項研究中，miR-214的抑制對振蕩應激誘導的豬主動脈瓣鈣化沒有影響。在這些不同的研究中，miR-214作用的存在上述差異可能是由于體外和體內的模型不同[14]。因此，需要進一步的體內研究來闡明miR-214的促/抗成骨作用。

1.3miR-195與主動脈瓣鈣化 Von Willebrand因子(von Willebrand factor，vWF)是一種多聚體血漿蛋白，通常參與血液穩(wěn)態(tài)，由內皮細胞和巨核細胞分泌[16]。在主動脈狹窄瓣膜中，尤其是鈣化區(qū)域周圍的巨噬細胞和肌成纖維細胞內，vWF的表達水平顯著升高。vWF基因在止血和血栓形成中激活p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinasem,p38-MAPK)信號通路，從而促進VICs成骨分化和鈣化的形成。此外，基因芯片分析表明vWF是miR195的潛在靶基因。Yang等[17]研究發(fā)現(xiàn)，修復miR-195可能減緩主動脈瓣鈣化的發(fā)生和發(fā)展。由于上調miR-195可能通過抑制vWF和激活p38-MAPK信號通路，降低ALP活性和鈣化沉積，降低Runx2、OCN和ALP的mRNA和蛋白水平，從而改善體外培養(yǎng)的主動脈瓣鈣化。因此，miR-195提供了一種治療CAVD患者主動脈瓣鈣化的新方法。

1.4miR-34a與主動脈瓣鈣化 Toshima等[18]的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-34a在鈣化性主動脈瓣狹窄(calcific aortic valve stenosis，CAVS)的人體標本中的表達增加。MIR-34a通過調節(jié)Notch1-Runx2信號通路，上調Runx2的表達促進成骨分化，另外作者在體外實驗中，利用豬主動脈瓣間質細胞進一步證明了上述結論。因此，抑制MIR-34a表達是CAVS的潛在治療靶點。

1.5miR-30b與主動脈瓣鈣化 端粒細胞(telocytes，TCS)是一種新型的間質細胞，在人類心臟中，TCS廣泛存在于心外膜、心肌間質和主動脈瓣中，它們有助于調節(jié)心臟的穩(wěn)態(tài)和再生[19]。TCS通過釋放細胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)或非典型連接形成心臟網(wǎng)絡，在正?；蚣膊⌒呐K中參與長距離的細胞間信號協(xié)調。在Yang等[20]的研究中，提取并鑒定了TC-EVS，并建立了CAVD小鼠模型。結果發(fā)現(xiàn)模型組小鼠鈣化瓣膜中Runx2、骨鈣素和caspase-3的表達明顯高于EV治療組小鼠，表明TC-EVS治療可減少主動脈瓣鈣化，減輕VICs細胞凋亡。并且，實驗進一步證明，TC-EVS可被VICS吸收，經(jīng)EV處理后，鈣化瓣膜組織中miR-30b的表達顯著增加。因此表明，在主動脈瓣鈣化過程中，細胞外小泡是miR-30b的通訊媒介，最終實驗結果表明，TC-EVs通過miR-30b/Runx2/Wnt/β-catenin軸在主動脈瓣鈣化中起保護作用。

1.6miR-29b與主動脈瓣鈣化 miR-29b是人主動脈瓣間質細胞鈣化的內源性正性調節(jié)因子，在成骨細胞分化過程中，miR-29b的表達顯著增加，進而引起TGF-β3的表達顯著下調，而Smad3，Runx2，wnt3和β-catenin則顯著上調。因此，抑制CAVD大鼠中miR-29b的表達可以達到防止血管和瓣膜鈣化的作用。由此表明，miR-29b通過激活wnt3/β-catenin/Smad3信號傳導抑制TGF-β3，從而促進人主動脈瓣間質鈣化[21]。

1.7miR-139-5p與主動脈瓣鈣化 Zhang等[22]的研究顯示，miR-139-5p的表達水平與成骨基因RUNX2呈負相關，并且miR-139-5p在原代培養(yǎng)的人主動脈瓣間質細胞成骨分化過程中也下調。隨后的功能研究表明，miR-139-5p過表達通過負性調控促成骨基因FZD4(編碼Frizzled4受體亞型)和CTNNB1(編碼β-catenin基因)的表達，F(xiàn)ZD4和CTNNB1驅動Wnt/β-catenin信號通路表達[23]，從而抑制VIC的成骨分化。以上結果提示，miR-139-5p通過Wnt/β-catenin途徑在血管內皮細胞成骨分化中起重要作用。

2 鈣化性主動脈瓣病患者循環(huán)中的miRNAs

細胞外間隙中miRNAs的存在表明它可能是一種用于診斷和預后的非侵入性生物標志物。R?sj?等[24]測量了57例主動脈狹窄患者和10名對照組受試者的循環(huán)血清miR-210水平。結果顯示主動脈狹窄組的miR-210水平顯著高于對照組；然而，在區(qū)分主動脈狹窄與健康受試者方面，miR-210水平顯示出了與NT-proBNP相似的診斷能力。miR-210預測全因病死率的準確性與NT-proBNP相似[24]。因此，循環(huán)miR-210在主動脈狹窄患者中水平升高沒有太大的診斷價值，因為它沒有表現(xiàn)出比現(xiàn)有的生物標志物如NT-proBNP的優(yōu)勢。然而，NT-proBNP和miR-210聯(lián)合診斷和判斷預后的價值如何，需要未來的研究去探索。經(jīng)導管主動脈瓣膜置換術是行外科手術高?；颊哌M行瓣膜置換的良好選擇，但目前尚無生物標志物可以預測它的長期臨床療效。Kleeberger等[25]報道術前miR-206水平與經(jīng)導管主動脈瓣膜置換術后3個月隨訪的射血分數(shù)直接相關。此外，在術后1 d的miR-206水平與左心室射血分數(shù)呈顯著的負相關。因此，循環(huán)中的miR-206水平可能可以預測經(jīng)導管主動脈瓣膜置換術的預后，但這需要后續(xù)更進一步的隊列研究來證實。

3 LncRNAs在主動脈瓣鈣化中的作用

LncRNAs是一類長度超過200個核苷酸的非編碼RNA。越來越多的證據(jù)表明，LncRNAs在各種病理和生理過程中發(fā)揮著重要作用。Hadji等[9]對鈣化的和健康的主動脈瓣進行RNA測序，發(fā)現(xiàn)在鈣化的主動脈瓣中LncRNAs H19的表達上調。在更大的臨床隊列研究中證實，H19在鈣化的主動脈瓣中增加了7.5倍。值得注意的是，H19在硬化和增厚的瓣膜中也被發(fā)現(xiàn)增加了3.3倍，這些瓣膜處于疾病的早期[9]。此外，在主動脈狹窄進展較快的患者中發(fā)現(xiàn)有較高的H19表達[9]。H19的這種增加是由于其啟動子的CpG甲基化減少。從功能上講，人VICs中H19的沉默抑制了成骨基因骨鈣素、BMP2和RUNX2的表達，并減少了鈣沉積，表明H19是一種促成骨因子。因此，H19在瓣膜鈣化過程中是漸進性增加的，它在人主動脈瓣鈣化過程中起著一定的作用。最近Vander Roest等[26]報道，在衰老過程中，小鼠主動脈瓣的H19水平?jīng)]有增加。在退行性主動脈瓣鈣化患者和VICs成骨誘導后，LncRNAs AFAP1-AS1的表達均增加。此外，AFAP1-AS1不僅可以通過調節(jié)miR-155/Smad5軸促進人主動脈瓣間質細胞向成骨細胞分化[27]，還可以促進巨噬細胞M1極化，并通過巨噬細胞分泌的炎癥因子(如腫瘤壞死因子α和白細胞介素6)促進VIC成骨分化和瓣膜鈣化[28]。另外有研究表明，成骨誘導后在人主動脈VICs中觀察到LncRNAs OIP5-AS1表達下調。體外實驗則證實OIP5-AS1同樣能抑制成骨分化[29]。

4 CircRNAs在主動脈瓣鈣化中的作用

環(huán)狀RNA(CircRNAs)是由內源RNA拼接的真核生物，由于CircRNAs呈環(huán)狀，在體液中高度穩(wěn)定、保守和豐富，使其成為未來診斷生物標志物的理想候選者[30]。最近的報道顯示，某些類型的CircRNA參與許多細胞生理過程，包括調節(jié)細胞的成骨分化[30]。作為表觀遺傳學的重要調控機制，大規(guī)模的Cerna串擾CircRNAs-miRNAs-mRNAs網(wǎng)絡已被廣泛認可。并且，越來越多的證據(jù)表明一些CircRNA與miRNAs相互作用以發(fā)揮其成骨作用[30-31]。CircRNAs作為競爭性內源性RNAs(CeRNAs)，在細胞分化過程中調節(jié)miRNAs對其靶基因的影響[31]。Yin等[32]發(fā)現(xiàn)CircRUNX2可以海綿miR-203并增強RUNX2的表達，從而預防骨質疏松(osteoporosis，OP)，表現(xiàn)為RUNX2、OPN等成骨分化相關蛋白的表達增加。越來越多證據(jù)表明，circRNA轉化生長因子β受體2(transforming growth factor beta receptors II，TGFBR2)在不同的生理或病理過程中發(fā)揮重要作用[33-34]。不僅如此，CircRNAs在主動脈瓣鈣化的發(fā)展中也發(fā)揮關鍵作用。在Yu等[33]的實驗表明，TGFBR2通過抑制miR-25-3p的表達，促進Twist1的表達，TWIST1是骨組織形成的重要負調節(jié)因子，在心臟和瓣膜心臟的發(fā)育中起著關鍵作用[34]。Twist1高表達可以通過抑制ALP活性、鈣化結節(jié)形成以及RUNX2和OPN的表達，負向調節(jié)人主動脈VIC的成骨細胞轉分化[35]。TGFBR2通過吸收miRNA-25-3p調節(jié)Twist1的表達而抑制人主動脈VIC的成骨細胞分化。以上結果表明TGFBR2可能成為治療鈣化主動脈瓣病的新的理論基礎。另有研究表明，Wang等[36]表明，褪黑激素通過調節(jié)瓣膜間質細胞中的環(huán)狀RNA CircRIC3/miR-204-5p/DPP4信號傳導來改善主動脈瓣鈣化。但是，單個CircRNA可以通過在細胞質中聚集多個miRNAs來調節(jié)基因的表達，CircRIC3是否會吞噬其他參與主動脈瓣鈣化的miRNAs仍有待研究。

5 小 結

既往研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)若干非編碼RNA分子在主動脈瓣鈣化生物學中均發(fā)揮關鍵作用；然而，到目前為止大多數(shù)研究都是初步的，因此有必要進行深入的研究，以更好地闡明它們的作用，并將其開發(fā)為治療和診斷試劑。例如，miRNAs中的miR-210和miR-206在主動脈瓣鈣化中顯示出較高的診斷和預后價值，但這些研究是在較少的患者中進行的，尚需要進一步進行較大規(guī)模的多中心試驗。其他非編碼RNA，如LncRNAs、CircRNAs，在瓣膜生物學方面的研究要少得多。因此，目前需要更多的探索來發(fā)現(xiàn)新的非編碼RNA分子，這些分子可能對主動脈瓣鈣化的治療和診斷有深遠的意義。