陳盼盼，傅春林，馮駿超，馬楠，劉玉龍

(1.96603部隊(duì)醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖南 懷化，418000； 2.蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院，江蘇 蘇州，215004)

外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)及標(biāo)本制片技術(shù)是輻射細(xì)胞遺傳學(xué)的重要實(shí)驗(yàn)步驟。細(xì)胞培養(yǎng)程序簡(jiǎn)單，但要求嚴(yán)謹(jǐn)，要使細(xì)胞在體外長(zhǎng)期生存，必須模擬體內(nèi)環(huán)境，供給細(xì)胞存活所必需的條件。培養(yǎng)后的淋巴細(xì)胞要經(jīng)過(guò)低滲、固定、制片、染色等步驟才能進(jìn)行染色體畸變的分析。其過(guò)程對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境的溫濕度、試劑的質(zhì)量和配比、技術(shù)人員的操作水平都有一定要求。本文結(jié)合實(shí)踐工作，介紹了淋巴細(xì)胞染色體畸變類(lèi)型、染色體標(biāo)本操作流程及常見(jiàn)問(wèn)題。

1 染色體畸變

染色體畸變是指染色體在受到物理、化學(xué)及生物因素影響后發(fā)生的數(shù)目和結(jié)構(gòu)的改變，包括染色體結(jié)構(gòu)畸變和數(shù)目異常，前者又可分為染色單體型畸變和染色體型畸變。染色單體型畸變主要有單體裂隙、單體斷裂、單體缺失、單體互換等。染色體型畸變主要包括雙著絲粒或多著絲粒體(dic)、著絲粒環(huán)(r)、無(wú)著絲粒環(huán)(ar)、無(wú)著絲粒斷片(f)、微小體(min)、相互易位(t)、倒位(inv)和缺失(del)，其中ar、f和min統(tǒng)稱(chēng)為無(wú)著絲粒體(ace)，在上述畸變中除del和f為電離輻射一次擊中外，其他畸變均為2次或2次以上擊中。按照染色體型畸變?cè)隗w內(nèi)的轉(zhuǎn)歸，又可將上述這些畸變分為非穩(wěn)定性染色體畸變和穩(wěn)定性染色體畸變，前者在細(xì)胞分裂的后期會(huì)形成染色體橋引起細(xì)胞死亡(dic、r)或因沒(méi)有著絲粒結(jié)構(gòu)隨細(xì)胞分裂丟失(ace)故稱(chēng)非穩(wěn)定性畸變，后者(t、inv和del)在細(xì)胞分裂中不存在力學(xué)障礙，細(xì)胞分裂不受影響可在體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間存在故稱(chēng)為穩(wěn)定性畸變[1]。在放射工作人員職業(yè)健康檢查和生物劑量估算中，主要分析受檢者的外周血淋巴細(xì)胞染色體型畸變，利用雙著絲粒染色體(dic)指標(biāo)估算生物劑量也是迄今為止唯一得到國(guó)際學(xué)界認(rèn)可的“金標(biāo)準(zhǔn)”[2]。

2 標(biāo)本制備流程解析

外周血中小淋巴細(xì)胞幾乎都處在細(xì)胞增殖周期的G1期或G0期(不同于體外培養(yǎng)的體細(xì)胞)，一般條件下是不會(huì)再分裂的。當(dāng)在培養(yǎng)物中加入適量的植物血凝素(PHA)，37 ℃培養(yǎng)52～72 h后，淋巴細(xì)胞開(kāi)始轉(zhuǎn)化，進(jìn)入細(xì)胞增殖周期，此時(shí)可獲得大量的有絲分裂細(xì)胞。再經(jīng)過(guò)秋水仙素的處理、低滲、固定，即可在顯微鏡下觀察到良好的中期染色體分裂相[3]。

2.1 血樣采集

采集受檢者靜脈血約2 mL注入肝素抗凝管內(nèi)，顛倒混勻。

解析：適量的肝素抗凝劑不會(huì)影響細(xì)胞在體外的生長(zhǎng)和染色體收獲，而其它抗凝劑如EDTA一般會(huì)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)[2]。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將采集的靜脈血取0.3～0.5 mL，加入配制好的5 mL RPMI-1640培養(yǎng)基[4]中混勻，在培養(yǎng)瓶上標(biāo)注培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)間和日期。每人接種兩瓶，以防細(xì)胞量不夠。如果懷疑受照人員可適當(dāng)增加接種數(shù)量。在培養(yǎng)開(kāi)始前每瓶培養(yǎng)基內(nèi)加入終濃度為0.04 μg/mL的秋水仙素，放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～52 h后收獲細(xì)胞[1]。

解析：秋水仙素就是秋水仙堿，是一種生物堿。純秋水仙素呈黃色針狀結(jié)晶，熔點(diǎn)157 ℃。易溶于水、乙醇和氯仿。味苦，有毒。秋水仙素能抑制有絲分裂，破壞紡錘體，使染色體停滯在細(xì)胞分裂的中期[5]。在染色體畸變分析中，要求加入秋水仙素的終濃度可以使99%以上的有絲分裂相為第一次有絲分裂細(xì)胞，才可使非穩(wěn)定性染色體畸變的丟失不會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。

2.3 染色體標(biāo)本制備

2.3.1低滲

將已到培養(yǎng)時(shí)間的培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱中取出，用吸管棄掉上清液，加入8 mL經(jīng)37 ℃預(yù)熱的0.075 mol/L氯化鉀低滲液,將細(xì)胞團(tuán)塊充分打勻后轉(zhuǎn)移至10 mL的尖底離心管內(nèi)，放入37 ℃恒溫水浴箱中低滲20～30 min。

解析：低滲液是指滲透壓和離子強(qiáng)度均低于正常細(xì)胞生理?xiàng)l件的溶液，與培養(yǎng)的外周血混合后水分子進(jìn)入血細(xì)胞內(nèi)，使淋巴細(xì)胞質(zhì)膜膨脹，紅細(xì)胞膜破裂，經(jīng)離心后棄掉上清液完成低滲。一般選用0.075 mol/L氯化鉀作為低滲液，其優(yōu)點(diǎn)有：①染色體輪廓清楚，可染色性強(qiáng)，染色時(shí)間短；②用于顯帶染色時(shí)能充分顯示帶型特點(diǎn)；③37 ℃低滲處理20～30 min，可提高淋巴細(xì)胞膜通透性及誘導(dǎo)細(xì)胞脹大，去除其中的紅細(xì)胞碎片和一部分細(xì)胞雜質(zhì)[6]。

2.3.2預(yù)固定

從37 ℃恒溫水浴箱中取出低滲完的離心管，每管加入1～2 mL新配制的固定液(甲醇∶冰乙酸=3∶1)，用潔凈吸管輕輕吹打混勻后，水平離心機(jī)1 000～1 500 r/min，離心8～10 min。

解析：固定液的重要特性是能迅速穿透細(xì)胞，將其固定并維持染色體結(jié)構(gòu)的完整性，還能夠增強(qiáng)染色體的嗜堿性，達(dá)到優(yōu)良染色效果。甲醇和冰乙酸都具有揮發(fā)性，長(zhǎng)時(shí)間放置會(huì)影響固定效果，每次使用前需要臨時(shí)配制固定液。經(jīng)固定處理的細(xì)胞懸液滴在載玻片表面干燥后，染色體會(huì)牢牢的粘在載玻片表面，在后期的染色過(guò)程中也不會(huì)脫落，也不會(huì)改變?nèi)旧w的分散程度。

2.3.3第一次固定

取出離心管，棄掉上清液，沿管壁往每個(gè)離心管內(nèi)加入8 mL固定液，用吸管快速吹打細(xì)胞團(tuán)塊使之混勻，常溫下固定20～30 min。然后在水平離心機(jī)中1 000～1 500 r/min，離心8 min。

2.3.4第二次固定

取出離心管，重復(fù)第一次固定操作，如二次固定完細(xì)胞團(tuán)顏色較深可以再重復(fù)固定1次，直到細(xì)胞懸液為淡白色狀。

2.3.5制片

取出離心管，棄掉上清液，根據(jù)細(xì)胞團(tuán)塊大小每離心管內(nèi)加入3～5滴固定液以調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度，然后以一定高度(10～30 cm)將細(xì)胞懸液滴在30～45度角斜面放置(傾角過(guò)大會(huì)損失很多細(xì)胞，一般是手持載玻片以水平或一定傾角滴片)，4 ℃預(yù)冷的潔凈載玻片上。每張玻片滴2～3滴，對(duì)滴好的玻片逐一核對(duì)編號(hào)，室溫放置自然干燥，做好記錄。

解析：細(xì)胞懸液以一定高度滴在載玻片上，細(xì)胞懸液在載玻片表面沿長(zhǎng)軸方向由一端流向另一端。在表面張力的作用下細(xì)胞變扁，中期細(xì)胞內(nèi)的染色體變得靠近細(xì)胞膜上下表面，遇冷細(xì)胞膜更容易破裂。隨著細(xì)胞在載玻片表面流動(dòng)，固定液的進(jìn)一步揮發(fā)，細(xì)胞破裂，染色體從中期細(xì)胞中釋放出來(lái)[7]。

2.3.6染色

將pH6.8的磷酸緩沖液與吉姆薩(Giemsa)原液混合，配制成10%的吉姆薩磷酸鹽染液(pH6.8磷酸緩沖液：吉姆薩(Giemsa)原液=9∶1)，染色8～10 min，以一定傾斜角度用自來(lái)水輕輕從玻片長(zhǎng)軸沖洗，洗掉染液后置于玻片架上室溫自然晾干。

解析：pH6.8的磷酸緩沖液，用于調(diào)節(jié)pH值。吉姆薩染液為天青色素、伊紅、次甲藍(lán)的混合物，可將細(xì)胞核染成紫紅色或藍(lán)紫色，胞漿成粉紅色，在光鏡下呈現(xiàn)出清晰的細(xì)胞染色體圖像[6]。

3 染色體標(biāo)本制備中常見(jiàn)問(wèn)題

當(dāng)輻射遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室遇到技術(shù)問(wèn)題時(shí)，首先要確定問(wèn)題可能發(fā)生在哪個(gè)階段，確定解決問(wèn)題的方向，再進(jìn)行下一步的分析和檢測(cè)，以最快的速度發(fā)現(xiàn)問(wèn)題和解決問(wèn)題。如何盡可能地避免問(wèn)題的發(fā)生，可以從以下幾個(gè)方面進(jìn)行考慮。

(1)需建立完整的實(shí)驗(yàn)室工作流程、規(guī)章制度和標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程。不擅自改變已有的實(shí)驗(yàn)條件，詳細(xì)認(rèn)真地對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程進(jìn)行記錄。

(2)有條件的實(shí)驗(yàn)室建立和應(yīng)用細(xì)胞遺傳學(xué)信息化系統(tǒng)，對(duì)實(shí)驗(yàn)和分析全流程進(jìn)行信息記錄和過(guò)程監(jiān)控，保證樣品處理和分析過(guò)程有可溯源性。

(3)輻射遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室盡可能使用有質(zhì)量保障的試劑和耗材，定期清點(diǎn)耗材，應(yīng)用耗材出入庫(kù)系統(tǒng)。對(duì)新批次的試劑和耗材進(jìn)行嚴(yán)格的驗(yàn)證測(cè)試，使用質(zhì)量合格的產(chǎn)品。

(4)實(shí)驗(yàn)室之間經(jīng)常進(jìn)行技術(shù)交流，參與線(xiàn)上線(xiàn)下的交流會(huì)，必要時(shí)派遣人員外出進(jìn)修學(xué)習(xí)，總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，提高人員水平。

(5)定期對(duì)實(shí)驗(yàn)室的儀器進(jìn)行計(jì)量校正，儀器進(jìn)行定期保養(yǎng)維護(hù)，保證其使用過(guò)程中的穩(wěn)定性。

染色體標(biāo)本制備中常見(jiàn)問(wèn)題列于表1。

4 結(jié)論

染色體標(biāo)本制備步驟多且復(fù)雜，整個(gè)試驗(yàn)的周期較長(zhǎng)，環(huán)節(jié)較多，操作繁瑣，易受實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度、濕度的影響。輻射遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室在日常的染色體畸變分析中常常會(huì)遇到各種各樣的問(wèn)題。無(wú)法快速和高效的解決遇到的問(wèn)題，會(huì)給輻射遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室的日常工作帶來(lái)很大的麻煩。了解試驗(yàn)的本質(zhì)，能更好的面對(duì)試驗(yàn)中出現(xiàn)的各種問(wèn)題，解決問(wèn)題，保證分析結(jié)果的可靠性。